¿Cuál es la importancia de medir el potencial de membrana en las células endoteliales?

Medir el potencial de membrana ayuda a comprender el estado funcional y las vías de señalización de las células endoteliales.

¿Cómo funciona el colorante sensible al calcio?

El colorante se une a los iones de calcio, y su intensidad de fluorescencia aumenta con concentraciones más altas de calcio, permitiendo la cuantificación de los niveles de calcio intracelular.

¿Cuáles son las implicaciones de un potencial de membrana alterado?

Un potencial de membrana alterado puede indicar cambios en la actividad celular, como la activación de canales iónicos o la participación de vías de señalización.

¿Se puede aplicar este método a otros tipos de células?

Sí, la metodología se puede adaptar para su uso con otros tipos de células para estudiar su potencial de membrana y señalización del calcio.

¿Qué papel juegan los agentes farmacológicos en este estudio?

Los agentes farmacológicos se utilizan para manipular las vías de señalización y evaluar sus efectos sobre los niveles de calcio y el potencial de membrana.

¿Es esta técnica adecuada para la imagen de células vivas?

Sí, la técnica está diseñada para la imagen de células vivas, permitiendo la observación en tiempo real de la dinámica celular.

Análisis de la dinámica del calcio y los cambios potenciales en la membrana del endotelio arteriolar de un ratón

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

0 views • 2:38 min • April 28th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Asegure un tubo endotelial arteriolar extraído de un cerebro de ratón en una cámara con un flujo amortiguador continuo.

Coloque la cámara en una configuración de grabación.

Introduce un tinte fluorescente sensible al calcio. Incubar para permitir la absorción celular del tinte.

Lavar para eliminar cualquier tinte no internalizado.

Inserte un electrodo en una célula endotelial y registre el potencial de membrana en reposo.

Elevar la temperatura del baño a una temperatura fisiológica para facilitar la unión del calcio intracelular al tinte.

Excitar el colorante y medir la fluorescencia para cuantificar los niveles basales de calcio celular.

Introducir un fármaco que se une a receptores específicos acoplados a proteínas G en las células endoteliales, iniciando una cascada de señalización.

Esta cascada libera iones de calcio del retículo endoplásmico al citoplasma, mejorando la unión del colorante de calcio y la fluorescencia.

Los niveles elevados de calcio citoplasmático también activan los canales de potasio, lo que facilita la salida de iones de potasio y disminuye el potencial de membrana.

Registre los datos.

El aumento de la fluorescencia y la disminución del potencial de membrana indican un tubo endotelial funcional.

Para medir el potencial de la membrana endotelial, mientras se ve a través del objetivo de cuatro veces, coloque cuidadosamente la punta afilada del electrodo justo sobre una célula del tubo endotelial arterial en la solución salina fisiológica que fluye con un micromanipulador. Gradualmente, aumente el aumento a 400 veces y vuelva a colocar la punta del electrodo según sea necesario. Con el micromanipulador, inserte suavemente la punta de un electrodo afilado en una de las células del tubo endotelial y comience a registrar VM con un electrómetro.

Una vez que la VM endotelial en reposo es estable de menos 30 a menos 40 milivoltios, aplique los agentes farmacológicos deseados según el objetivo experimental. Cargue el tubo endotelial con el rastreador de fluorescencia para la membrana plasmática o el orgánulo deseado a 37 grados Celsius durante 15 a 30 minutos. Lave las células con una solución salina fisiológica de superfusión fresca y obtenga imágenes de las células vivas bajo el microscopio a la longitud de onda de excitación de los respectivos colorantes.