Microfabricated Post-Array-detectores (mPADs): un enfoque para aislar las fuerzas mecánicas

Hola, soy Nathan Snia Decky y hoy me acompañan Wes Ligan, Robbie Desai y Mike Yang. Y somos del laboratorio de Chris Chen aquí en la Universidad de Pensilvania. En este video presentaremos nuestro enfoque para medir las fuerzas de atracción celular utilizando una matriz micro fabricada de postes.

Las fuerzas de tracción se generan a través de las interacciones de la miosina y el actón y juegan un papel importante en nuestra fisiología. Durante el desarrollo, permiten que las células se muevan de un lugar a otro para formar las primeras estructuras de nuestro tejido. Y también ayudan en el proceso de cicatrización, ya que son necesarios para el cierre de heridas o la migración y arrastre de leucocitos por nuestro cuerpo.

Pero, por desgracia, estas mismas fuerzas pueden ser perjudiciales para nuestra salud en el caso de cáncer, metástasis o crecimiento vascular hacia un tumor. Por lo tanto, hay muy pocos métodos en los que se puedan medir realmente estas fuerzas de tracción de forma cuantitativa, y especialmente a micro y nanoescala de células individuales. La mayoría de los métodos comunes para estudiar células in vitro han sido con placas con fondo de vidrio o placas de poliestireno, pero estos son sustratos muy rígidos y no lo son, no nos permiten medir físicamente las fuerzas de tracción y las difamaciones que causa una célula.

Por lo tanto, ha sido muy difícil comprender los mecanismos subyacentes de las fuerzas de tracción sin algún tipo de lectura física. Y así, en el laboratorio de Chris Chen tenemos una técnica que nos permite superar estas limitaciones. Nuestro método se basa en una matriz vertical de voladizos flexibles, cuya rigidez y escala de tamaño son tales que las células individuales se extenderán a través de múltiples voladizos y las desviarán en el proceso.

Las dimensiones que utilizamos con mayor frecuencia son tres micras de diámetro, postes cilíndricos de diámetro, 10 micras de altura con un espaciado de centro a centro de nueve micras y una matriz rectangular. Sin embargo, estas dimensiones pueden variarse para adaptarse a una variedad de estudios celulares. Comenzamos con un maestro de silicio rígido que puedes ver aquí y luego lo traducimos en voladizos PDMS flexibles que vemos aquí.

Con esta técnica podemos medir las deflexiones de los voladizos individuales bajo un microscopio y retroceder las fuerzas de tracción celular con la magnitud y dirección requeridas para generar tales deflexiones. Hemos convertido estos sustratos en almohadillas M para detectores de micro postes y en este vídeo te mostraremos cómo fabricar las almohadillas M, empezando por el maestro de silicona pasando por la replicación de PDMS, y finalmente hasta el cálculo de la modulación y la contractilidad celular. Hola, aquí estamos en la sala limpia de nuestros laboratorios.

Se trata de una sala libre de polvo y sensible a la luz que nos permite fabricar los ocho postes de la SU que servirán como maestro del silicio. Primero comenzaremos con una oblea de silicona y con esta la recubriremos con SU eight photo resist, SU eight es una resistencia negativa y es sensible a la luz. Entonces, cuando hacemos brillar la luz a través de esta máscara fotográfica, hará que la luz modele los micro postes y luego forme una estructura tridimensional, que luego serán los ocho postes SU que luego proyectamos en PDMS.

Entonces, después de que hayamos hecho todo nuestro procesamiento, la oblea se verá así, que es donde tenemos el micro pilar, las micro estructuras de postes ya fabricadas en la oblea. Entonces, para hacer los maestros, primero comenzamos con una oblea de silicona desnuda y esta se ha limpiado con un tratamiento de ozono durante siete minutos y también hemos deshidratado esta oblea durante 30 minutos a 120 grados centígrados. Vamos a hilar SU eight 2002 sobre esto para formar una capa base muy delgada para los postes.

Entonces, debido a que vamos a girar SU ocho, voy a usar una máscara de gas, vuelva a cargar la oblea en este soporte aquí, quite el polvo que pueda haber allí, colóquela en el girador, vamos a verificar para asegurarnos de que esté centrada y luego procederemos a verter el SU eight 2002 encima de esto. Y luego seguiremos adelante y giraremos la oblea. Luego los colocamos en la placa caliente, el horneado suave.

Hacemos esto durante un minuto después. Luego lo tomamos y lo transferimos a la placa calefactora a 95 grados. Y hacemos esto durante dos minutos.

Y cuando esté terminado, tomaremos esto ahora y nos iremos a hacer la exposición a la inundación en el alineador de la mascarilla. Bien, acabamos de hacer girar SU ocho, la primera capa de SU ocho en esta oblea, y ahora tenemos que inundar la exposición de toda la oblea para crear esa primera capa base para los micro postes. Así que tenemos que darle 70 milijulios de exposición.

Por lo tanto, aquí tenemos que medir la intensidad real de la luz en nuestro alineador de mascarillas. Así que cargamos el medidor en el peso en el alineador de mascarillas. Luego lo exponemos con luz.

Aquí se trata de luz ultravioleta. Cargamos la oblea de silicona en el alineador de mascarillas, la colocamos en el alineador de mascarillas. Y esta vez no tenemos mascarilla, así que de esa manera podemos exponer toda la película.

Pongamos el obturador y sigamos adelante y marquemos un minuto de exposición y vamos a seguir adelante y exponer. Entonces, después de un minuto de que el sistema esté listo, podemos sacar la oblea. Y ahora tenemos que hacer el horneado posterior a la exposición.

