Inmunotinción de astrocitos marcados con fluorescencia en una sección de tejido cerebral de ratón

Tome una sección fija de tejido cerebral de ratón que contenga una población escasa de astrocitos que expresan una proteína fluorescente.

Trate la sección flotante con un tampón que contenga detergente para permeabilizar las células.

Incube la sección en un tampón de bloqueo para evitar la unión de anticuerpos inespecíficos.

Trate la sección con anticuerpos primarios e incube para permitir que los anticuerpos se unan a las proteínas fluorescentes en los astrocitos.

Lave cualquier exceso de anticuerpos primarios con tampón.

A continuación, incube la sección con anticuerpos secundarios marcados con fluoróforos que se unen a los anticuerpos primarios.

Lave los anticuerpos secundarios no unidos con un tampón.

Transfiera la sección a una mezcla de agua desionizada para eliminar los residuos de detergente.

Coloque la sección en un portaobjetos que contenga agua desionizada con tampón. Retire el exceso de líquido y agregue medios de montaje. Luego, coloque un cubreobjetos y asegúrelo.

Finalmente, use microscopía confocal para visualizar los astrocitos que expresan proteínas fluorescentes marcados dentro de la sección.

Para comenzar, prepare una solución nueva de TBST agregando 1 mililitro de Triton X al 10% a un tubo de 50 mililitros y llenando el tubo a 50 mililitros con TBS. Prepare 2 mililitros de soluciones de bloqueo y anticuerpos para cada cerebro combinando suero de cabra y TBST en un tubo de 15 mililitros.

A continuación, etiquete una placa de 24 pocillos para colocar diferentes muestras en diferentes filas, en diferentes soluciones, en diferentes columnas. Luego, agregue 1 mililitro de TBST a las primeras tres columnas etiquetadas como 'Lavado 1', 'Lavado 2' y 'Lavado 3', y agregue 1 mililitro de solución de bloqueo a la cuarta columna.

Prepare un pico de vidrio derritiendo el extremo de una pipeta Pasteur de 5.75 pulgadas en un gancho pequeño con un mechero Bunsen. Luego, transfiera secciones de tejido de la placa de 12 pocillos a la columna 'Lavar 1' de la placa de 24 pocillos usando el pico. Luego lave las secciones durante 10 minutos cada una en los pocillos de lavado 1, 2 y 3 usando el pico de vidrio para transferir las secciones de un pocillo al siguiente, seguido de incubar las secciones durante una hora en la solución de bloqueo.

A continuación, incube las secciones en el anticuerpo primario durante dos o tres noches a 4 grados centígrados mientras agita. Después de la incubación primaria de anticuerpos, aspire el TBST del día uno de los pocillos de lavado. Luego agregue 1 mililitro de TBST nuevo a cada pozo de lavado y mueva las secciones al primer pozo de lavado.

A continuación, incube secciones en anticuerpo secundario durante tres horas a temperatura ambiente. Después de la incubación secundaria de anticuerpos, aspire el TBST del día dos de los pocillos de lavado. Luego agregue 1 mililitro de TBST nuevo a cada pozo de lavado y mueva las secciones al primer pozo de lavado.

Durante el lavado final, saque el medio de montaje a 4 grados centígrados y deje que se caliente a temperatura ambiente. Luego prepare una mezcla de 2 a 1 de TBS en agua desionizada y agréguela a una placa de Petri. A continuación, prepare un portaobjetos de microscopio agregando 800 microlitros de mezcla 2 a 1 de TBS en agua desionizada a la superficie.

Transfiera las secciones del pozo 'Wash 3' a la placa de Petri. Luego, con un pincel fino, transfiera las secciones una a la vez de la placa de Petri al líquido en el portaobjetos. A continuación, organice cuidadosamente las secciones para que queden planas en la diapositiva con el pincel. Retire con cuidado el exceso de líquido del portaobjetos con una pipeta P1000, seguido de aspiración al vacío.

Una vez que se haya eliminado todo el exceso de líquido del portaobjetos, use una pipeta de transferencia para agregar inmediatamente una gota de medios de montaje a cada sección y coloque suavemente un cubreobjetos sobre el portaobjetos. Deje que los medios de montaje se extiendan durante unos minutos y luego retire cualquier exceso de medios de montaje que salga de debajo del cubreobjetos mediante aspiración al vacío. Luego, selle los cuatro bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente.