Estudio de la regeneración de conexiones funcionales entre cortes de médula espinal utilizando una guía de electrodos múltiples

Coloque una matriz de electrodos múltiples, o MEA, en una placa de Petri debajo de un microscopio estereoscópico. El MEA consta de electrodos dispuestos en una cuadrícula con dos zonas separadas.

Agregue una gota de plasma sanguíneo al MEA. Coloque dos cortes de médula espinal obtenidos de embriones de rata, con sus lados ventrales uno frente al otro.

Introducir una solución de trombina, mezclarla con el plasma e incubar. La trombina provoca la coagulación del plasma, creando un andamio biológico que facilita la adhesión de las rodajas en el MEA.

Añadir un medio nutritivo e incubar bajo agitación, favoreciendo la formación de conexiones celulares entre las rodajas y provocando su fusión.

Bajo el microscopio estereoscópico, introduzca una lesión cortando las conexiones de tejido entre las rodajas. Agregue un medio nutritivo e incube.

Durante la incubación, las neuronas crecen a través de la lesión para conectar los cortes.

Usando una cámara de registro, registre la actividad eléctrica de ambos cortes de la médula espinal para evaluar sus conexiones funcionales regeneradas.

Coloque una placa de Petri con una matriz de microelectrodos recubierta en el interior, bajo un microscopio estereoscópico. Enfoca la matriz y centra una gota de plasma de pollo de 6 microlitros en la matriz de electrodos. Con una espátula pequeña, deslice con cuidado dos secciones de la médula espinal con sus lados ventrales uno frente al otro en la gota de plasma.

A continuación, agregue 8 microlitros de trombina alrededor de la gota de plasma de pollo. Luego, use la punta de la pipeta para mezclar y esparcir cuidadosamente la mezcla de plasma de pollo y trombina. Justo antes de que la mezcla de plasma de pollo y trombina se vuelva demasiado fibrosa y comience a coagularse, aspire el exceso de líquido. Luego, tape la placa de Petri y colóquela en una cámara humidificada. Coloque la cámara dentro de una incubadora a 37 grados centígrados durante aproximadamente una hora.

Después de la incubación, agregue cuidadosamente 10 microlitros de medio nutritivo a la muestra. Tape la placa de Petri y vuelva a colocarla en la incubadora durante 45 minutos más. A continuación, coloque cada uno de los conjuntos de cultivo de matriz de electrodos múltiples en un tubo de rodillo y agregue 3 mililitros de medio nutritivo. Cierre bien la tapa y coloque el tubo de rodillo en el tambor de rodillos. Gire el tambor a 1 a 2 RPM en la incubadora a 37 grados centígrados.

Con unas pinzas estériles con punta de goma, retire los conjuntos de cultivo de matriz de electrodos múltiples del tubo de rodillo y colóquelos en una placa de Petri bajo un microscopio estereoscópico. Enfoca el pañuelo y verifica que las dos rodajas estén fusionadas.

A continuación, mantenga el conjunto firme y coloque una hoja de bisturí en la ranura de la matriz de electrodos múltiples cerca de las rodajas de tejido. Sostenga el bisturí en posición horizontal y luego levante el mango del bisturí, pero deje que la hoja del bisturí permanezca en la ranura de la matriz de tal manera que la hoja ruede desde la base hasta la punta, cortando el tejido que cubre la ranura. Corta cualquier conexión de tejido residual con una punta de aguja de calibre 25 si es necesario. Trabaje solo en el área dentro de la ranura y no toque los bordes sensibles.

Vuelva a colocar los conjuntos de cultivo de matriz de electrodos múltiples en el tubo de rodillo y agregue 3 mililitros de medio nutritivo fresco a los cultivos. Luego, vuelva a colocar el tubo de rodillo en el tambor de rodillos de la incubadora a 37 grados centígrados.

Monte un conjunto de cultivo de matriz de electrodos múltiples en una cámara de registro y aplique aproximadamente 500 microlitros de solución extracelular a la matriz. Luego, monte el ensamblaje en el microscopio. Espere 10 minutos para que el sistema se estabilice y luego registre la actividad espontánea básica de cada uno de los electrodos de detección de actividad durante 10 minutos.