Así que acabamos de exponer esta oblea y ahora vamos a agregar calor para causar la reacción de reticulación para este primer recubrimiento de SU ocho. Así que lo colocamos en una placa caliente de 65 grados durante un minuto y luego lo transferimos a una placa caliente de 95 grados durante dos minutos. Después del proceso de dos minutos, apagamos la placa calefactora y dejamos que la oblea se enfríe a temperatura ambiente, lo que tarda unos 30 minutos.

Así que hemos hilado nuestra segunda capa de SU eight en esta oblea. Y ahora tenemos que exponer esto a través de la máscara fotográfica. Esta vez vamos a usar un filtro UV para bloquear esa luz UV profunda.

Este es un vidrio óptico Hoya que puedes conseguir, pero esta vez necesitamos volver a medir la intensidad. Así que vamos a usar nuestro medidor de luz o vamos a usar el filtro en la parte superior para medir la intensidad que se ha filtrado. Y luego vamos a cargar la mascarilla en el alineador de mascarillas.

Este interruptor crea un vacío que mantiene la mascarilla en su lugar. A continuación, lo colocaremos en el alineador de la mascarilla. A continuación, colocaremos el filtro en la parte superior y luego cargaremos nuestra oblea.

Queremos asegurarnos de que haya un buen contacto, por lo que lo elevamos para que esté en contacto y luego comenzaremos la exposición. Después de la exposición, sacaremos nuestra oblea del alineador de la mascarilla. Así que ahora tenemos áreas que han sido expuestas selectivamente. Llevaremos esto al horno, a las placas calientes para hacer el horneado posterior a la exposición.

Así que acabamos de hacer el po, el horneado final posterior a la exposición, y ahora vamos a desarrollar esta oblea para que podamos obtener las estructuras tridimensionales. Lo que vamos a hacer es lavar esto, desarrollar esto en P-G-M-E-A, lo que lavará el SU ocho no expuesto. Así que primero comenzamos en un plato de P-G-M-E-A y colocamos la oblea aquí durante dos minutos con una leve agitación.

Así que voy a dejar esto pasar por dos minutos. Así que vamos a pasar a un segundo plato de P-G-M-E-A. Esto eliminará ese P-G-M-E-A saturado con SU ocho.

Pasados los 10 segundos lo llevaremos a la IPA. Esto lava el P-G-M-E-A. Lo ponemos aquí durante 20 segundos, nuevamente con una leve agitación.

Y luego, ahora mismo, tenemos las estructuras de postes independientes. Así que vamos a poner esto en hexano, que tiene una tensión superficial baja. Vamos a lavar durante cinco segundos en uno y luego dos hexanos, y luego estamos listos para secarlo.

Así que acabamos de desarrollar la oblea y ahora vamos a colocarla en una placa caliente y aumentar lentamente la temperatura hasta un 50. Y lo que sucede es que esta temperatura más alta se entrecruza aún más con el SU ocho para hacerlo más rígido estructuralmente y lo dejamos en esta placa caliente durante la noche. Por lo tanto, entre 14 y 20 horas y luego apagaremos la placa calefactora y dejaremos que se enfríe nuevamente a temperatura ambiente.

Entonces, lo que tenemos que hacer es cortar esta oblea en un tamaño más pequeño. Básicamente, queremos cortar esta oblea de silicio y crear un pequeño chip de este patrón interno aquí. Y se va a ver algo parecido a esta estructura allí donde van a usar epoxi.

Y vamos a pegar ese chip en un portaobjetos de vidrio así. Y esto proporciona un respaldo estructural. Entonces, cortar una oblea en dados, es una especie de arte, pero lo que puedes hacer es básicamente usar un escriba de diamante y comenzar en un solo borde.

Y debido a los planos de cristal, solo pones una pequeña muesca ahora que ha creado una fractura, que luego puedo golpear con esta herramienta, podemos despegar esto y luego podemos hacer más cortes aquí hasta que obtengamos una pequeña estructura como esta. Y luego se coloca rápidamente el chip de silicona en el cristal y se monta en su lugar. Y dejas que eso se asiente.

Y así, después de que hayas terminado, tendrás un dispositivo que es similar a este. Así que hemos montado el maestro de silicio en esta diapositiva de vidrio y ahora vamos a darle una capa de fluidez, que ayudará a liberar esta estructura del PDMS más adelante. Así que vamos a colocar el chip en este desecado y luego vamos a tomar unas gotas de este tri Chloro Siling y colocar unas gotas en el desecado.

Hacemos esto dentro del capó porque esto tiene un subproducto del gas clorhídrico hidro, que es bastante duro. Continúe y cierre la tapa, conecte esto a la aspiradora y luego seguimos adelante y dejamos que esto se asiente desde la aspiradora y dejamos que se deposite durante la noche para obtener una buena capa sobre toda la oblea de silicona. Hola, soy Wesley Ligan.

Soy estudiante de posgrado en el laboratorio de Christopher Chen. En este punto, Nate te ha mostrado cómo crear un maestro de silicona para nuestros sustratos para la disfunción eréctil. Sin embargo, antes de que podamos utilizar esta herramienta para medir la contractilidad celular es necesario replicar primero las fotoestructuras rígidas utilizando un polímero de silicona elastomérico.

Nuestra primera tarea es generar una plantilla negativa del maestro de silicona que fabricamos anteriormente. Hacemos esto utilizando un elastómero de silicio llamado PDMS o Polymethyl Sloane para nuestro polímero PDMS. Ahora añadimos una proporción de uno a 10 de agente de curado.

