Name: Cuantificación y análisis de la formación de HO-endonucleasa Estimulado translocaciones cromosómicas por un solo capítulo recocido en Saccharomyces cerevisiae /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprende a cuantificar translocaciones cromosómicas inducidas por HO-endonucleasa en Saccharomyces cerevisiae mediante ensayo de anillamiento de hebra única. Este método permite estudiar el control genético de la formación de translocaciones en levadura diploide.

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Este trabajo fue financiado por los fondos de los Institutos Nacionales de Salud y el Instituto de Investigación Beckman de la Ciudad de la Esperanza. Tenemos que agradecer los revisores para los constructivos comentarios que agregaron claridad manuscrito.

1. HO-estimulado las frecuencias de desplazamiento <ol><li> Inocular 10-20 independientes 1 ml de cultivos de YPGly / Lac medio (1% extracto de levadura, 2% de peptona, 3% de glicerol y 3% de lactato), con colonias aisladas del genotipo deseado. Incubar los cultivos de una noche, o durante el tiempo suficiente para llegar a una densidad celular de aproximadamente 5x10 7 1x10 8 células / ml, a 30 ° C en un rotor, o con una suave agitación. </li><li> Añadir galactosa a las culturas a una concentración final de 2% para inducir HO endonucleasa dirigida DSBs en el his3-Δ3 (cromosoma III) y his3 Δ5-'(cromosoma XV) sustratos translocación. </li><li> Se incuba durante 4 horas a 30 ° C en un rotor, o con una suave agitación. </li><li> Después de 4 h, diluciones placa adecuada de los cultivos en YPD (1% extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de glucosa) para producir entre 100 y 200 colonias por placa, y un número suficiente de células en medio carente de histidina para producir un observable Su número de colonias + recombinante. Incubar las placas a 30 ° C durante dos o tres días. </li></ol> NOTA: El paso 1.4 describe la determinación de las frecuencias de desplazamiento bajo condiciones selectivas mediante siembra de los cultivos en medio carecen de histidina. Este ensayo también puede llevarse a cabo bajo condiciones no selectivas mediante siembra de cultivos en YPD, y luego replica-recubrimiento de las colonias que surgen en sus placas, dos o tres días más tarde. Estos métodos producen con frecuencias similares de translocación (Figura 2C). <ol start="5"><li> Determinar la frecuencia de translocaciones dividiendo el número de colonias prototróficas histidina por el número total de células viables en placas (determinado por diluciones en placas de YPD). Determinar la frecuencia de translocaciones mediana y el 95% intervalo de confianza 15. </li></ol> 2. La eficiencia de chapado <ol><li> Quitar una parte alícuota de las células de cada cultivo de una noche, y determinar el número de células por hemocitómetro cuenta (Baxter Healthcare Corporation Catolog #:. B3178-1). </li><li> Placa de 100 a 200 células por medio de una dilución adecuada en YPD. Se incuba durante dos o tres días a 30 ° C (por ejemplo, para una cultura con una densidad celular de 1x10 8 células / ml, se debe placa 100-200 l de una dilución de 5.10 por placa). </li><li> Agregar 20% de galactosa a las culturas a una concentración final de 2%. </li><li> Después de 4 horas, retirar una alícuota de células de cada cultura, determinar el número de células, en número, hemocitómetro, y la placa de 100 a 200 células por medio de una dilución adecuada en YPD. Se incuba durante dos o tres días a 30 ° C. </li><li> Determinar la eficiencia de plaqueo de dividir el número de colonias que aparecen en YPD por el número de células sembradas, y multiplicando este cociente por 100. Determinar el porcentaje de la mediana con un intervalo de confianza del 95%. </li></ol> 3. El análisis genómico por Southern blot <ol><li> Seleccione una sola colonia + Su recombinante de cada ensayo independiente y preparar el ADN genómico 16. </li><li> Compendio de