Imágenes tridimensionales de astrocitos inmunomarcados mediante microscopía confocal

Tome una sección de cerebro de ratón inmunoteñida con astrocitos marcados con fluorescencia. El citoplasma del astrocito emite fluorescencia roja, mientras que el núcleo emite fluorescencia azul.

Coloque el portaobjetos en la platina de un microscopio confocal debajo de una lente de objetivo adecuada.

Usando el software de adquisición, ajuste el enfoque y seleccione los fluoróforos que marcan el citoplasma y el núcleo del astrocito.

Comience a obtener imágenes en vivo y optimice los parámetros de imagen para reducir el ruido en la imagen adquirida.

En Parámetros de adquisición, seleccione un modo de escaneo de baja velocidad para capturar una imagen bidimensional de mayor calidad.

Identifique la posición más alta del astrocito como el punto de partida para la pila Z y la posición más baja como el punto final.

Defina el número de sectores que cubren toda la profundidad de celda.

Combina las rodajas para generar una imagen tridimensional del astrocito.

Para comenzar la microscopía confocal, coloque un portaobjetos en la platina del microscopio y seleccione el objetivo de 63x. Después de abrir el software de adquisición, haga clic en Configuración inteligente en la pestaña Adquisición y seleccione los fluoróforos adecuados. Aquí se utilizan DAPI y Alexa Fluor 555.

A continuación, haga clic en Mejor señal, seguido de Aplicar. Luego haga clic en Establecer exposición para permitir que la computadora determine los parámetros de exposición óptimos.

Para optimizar la imagen, abra la ventana Canales y cambie la imagen a Live. Ajuste el enfoque si es necesario. Luego haga clic en 1 UA para optimizar el estenopeico. Ajuste la ganancia para obtener la mejor intensidad.

Finalmente, establezca la ganancia digital entre 2 y 3. Después de esta optimización, detenga la imagen en vivo y abra la ventana Modo de adquisición. Ajuste el tamaño del fotograma haciendo clic en X por Y y seleccione 1024 por 1024. Además, elija una velocidad lenta.

A continuación, abra la pestaña Promedio y seleccione un número mayor o igual a 4. Luego haga clic en el botón Ajustar y guarde la imagen 2D capturada. Para configurar imágenes 3D, abra la pestaña Configuración inteligente y marque el elemento Z-Stack, lo que hará que se abra la ventana de pila.

Para establecer la primera y la última posición para el Z-Stack, nuevamente, haga clic en En vivo y ajuste el enfoque a la posición superior del astrocito. Haga clic en Establecer primero. Ahora ajuste el enfoque a la posición más baja del astrocito y haga clic en Establecer último. Luego detenga la vista en vivo.

A continuación, elija el intervalo haciendo clic en Óptimo para establecer el número de rebanadas. Aquí, el intervalo es de 1,01 micrómetros. Finalmente, haga clic en Iniciar experimento y guarde las imágenes una vez que se complete el escaneo.