Una vez que tenemos la solución pesada, es necesario mezclar bien el polímero PDMS y el agente de fuga cruzada. Esta mezcla obviamente introduce muchas burbujas de aire en nuestra solución. Entonces, en este punto, es necesario destaparlo y desgasificarlo en el desecado al vacío.

Una vez que el PDMS se haya desgasificado por completo y todas las burbujas hayan subido a la superficie y reventado, podemos retirarlo de la desecación al vacío. Ahora podemos usar esta mezcla de PDMS y agente de reticulación para generar un molde negativo de nuestro maestro de silicio. Y para hacer esto, usamos un molde para pastel y colocamos nuestro maestro de silicio montado en el centro de la misma.

A continuación, vertimos con cuidado la solución de polímero de DGAs en el plato sobre la parte superior de la oblea de silicona, tratando de evitar que se formen burbujas adicionales. Por lo general, tratamos de verter el polímero de aproximadamente un cuarto de pulgada de grosor. Puedes ver que este proceso introduce inevitablemente algunas burbujas de aire en la mezcla.

Así que ahora dejamos este plato a un lado durante aproximadamente 30 minutos para permitir que las burbujas suban a la superficie y revienten. Podemos ver que después de dejarlo reposar, todavía hay algunas burbujas de aire en la superficie del PDMS. Sin embargo, debido a que estos están en la superficie superior, ahora podemos usar una ráfaga rápida de nitrógeno para reventar las burbujas restantes.

Con el fin de reticularmente la solución PDMS y CROSSLINKER y generar una plantilla negativa rígida de nuestro maestro de silicio, lo horneamos a 110 grados centígrados durante 20 minutos. Podemos ver que hay una fina capa de PDMS en la parte superior del sustrato de silicona. Y antes de que podamos separar los dos, primero es necesario cortar esta capa.

A continuación, podemos injertar esta capa superior y despegarla suavemente del sustrato de silicona. En este punto, podemos invertir y muy lentamente despegar el sustrato de silicio negativo, el sustrato negativo de PDMS del maestro de silicona. Bien, hacemos esto sosteniendo un extremo hacia abajo y pelando suavemente el sustrato de PDMS.

Se puede ver el avance frontal a medida que el sustrato se despega del maestro de silicona. Ahora que hemos generado el molde negativo A-P-D-M-S de nuestro maestro de silicona, podemos cortarlo en cuatro moldes negativos individuales para hacer los sustratos finales de la almohadilla. En este punto, es importante no tocar la parte superior del sustrato negativo con pinzas o guantes para evitar dañar la superficie.

Así que en este punto, hemos generado cuatro plantillas negativas individuales a partir del maestro de silicona que consisten en pocillos de tres micras de diámetro y nueve micras de profundidad. Con el fin de regenerar las superficies en voladizo elevadas, podemos volver a fundir en estos moldes negativos a partir de un PDI PDMS utilizando PDMS. Sin embargo, antes de hacer eso, primero es necesario hacer que estos moldes negativos no sean adhesivos mediante un recubrimiento con fluorescente.

Lo hacemos en una cámara de plasma de cien vatios a plena potencia durante un minuto. Después de permitir que la cámara bombee el retorno del plasma, esto genera un campo de gas iónico que graba la superficie superior del PDMS y la hace más adhesiva para las moléculas de fluoro Cy Lane. Después de eliminar los moldes negativos de la desecación al vacío, puede ver aquí que lo que nos queda es una matriz de pozos profundos de tres micras por 10 micras en una capa de PDMS no adhesiva.

Con el fin de regenerar los voladizos verticales, que usamos para los sustratos mpad, es necesario desmontar nuevamente esto usando nuestra misma mezcla de PDMS y eso nos dejará con una matriz independiente positiva de voladizos elastoméricos, que reflejan de manera idéntica el maestro de silicio que fabricamos anteriormente. El primer paso en este procedimiento es transferir nuestros moldes negativos no adhesivos a una plantilla de montaje que hicimos con tiras de PDMS y un portaobjetos de microscopio de vidrio. La razón de este aparejo se aclarará en el siguiente paso.

En este punto, podemos depositar una pequeña gota de nuestra misma mezcla de 10 a uno de PDMS para reticular ya Degas en la superficie superior de cada uno de nuestros moldes negativos. Solo se necesita una pequeña cantidad de PDMS para que no se destaque hacia el borde de los moldes negativos. En este punto.

Para distribuir más completamente el PDMS a través de la superficie superior de los moldes, podemos agarrar uno con pinzas, invertirlo y ponerlo en contacto con el molde adyacente extendiéndose cuidadosamente alrededor del PDMS para cubrir completamente todo el sustrato. Tenga mucho cuidado en este paso de no introducir más burbujas en la solución superior de PDMS y luego repita con los otros dos pocillos, otros dos moldes. Ahora que tenemos un recubrimiento de PDMS más uniforme en la superficie superior, podemos colocar esta plantilla en un desecador al vacío para eliminar aún más las burbujas que puedan quedar atrapadas en la película de PDMS en la parte superior de nuestros moldes negativos.

Este proceso suele tardar unos 30 minutos. Mientras nuestros moldes negativos se desgasifican, podemos limpiar los sustratos de vidrio de 22 por 22 milímetros, que se convertirán en el lugar de montaje final de las almohadillas. El primer paso en este proceso es soplar cualquier partícula de polvo utilizando nitrógeno comprimido.