aproximadamente 4 g de ADN con la endonucleasa de restricción BamHI. </li><li> Separados BamHI digerido fragmentos en un 0,7% en gel de agarosa y transferencia a una membrana de nylon con carga positiva (Hybond N +, GE Healthcare Código de producto:. RPN303B) 17. </li><li> Hibridar con un 32 P-etiquetados sonda obtenida mediante cebado aleatorio (Amersham Biosciences Código de producto:. RPN1604) con un 1,8 kb BamHI / BamHI clon genómico que contiene el gen HIS3. </li><li> Visualizar los fragmentos de ADN por autorradiografía o phosphorimaging. </li></ol> 4. Análisis de los cromosomas blot utilizando cromosomas separados en un contorno de los enganches de campo eléctrico homogéneo (CHEF): <ol><li> Preparar los cromosomas de una selección de sus recombinantes + en tapones de agarosa 18: <ul><li> Crecer un cultivo líquido de la válvula de expansión + Su candidato:: III cromosoma recombinante que contiene en 5 ml de YPD a aproximadamente 2.1 x 10 8 células / ml. </li><li> Decantar y lavar las células dos veces con 50 mM EDTA. </li><li> Resuspender las células en unos 200 l de 50 mM EDTA, y caliente a 50 ° C. </li><li> Añadir un volumen igual de líquido al 2% (w / v) de agarosa de baja fusión llevado a 50 ° C, mezclar bien. </li><li> Prescindir de aproximadamente el 80 alícuotas en los moldes tapón y dejar que se enfríe durante 30 minutos a 4 ° C. </li><li> Extrusión enchufes del molde en un plato de 12 pocillos. Hasta cinco tapones se pueden colocar en cada pocillo. </li><li> Añadir 3 ml de solución recién preparada spheroplasting (14 mM 2-β-mercaptoetanol, 20 mM EDTA, 0,5 mg / ml Zymolyase 20T, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M sorbitol) a cada pocillo. Se incuba a 37 ° C durante 4 horas con agitación suave. </li><li> Retire la solución spheroplasting y reemplazar con 3 ml de solución de LDS (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM EDTA, 1% (w / v) de litio de dodecilsulfato, ajust pH de 8,0). Se incuba a 37 ° C durante 15 min con agitación suave. </li><li> Retire la solución LDS y sustituirla por otra parte alícuota de 3 ml de LDS. Se incuba a 37 ° C durante la noche con agitación suave. </li><li> Quitar LDS y reemplazar con 3 ml de 0,2 X NDS (0,6 g Tris base, 93 g de EDTA disódico dihidrato, 5 g de N-lauroilsarcosina, ajustar el pH a 8.0, llevado a 500 ml con dH 2 O). Incubar a temperatura ambiente durante 30 min con agitación suave. Quitar NDS, y repetir dos veces. </li><li> Quitar NDS y reemplazar con 3 ml de TE. Lavar con agitación suave durante 30 minutos a temperatura ambiente. Repetir 4 veces. </li><li> Tienda de tapones a 4 ° C en 2 ml de TE. Los enchufes pueden mantener hasta por un año. </li></ul></li><li> Los cromosomas se separan en un 1% en gel de agarosa utilizando un Bio-Rad CHEF-DRII aparato a 14 ° C (Catálogo #: 170 a 3612). </li></ol> Parámetros: 1 º Bloque: tiempo de cambiar 70, 15h en 6V/cm. 2 º Bloque: tiempo de cambio de 120, de 11h a 6V/cm <ol start="3"><li> Visualizar los cromosomas por tinción con bromuro de etidio 1μg/ml durante 30 minutos, la irradiación con 60 mJ de la radiación UV en un Stratalinker UV (Stratagene), y de la tinción durante 30 minutos en dH 2 O. La irradiación de bromuro de etidio cromosomas teñidos nicks el ADN para permitir la transferencia eficaz de la membrana. </li><li> La transferencia de cromosomas de una membrana con carga positiva (Hybond N +, GE Healthcare Código de producto:. RPN303B) por la acción capilar en condiciones de desnaturalización (NaOH 0.4N, 1,5 M NaCl). </li><li> Hibridar con un 32 P-etiquetados sonda obtenida mediante cebado aleatorio (Amersham Biosciences Código de producto:. RPN1604) con un clon genómico de 1,8 kb BamHI / BamHI que contiene el gen HIS3 17. </li><li> Visualizar los cromosomas por autorradiografía o phosphorimaging. