Evaluación de la internalización de proteínas de superficie diana utilizando un derivado de la biotina

Trate los astrocitos corticales de ratón con un derivado de biotina escindible.

Incubar a baja temperatura para evitar la internalización de proteínas y facilitar la unión de biotina a las proteínas de superficie objetivo.

Lave y agregue un medio tibio, luego incube para inducir la internalización de las proteínas biotiniladas.

Lave y trate con un agente reductor impermeable a la membrana para escindir la biotina no internalizada.

Agregue un reactivo de enfriamiento para detener la reacción y lavar.

Cosecha las células y centrifuga. Retire el sobrenadante.

Agregue un tampón de lisis para lisar las células, liberando las proteínas biotiniladas internalizadas y no biotiniladas.

Centrífuga para granular los restos celulares.

Recoja el sobrenadante que contiene proteínas, agregue perlas de estreptavidina-agarosa y mezcle para capturar las proteínas biotiniladas.

Centrifugar para granular las perlas y desechar el sobrenadante.

Agregue un tampón de carga y caliente para desnaturalizar y liberar las proteínas de las perlas.

Pase la proteína en un gel y transfiérala a una membrana secante.

Detecte utilizando anticuerpos primarios y secundarios para visualizar una banda de proteína distinta