Expondremos los deslizamientos de la cubierta de vidrio al plasma gaseoso, lo que calcinará la superficie y la hará más adhesiva para el PMS, al que nos adheriremos en el siguiente paso. Después de permitir que la capa superior de PDMS pase a los DGA durante aproximadamente 30 minutos y que el plasma active los cubreobjetos de vidrio, podemos retirar nuestra plantilla y poner la superficie superior de los cubreobjetos de vidrio, que ha estado expuesta al plasma gaseoso, en contacto con la capa de PDMS encima de los moldes negativos. Por lo general, es útil poner primero un borde de la cubierta de vidrio en contacto con el PDMS y luego permitir que el resto de la cubierta de vidrio se asiente en un SH para que el PDMS se extienda en forma de lámina.

Esto ayuda a reducir las burbujas introducidas en la película PDMS. En este punto, podemos presionar suavemente la superficie superior del cubreobjetos de vidrio con nuestras pinzas para empujar hacia afuera cualquier exceso de PDMS, así como empujar el cubreobjetos contra la cruz del PDMS en el centro de la plantilla. Esto evitará que el cubreobjetos se mueva mientras el PDMS se está curando.

Repetimos esto para los otros sustratos. En este punto, podemos transferir toda la plantilla al horno y hornear a 110 grados centígrados durante 22 horas. Después de dejar que todo el conjunto se enfríe a temperatura ambiente, podemos quitar nuestros sustratos, invertirlos y despegar con cuidado el molde negativo del engobe de la cubierta de vidrio.

Es importante hacerlo de forma lenta y uniforme para evitar aplastar los postes o arrancarlos del sustrato de vidrio. Podemos ver que después de quitar el molde negativo, nos quedamos con una serie de voladizos que imitan con precisión al Silicon Master, solo que ahora están, están construidos a partir de un elastómero PDMS flexible. Bien, en este punto te hemos explicado cómo generamos el Silicon Master de nuestros sustratos Emad.

Luego, hemos utilizado un proceso de moldeo de réplicas para generar una réplica exacta utilizando el polímero elastomérico A-P-D-M-S, de modo que los voladizos ahora son flexibles para permitir que la célula se extienda y se contraiga y desvíe los voladizos en el proceso. En este punto, nuestros sustratos están listos para el procesamiento para el cultivo celular. Ahora que hemos visto cómo fabricar y replicar moldes para hacer el EDS, vamos a hacer algunos pasos más para hacer que el EDS sea funcional para que podamos cultivarnos a nosotros mismos y posteriormente analizar las fuerzas de tracción.

Pero antes de hacerlo, tenemos que hacer tres cosas. Necesitamos hacer que las puntas de los postes sean adhesivas a las celdas. En segundo lugar, necesitamos etiquetar con fluorescencia el PDMS para ayudar con la visualización y el análisis de las desviaciones posteriores.

Y en tercer lugar, debemos hacer que las paredes laterales de los postes, así como la base de los postes, no sean adherentes a las celdas para que las fuerzas de tracción se ejerzan solo en las puntas de los postes. Así que veremos cómo proceden estos pasos a través de la estrategia basada en la impresión por microcontacto en los próximos minutos. Pero primero, el siguiente paso es limpiar el exceso de P-D-S-P-D-M-S de los eds.

Entonces, como mencioné, el primer paso es tomar el sustrato EDS, que West le acaba de mostrar cómo generar y recortar. El exceso de PDMS que resultó del curado de la cubierta de vidrio se deslizó contra el molde negativo y el uso de un borde afilado de cuchilla de afeitar. El exceso de PDMS, se hace colocando la hoja de afeitar verticalmente sobre el sustrato en el borde de los pilares y luego raspando.

Y puede usar un dedo para sostener el cubreobjetos en su lugar para que no se mueva. Entonces, lo que terminamos con es un sustrato de almohadilla M que se ha limpiado de escombros y, por lo tanto, es fácilmente accesible. Entonces, para el siguiente paso, tenemos que micro contacto, imprimir los MPA para hacer que las puntas de los postes sean adhesivas.

Para ello, primero tenemos que generar sellos, y este proceso es muy sencillo. Simplemente mezclamos PDMS en lugar de una proporción de 10 a uno, una proporción de uno a 30 a uno. Vertemos en una placa de Petri de modo que la altura del PDMS sea de aproximadamente un centímetro.

Deja que se desgasifique. Es decir, deje que las burbujas suban a la parte superior del PDMS y cure la reacción de reticulación en el horno a 60 grados durante una hora después de sacar el plato del horno y dejar que se enfríe, ahora estoy listo para cortar los sellos. Así que, de nuevo, con el mismo tipo de cuchilla de afeitar, simplemente corte presionando verticalmente hacia abajo en el PDMS hasta que haga contacto con el fondo de la placa de Petri.

Ahora bien, la orientación del sello es algo a lo que queremos prestar atención. La superficie del sello será el lado del PDMS que se fundió contra la parte inferior de la placa de Petri para que permanezca plana. Así que en este gran cuadrado de PDMS que he recortado, la superficie del sello ahora está boca arriba.

Ahora este sello es mucho más grande que las almohadillas M, así que voy a recortarlo al tamaño de una sola almohadilla M nuevamente cortando con la cuchilla de afeitar, porque es muy difícil saber la orientación correcta del sello a ojo, voy a poner una pequeña muesca en lo que será la parte posterior del sello que es el lado no facial así. Y luego puedo quitar el sello de la losa más grande. Y ahora tengo el sello A-P-D-M-S para el siguiente paso.

Queremos limpiar los sellos PDMS. Ya que es muy posible que el polvo de la atmósfera se haya depositado en los sellos de PDMS mientras los estaba cortando. Este es un proceso en el que colocamos la cantidad deseada de sellos PDMS en esta placa de cristalización y llenamos la placa de cristalización con etanol al 100%.

