Evaluación de la internalización de proteínas de superficie diana utilizando un derivado de la biotina

Trate los astrocitos corticales de ratón con un derivado de biotina escindible.

Incubar a baja temperatura para evitar la internalización de proteínas y facilitar la unión de biotina a las proteínas de superficie objetivo.

Lave y agregue un medio tibio, luego incube para inducir la internalización de las proteínas biotiniladas.

Lave y trate con un agente reductor impermeable a la membrana para escindir la biotina no internalizada.

Agregue un reactivo de enfriamiento para detener la reacción y lavar.

Cosecha las células y centrifuga. Retire el sobrenadante.

Agregue un tampón de lisis para lisar las células, liberando las proteínas biotiniladas internalizadas y no biotiniladas.

Centrífuga para granular los restos celulares.

Recoja el sobrenadante que contiene proteínas, agregue perlas de estreptavidina-agarosa y mezcle para capturar las proteínas biotiniladas.

Centrifugar para granular las perlas y desechar el sobrenadante.

Agregue un tampón de carga y caliente para desnaturalizar y liberar las proteínas de las perlas.

Pase la proteína en un gel y transfiérala a una membrana secante.

Detecte utilizando anticuerpos primarios y secundarios para visualizar una banda de proteína distinta, confirmando la internalización exitosa de la proteína.

Primero, retire los cultivos de astrocitos de la incubadora y aspire el medio. Luego, lave las celdas tres veces con 4 mililitros de CM-PBS frío y coloque los platos sobre hielo picado. Aspire el CM-PBS y luego pipetee 3 mililitros de tampón de biotina en cada plato. Incline los platos hacia adelante y hacia atrás varias veces para asegurarse de que el tampón esté bien distribuido y déjelos en hielo durante 30 minutos.

Luego, aspire el tampón de biotina y reemplácelo con 5 mililitros de medio tibio. Incube una placa de cultivo a 37 grados centígrados durante 15 minutos y una segunda placa a la misma temperatura durante 30 minutos. Deje otro plato a 4 grados centígrados como muestra de minuto cero.

Al final del período de incubación, deseche el medio y lave las células tres veces con 4 mililitros de CM-PBS refrigerado. A continuación, aspire el CM-PBS y, a continuación, pipetee 6 mililitros de tampón reductor sobre las células y deje la muestra en hielo durante 15 minutos.

Luego, reemplace el medio con 6 mililitros de tampón reductor fresco y coloque la muestra en hielo durante 15 minutos más.

Este paso es crítico ya que el glutatión contenido en el tampón reductor escindirá los restos de biotina que quedan en la superficie celular. Esto asegura que solo las proteínas internalizadas estarán sesgadas y etiquetadas.

Después de eso, retire la solución reductora y reemplácela con 6 mililitros de tampón de enfriamiento. Deje la muestra en hielo durante otros 15 minutos y repita el paso de enfriamiento una vez más. Luego, deseche el tampón de enfriamiento y lave las celdas tres veces con 4 mililitros de PBS enfriado.

Aspire el CM-PBS y luego, raspe las células en 1 mililitro de PBS enfriado con un elevador de celdas y transfiera la suspensión a un tubo de microcentrífuga. Peletizar las células por centrifugación a 100 g durante tres minutos. Después de tres minutos, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 500 microlitros de tampón de lisis.

Deje la muestra en hielo durante 30 minutos y vórtice cada cinco minutos. Centrifugar el lisado a 14.000 g durante 10 minutos a 4 grados centígrados para granular el detergente y los materiales solubles. Luego, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga.

Con una punta de pipeta cortada, agregue 150 microlitros de la suspensión de agarosa de estreptavidina al lisado e incube a 4 grados centígrados durante tres horas en un agitador. Después de tres horas, granular las perlas de agarosa de estreptavidina centrifugando a 1.500 g durante 30 segundos a 4 grados centígrados. Vuelva a suspender las perlas en 1 mililitro de tampón de lavado y mézclelas durante tres minutos a 4 grados centígrados. Granular las perlas y desechar el sobrenadante.

Repita este proceso cuatro veces más para minimizar la unión inespecífica de proteínas citosólicas no biotiniladas. Luego, granular las perlas por centrifugación a 1.500 g durante 30 segundos a 4 grados centígrados. Deseche el tampón de lavado suprayacente y agregue 50 microlitros de 1x tampón de carga.

Libera biotina y estreptavidina de las perlas desnaturalizándolas a 95 grados centígrados. Esta fracción debe contener solo proteínas de la superficie celular internalizadas. A continuación, separe la entrada, la superficie celular y las fracciones no ligadas mediante SDS-PAGE y analícelas mediante Western blotting.