Por lo tanto, simplemente agregue suficiente etanol para cubrir la cara de los sellos, pero la cantidad exacta de etanol agregada no es importante. Y luego coloque el disco de cristalización en un ator y sonique los sellos durante cinco minutos. Una vez transcurridos los cinco minutos, terminaremos de esterilizar los sellos y haremos el resto de la impresión por microcontacto, es decir, la funcionalización de las almohadillas M en una campana de cultivo de tejidos estéril.

Así que ahora estamos en la campana de cultivo de tejidos donde podemos terminar de esterilizar los sellos. Para hacer esto, tomamos los sellos de la placa de cristalización, los sumergimos en un plato lleno de etanol para enjuagar los restos restantes y, finalmente, los sumergimos en un plato con agua para enjuagar el etanol. A continuación, con un chorro de nitrógeno, secamos los sellos hasta que ya no queden gotas visibles.

Así que el siguiente paso, tenemos que entintar los sellos con una solución de proteínas. La solución proteica que estamos utilizando es de 50 microgramos por milésima de pulgada de fibrina en agua DEI. Simplemente tome un poco de la solución de proteínas en la pipeta y coloque gotas de la solución de proteínas en la esfera del sello.

Para ello, debes colocar pequeñas gotas en el borde de la cara del sello. Primero, repita esto para todos los sellos que usará y debería haberlo hecho con anticipación. Entonces, el siguiente paso después de haber colocado puntos en los bordes de todos los sellos es conectar esas gotas y llenar la solución de proteína en la cara del sello.

La razón por la que hicimos esto es porque la solución de proteínas en las gotas y sos debajo de las gotas hace que la superficie del sello sea hidrófila, lo que facilita la propagación de la proteína de la matriz extracelular. Así que, de nuevo, repite esto para todos los sellos que estés utilizando ahora que hemos esparcido la solución de proteínas en el anverso de los sellos, el último paso para entintar los sellos es asegurarte de que los bordes estén cubiertos. Para ello, simplemente inclinamos una pipeta y la pasamos a lo largo de la cara del sello para que entre en contacto tanto con la esquina del sello PDMS como con la solución de proteínas.

Y de nuevo, repite esto para todos los bordes de todos los sellos que vayas a entintar. Ahora que terminamos de entintar los sellos, colocamos esos sellos, dejamos los sellos en la campana de cultivo de tejidos durante una hora para facilitar la absorción completa de la proteína en la cara del sello. Así que ahora que hemos esperado una hora para que las proteínas se almacenen, se absorban en la superficie del sello, ahora es el momento de enjuagarlas con agua y secarlas con nitrógeno.

Para hacer esto, tomamos agua estéril y vertemos el agua estéril en el plato que contiene los sellos. Tenga cuidado de no verter el agua directamente sobre la cara del sello y puede usar una pipeta si es necesario. La cantidad exacta de agua que tomaste no es importante, siempre y cuando lleves el nivel del agua por encima de la solución de proteína.

Después de esto, con pinzas estériles, tome un sello, sumérjalo en un plato nuevo con agua y séquelo suavemente con nitrógeno. De nuevo, sabrás que está seco cuando lo veas, cuando ya no veas gotas de solución de proteína en el sello. Y repita esto para todos los sellos que esté procesando uno a la vez.

Así que ahora que hemos enjuagado los sellos en seco, es hora de activar los sustratos mpad tratándolos con ozono UV. Durante siete minutos, quito la tapa de la placa de Petri de la parte superior, de la parte superior de la placa. Porque tú, porque el poliestireno absorbe los rayos UV, luego coloco el plato en el tratador de ozono UV, cierro el cajón, configuro el tiempo en siete minutos y lo suelto.

Así que ahora estamos de vuelta en la campana de cultivo de tejidos y es el momento de estampar los sustratos de mpad, que acaban de ser tratados con ozono UV. Para ello, levante nuestros sellos enjuagados y secos con pinzas. Puede manipular los sellos por los lados, pero no toque la cara del sello.

Desea ajustar el sello en las pinzas para que el lado de la proteína sea accesible. A continuación, invierte las pinzas, teniendo en cuenta que el lado de la proteína está basado hacia abajo y poco a poco pones el sello en contacto con el eds. Los sellos de uno a 30 son bastante pegajosos, por lo que es posible que debas usar un segundo par de pinzas para liberar el sello de las pinzas.

Puede dejar caer el sello desde una altura de unos dos milímetros hasta unos ocho milímetros sobre los emeds. A continuación, incline el plato de los emeds hacia arriba y presione suavemente hacia abajo con pinzas para crear contacto entre el sello y los eds. Sabrá cuándo se produce el contacto de una de dos maneras.

La primera es mirar la superficie ED a través del costado del sello. Esto puede ser difícil de ver en la cámara, pero a simple vista puedo ver claramente que el sello está haciendo contacto con la superficie al mirar la superficie a través del costado del sello. La segunda forma de asegurar el contacto es con la p, es sacar la placa de Petri de la cubierta de cultivo de tejidos con la tapa puesta y verla bajo un microscopio invertido.

Al visualizar los patrones de interferencia con el microscopio, debería poder saber cuándo, si y cuándo el sello está en contacto con el eds. Una vez que haya determinado el contacto, el sello solo necesita permanecer en contacto con este, con el sustrato durante un par de segundos. Así que ahora es el momento de quitar el sello.

Para hacer esto, dobla los eds hacia abajo con un par de pinzas y, con un movimiento suave, despega el sello. Asegúrate de llevar un registro de los eds que has estampado y de los sellos que ya has usado anteriormente. Y repita este procedimiento una vez por empa para cada sustrato que desee utilizar.

Ahora que estampamos los EMPA, el siguiente paso es esterilizarlos y luego incubarlos en un tinte lipofílico llamado tinte ojo. Dai es una molécula lipofílica que está marcada con fluorescencia, por lo que se difunde en el PDMS en el transcurso de un tiempo que nos permite visualizar las deflexiones posteriores bajo el microscopio. Entonces, lo que voy a hacer es tomar cada sustrato empa individual, uno a la vez, y sumergirlo en 100% etanol, 70% etanol, agua desionizada, agua desionizada, agua desionizada.

Y finalmente, una solución de cinco microgramos por mil de dii. La solución DII es fluorescente, por lo que para minimizar su exposición a la luz ambiental y minimizar su fotoblanqueo, cubrimos los platos con papel de aluminio mientras se incuban en la campana de cultivo de tejidos durante una hora. Ahora que hemos esperado una hora para que las almohadillas EM se incuben en la solución DAI, podemos quitar el papel de aluminio y enjuagar la solución DAI.

Enjuagamos haciendo tres inmersiones secuenciales en agua esterilizada y, finalmente, sumergimos en una solución de 0,2%onic F1 27. Eso es 0.2%peso por volumen Durante todos los pasos de inmersión, es importante minimizar el tiempo que las almohadillas EM están expuestas al aire. Esto es para evitar daños a los sustratos de ED y, específicamente, evitar que dos postes colapsen uno sobre el otro.

El 0.2%onic F1 27 es un copolímero tribloque que se compone de dominios hidrófilos e hidrofóbicos. Se sabe que el dominio hidrofílico resiste la absorción de proteínas y, por lo tanto, la adhesión celular, mientras que el dominio hidrofóbico se une al temperamento y al PDMS hidrofóbico. Por lo tanto, cuando el PDMS se empapa en F1 27, el F1 27 se une al PDMS y repele la adhesión de la celda.

Después de una hora de incubación en F1 27 crónico en una placa de Petri cubierta con papel de aluminio, podemos enjuagar el F1 27 mediante inmersiones secuenciales en agua estéril, agua estéril y PBS. Después de la inmersión en PBS y el producto F1 27 se ha enjuagado, podemos sumergir los sustratos en la solución de cultivo celular de su elección. La solución de cultivo celular en la que acabo de sumergir los empa puede contener suero y/u otros factores de crecimiento y/o suplementos como penicilina y estreptomicina.

Todos estos ingredientes son totalmente compatibles con los tratamientos de EMPAs. Ahora, el siguiente paso, una vez que los eds se han sumergido en la solución de cultivo celular, es sembrar las células de elección en el eds. Para esta configuración experimental en particular, sembraré células endoteliales de aorta pulmonar bovina en tres placas diferentes.

La razón por la que estoy usando tres platos diferentes es porque trataré dos de los platos con inhibidores de tactilidad conocidos para inhibir las desviaciones de los postes, como podremos probar más adelante. Entonces, para sembrar las células, simplemente tomo mi suspensión celular, extraigo la cantidad adecuada en la pipeta y pipeteo gota a gota en cada plato. Agrego suficientes celdas para que cuando haga el ensayo para medir las fuerzas de tracción, las celdas existan como celdas de una sola célula en el eds.

La cantidad que agregue dependerá del área de propagación, así como de la tasa de crecimiento de sus células en particular. Por lo general, sembramos entre 1500 y 5.000 células por centímetro cuadrado de sustrato. Una vez que haya terminado de sembrar las células o editar la suspensión celular, avance a paso a paso hacia el cultivo, balancee suavemente el cultivo hacia adelante y hacia atrás varias veces en direcciones ortogonales para mezclar la suspensión celular en la placa de cultivo.

Repita este proceso para todos los sustratos que esté utilizando. Inmediatamente después de sembrar las células, colóquelas en una incubadora a 37 grados con un nivel adecuado de dióxido de carbono para amortiguar el pH y los medios de cultivo celular. Dos horas, aproximadamente dos horas después de sembrar las células, es apropiado enjuagar las células transfiriendo los sustratos de una placa de medio a una placa fresca del mismo medio de cultivo celular.

La razón de este enjuague es que la mayoría de las células habrán comenzado a propagarse y habrán alcanzado casi su área de propagación final en dos horas. Al enjuagar la célula, los sustratos, está eliminando las células flotantes del medio de cultivo celular. De esa manera, solo las celdas que se han unido al EDS y están comenzando el proceso de propagación aparecerán en el ensayo del punto final para las fuerzas de tracción.

Un ensayo que podemos realizar con células que han sido cultivadas en AMP es la obtención de imágenes de lapso de tiempo para examinar cuantitativamente la dinámica de la contractilidad celular. En particular, es interesante que la dinámica de la contractilidad celular en respuesta a factores solubles. Se sabe que los factores solubles, como los compuestos biológicos y los compuestos sintéticos, aumentan, disminuyen o tienen efectos desconocidos sobre la contractilidad celular.

Para este experimento con células vivas, utilizaremos este microscopio de epifluorescencia invertida. En la etapa del microscopio, tengo una pequeña caja de incubadora conectada a un regulador térmico para mantener la temperatura a 37 grados centígrados con 5% de CO2. Tomaremos imágenes a gran aumento con un objetivo APO plano de 60x.

Ahora vamos a preparar el sustrato de impacto para la toma de imágenes. El objetivo de 60 veces que estamos utilizando para la obtención de imágenes tiene una distancia de trabajo de 200 micras, que es mucho más delgada que el grosor de la placa de cultivo de tejidos en la que sembramos las células anteriormente. Por lo tanto, no podemos, no podemos obtener imágenes de las células en los implantes en la placa de cultivo de tejidos.

Para solucionar este problema, usamos estos platos con fondo de vidrio. Ahora transferiré el sustrato al plato con fondo de vidrio al revés para que las celdas y las puntas de los postes estén en la interfaz del plato con fondo de vidrio. Por lo tanto, cuando se coloca en el microscopio, la distancia de trabajo entre las células y el objetivo es inferior a 200 micras.

Ahora estamos listos para poner esto en un microscopio para obtener imágenes. Ahora abriré la cámara de la incubadora de células vivas, colocaré la muestra dentro y volveré a colocar la tapa de la cámara de la incubadora. En este punto, escanearé el sustrato en busca de una célula adecuada.

A la imagen. La forma más eficiente de hacer esto es usar un objetivo de fase uno de 10 x, que me permitirá ver un campo más amplio del sustrato y encontrar una celda más rápidamente. Mi criterio para una buena celda es para una sola celda.

No debe tocar ninguna célula vecina, y también debe tener un tamaño promedio en comparación con todas las demás células del sustrato, encontré una célula adecuada para mirar. Lo siguiente que haré es cambiar el objetivo a 60x para mirar la celda con gran aumento. Para ello, desenfocamos el objetivo, por lo que no se desmarca el escenario durante la rotación.

Durante la rotación de la torreta, abra la cámara, gire parcialmente la entrevista de objetivo de 60 x 60 x El objetivo de 60 x 60 x es una lente de inmersión en aceite, por lo que tenemos que colocar una gota de aceite de inmersión en la lente del objetivo. Ahora terminaremos de rotar la torreta para colocar el 60 x en su posición. Cerraremos la cámara de la incubadora y volveremos a enfocar el objetivo para volver a enfocar la célula.

Una vez que ajuste la posición y el enfoque de la celda, cambiaré a la cámara CCD para obtener una vista previa de la celda en la pantalla de la computadora y luego comenzaré las imágenes de lapso de tiempo. Para este experimento, estamos, estaré recolectando imágenes de fase y fluorescentes en un intervalo de un minuto, por lo que la imagen de lapso de tiempo ha comenzado y la dejaré funcionar durante 10 minutos o 10 fotogramas, y en ese momento agregaré suero 10 minutos ya ha transcurrido. En este momento, abriré la cámara y agregaré suero al plato para estimular la contractilidad en la célula.

El temporizador sigue funcionando, así que tengo que ser rápido al hacer esto Ahora, continuaremos tomando imágenes de la célula durante 30 minutos para seguir cualquier cambio en la contractilidad. Una vez que hayamos terminado las imágenes de lapso de tiempo, las imágenes se pueden secuenciar en una película. Aquí hay dos videos de las imágenes de fase y fluorescencia.

A la izquierda hay una película de fase de a, de una celda mayormente transparente delineada en negro. La celda se extiende a lo largo de las puntas de 20 postes, que son las estructuras circulares dispuestas en una celosía rectangular. A la derecha hay una película fluorescente de la misma celda, pero solo se ven los postes.

Si reproduzco estas películas, verá que los postes unidos a la celda son inicialmente débiles, def desviados y se desvían muy poco de la celosía rectangular. Hacia la mitad de la película, agregué suero a los medios. El suero estimula la célula para aumentar la contractilidad.

A medida que la célula ejerce mayores fuerzas de tracción sobre los postes subyacentes, los postes a lo largo del perímetro de la célula comienzan a desviarse hacia adentro. En la película fluorescente, ahora se ve que los postes se desvían significativamente de sus posiciones en la celosía rectangular. Como describiría más adelante, el desplazamiento de estas posiciones de poste en estas imágenes se puede utilizar para analizar las fuerzas de tracción de esta celda.

Anteriormente, vimos cómo generábamos los sustratos de mpad y cómo los funcionalizamos para cultivar células. Ahora te habrás dado cuenta de que coloqué los sustratos mpad terminados en tres placas de cultivo celular diferentes. Las células han estado creciendo de la noche a la mañana, y ahora lo que voy a hacer es tratar cada placa de cultivo celular individual con un agente soluble diferente que modula la contractilidad de una manera conocida.

A continuación, podemos medir de forma cuantitativa las fuerzas de tracción que se producen después de fijar las celdas durante 30 minutos. Después de agregar los factores solubles 30 minutos después de agregar los inhibidores de la contractilidad, ahora es el momento de fijar las células con aldehído paraformado para bloquear el estado actual de las fuerzas de tracción. Para hacer esto, es importante usar aldehído de paraforma que contiene calcio y magnesio, y usamos aldehído de paraforma en un porcentaje de volumen de 3.7%El método para sumergir los sustratos en aldehído de paraforma, lo siento, es el mismo que el método para sumergir los sustratos en este, en las diferentes RIN durante la funcionalización.

Es decir, es importante no dejar que los sustratos se sequen, ya que esto puede provocar un colapso posterior. Después de transferir los sustratos, los dejé incubar en el aldehído paraformado durante 20 minutos. Una vez transcurridos los 20 minutos, eliminamos los sustratos del aldehído paraformado y, ahora que las células se han fijado, podemos procesar estas muestras para la tinción inmunológica estándar.

Para ello, colocamos los sustratos boca arriba sobre el param y pipeteamos sobre suficiente PBS para cubrir el sustrato y mantenerlo debajo del PBS. A continuación, enjuagamos un sustrato tres veces con PBS para eliminar cualquier aldehído paraforme que pueda quedar en el cultivo. Después de enjuagar el sustrato tres veces con PBS, podemos transferir el sustrato para la inmunotinción posterior.

Hacemos esto manipulando el sustrato con un par de pinzas e invirtiendo en el primer paso en la inmunotinción, que es un agente de permeación. En este caso, estamos usando 0.2%Triton X en PBS. Sin embargo, el usuario puede utilizar el agente de ización que sea más apropiado para sus necesidades.

Repetimos esto para todos nuestros sustratos y así es como manejamos los sustratos durante el proceso de inmunotinción. Después de la inmunotinción, los sustratos se montan en un portaobjetos de vidrio estándar de una pulgada por tres pulgadas, que luego se puede procesar en cualquier microscopio de epifluorescencia, ya sea invertido o vertical. Al procesar las muestras en un microscopio confocal, podemos enfocarnos en la parte inferior de los postes para obtener las posiciones no desviadas, es decir, nulas.

Luego podemos enfocar hasta las puntas de los postes, tomar otra imagen de los postes y, al comparar la imagen superior con la inferior, podemos medir las deflexiones de los postes y calcular las fuerzas de tracción de las celdas que las celdas generaron para producir tales desviaciones. Al realizar este proceso para muchas celdas diferentes en varias condiciones diferentes, podemos comparar las fuerzas de tracción generadas en las diferentes condiciones. Ahora que hemos recopilado imágenes de células vivas y fijas, la siguiente tarea es medir la deflexión, medir las fuerzas de tracción en las células.

Para ello, para ello, hemos escrito un programa informático en matlab. Estas son las tres imágenes que utilizaremos en este análisis. La primera imagen es una imagen de fase de la célula.

Es útil para identificar la ubicación de la célula. La segunda imagen es una imagen fluorescente de la parte superior de los postes. Usamos esta imagen para ubicar las posiciones de los postes en su punta.

Como puede ver, algunos de estos postes están desviados y se desvían del entramado rectangular en el que se encuentran la mayoría de los postes, como este poste. Y este post. La tercera imagen que usaremos es la imagen base, que captura la posición de los postes en un plano focal que cruza a través de su base.

A este nivel, los postes, tanto desviados como no desviados, deben estar ubicados en su posición de reposo, posiciones no desviadas. En la celosía rectangular, se puede ver que los postes que se desviaron en la segunda imagen en su base, están en su posición FL. Esta imagen se utiliza para encontrar la posición del poste, es, está debajo de la posición reflejada.

A continuación, cargamos el programa MATLAB, que nos pedirá que carguemos estas tres imágenes. Asigne un nombre al archivo. Verá la imagen de fase.

Dibujaremos un recuadro alrededor de la que se indica dónde está la celda, para que el programa sepa qué publicaciones analizar. A continuación, el programa realiza la intensidad, el umbral y la ización de la imagen recortada para determinar las coordenadas OID de las publicaciones. A la izquierda se muestran las imágenes de las publicaciones de la imagen superior, mientras que a la derecha se muestran las imágenes de las mismas publicaciones de la imagen base.

Después de obtener los postes, las coordenadas OID, el programa puede determinar los vectores de desplazamiento entre la punta y la base de cada poste. Estos vectores de desplazamiento del poste se pueden convertir en vectores de fuerza multiplicándolos por la constante de resorte del poste. Podemos analizar estas fuerzas celulares de varias maneras, como la fuerza promedio por celda o la fuerza promedio por poste.

Un resultado útil es un diagrama de carcaj a partir del cual podemos visualizar la distribución espacial de las fuerzas. Esta es la celda que acabamos de analizar y pueden ver que he superpuesto flechas amarillas en los postes que se correlacionan con la magnitud de la fuerza y apuntan en la dirección de la fuerza. Al repetir este proceso de análisis de imágenes para secuencias de imágenes como las que se requieren en nuestra película de lapso de tiempo, podemos generar una secuencia temporal.

Aquí hay una película de la célula que habíamos estimulado con suero. Como se puede ver, justo cuando se agregó el suero, la célula aumentó la contractilidad y desvió aún más los postes. Además, podemos cuantificar fuerzas para un mayor número de células que han sido sometidas a diferentes condiciones y luego teñidas fijamente, como lo ejemplifican estos diagramas de carcaj que muestran una célula tratada con un compuesto de control frente a células tratadas con inhibidores de la contractilidad.

Como se pueda. Como puede ver, los vectores de fuerza en la celda en el caso de control son mayores que los mayores en longitud en magnitud que los vectores de fuerza. En los dos casos en los que se utilizaron los inhibidores de la contractilidad, hemos cubierto una gran cantidad de material aquí para describir el sustrato de la trayectoria, desde la microfabricación hasta la preparación de la muestra, la experimentación y el análisis para demostrar la versatilidad versátil de estos sustratos.

Hemos descrito dos ensayos diferentes, imágenes de células vivas y ensayo de muestra fija, y hemos realizado análisis de células obtenidas de ambos ensayos y hemos mostrado diagramas de carcaj y películas de carcaj. Con esta poderosa herramienta, se puede hacer una variedad de análisis espaciales y temporales de la contractilidad celular. Como ha visto, este método se basó en muchas disciplinas diferentes, incluidas las de la microfabricación, la biología celular básica, la ciencia de superficies, el análisis y procesamiento de imágenes, y muchas otras.

Y es precisamente porque su método se basa en varias técnicas de ingeniería diferentes que los parámetros como la geometría del poste, los factores solubles inducidos y los métodos para analizar las deflexiones del poste se pueden personalizar según las necesidades del usuario. Esperamos que la demostración visual de este método que describimos en los últimos 20 o 30 minutos pueda usarse como punto de partida para otros análisis más profundos sobre la regulación, las consecuencias funcionales y la generación de fuerzas de atracción celular.