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Una representación gráfica de la prueba de desplazamiento se representa en el nivel de los cromosomas (Figura 1). Un esquema del procedimiento experimental también se muestra (Figura 2). Tanto antes como después de la inducción, la eficiencia de placas se determina dividiendo el número total de células viables de la colonia, formando por el número total de cuerpos celulares en la cultura determinada por hemocitómetro cuenta (Figura 4). Pre-y post-inducción de la eficiencia de la galvanización no fueron significativamente diferentes de células de tipo salvaje (p-valor = 0,1400) (Tabla 1). <img src="/files/ftp_upload/3150/3150table1.jpg" alt="Tabla 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabla 1"> Tabla 1. Pre-y post-inducción de la eficiencia de la siembra en células de tipo salvaje. a El número de cuerpos de células por mililitro se determinan por el número hemocitómetro. b El número de células viables por mililitro se determinó mediante siembra de diluciones adecuadas en un medio no selectivo para producir ~ 100-200 colonias. c El pre-y post-inducción de la eficiencia de placas se determina dividiendo el número total de viables, formadoras de colonias, las células por el número total de cuerpos celulares en la cultura, determinada por el número hemocitómetro. Esto sugiere que la presencia o ausencia de cualquiera de cromosoma por translocación no afecta a la capacidad de sobrevivir a la formación de OSD. La frecuencia de las translocaciones cromosómicas se puede calcular dividiendo el número de colonias prototróficas histidina por el número total de células viables determinado por placas en YPD (Figura 2B). Este ensayo se puede realizar utilizando las cepas de genotipo diferente para identificar cómo la pérdida de función de la proteína afecta a la SSA (es decir, rad51Δ - / -). Determina las frecuencias de recombinación de cepas distintas se pueden graficar para comparar las diferencias en la capacidad de estas cepas para reparar el DSBs endonucleasa HO-inducida por la SSA (Figura 2C). Frecuencias translocación obtenidos con la cepa diploide de tipo salvaje en selectivo (2.2x10 -2) y no selectivos (2.17x10 -2) las condiciones no fueron estadísticamente diferentes entre sí (p-valor = 0,9131), mientras que las frecuencias de desplazamiento obtenido de forma selectiva (6.0x10 -2) y no selectiva (11.9x10 -2) con el rad51Δ - / - homocigotos fueron similares, pero estadísticamente diferente (p-valor = 0,0089). Las frecuencias obtenidas tanto de forma selectiva (p-valor = 0,0001) y no selectiva-(p-valor = 0,0002) con el · rad51 - / - homocigotos fueron estadísticamente diferentes de los obtenidos con las condiciones correspondientes a la cepa de tipo salvaje. Putativo teniendo translocación-clones pueden ser examinadas mediante transferencia genómica del Sur y los análisis cromosómicos blot (Figura 3). Para el análisis de Southern, el ADN genómico es digerido con la endonucleasa BamHI antes de la electroforesis en gel de agarosa, secante y la hibridación de un 32P-etiquetados 1.8kb HIS3 sonda para visualizar el diagnóstico de 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 ', 4 kb tiii:: XV, 5 kb TXV:: III, y 8 kb his3-Δ5' fragmentos (Figura 3B.1) . Cromosomas intactos se pueden preparar, separados por CHEF (Figura 3B.2), se transfirieron al nylon y se hibridó con los 32 P-etiquetados 1,8 kb HIS3 sonda para visualizar el 1,1 Mb intacta cromosoma XV, 0,8 Mb TXV: cromosoma III translocación, 0,6 Mb tiii: cromosoma XV translocación, y 0,3 Mb intacto el cromosoma III (Figura 3B.3). Un mapa gráfico que representa espera endonucleasa BamHI digerir fragmentos de ADN genómico, y los padres y los cromosomas recombinantes, se muestra (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Formación de los cromosomas de translocación por un solo capítulo recocido (SSA). 1) DSBs se crean en el his3-Δ3 y his3-Δ5 'sustratos (cromosomas XV y III, respectivamente) por la endonucleasa HO después de la adición de galactosa a los cultivos. 2) DSBs son procesadas para generar 3 'de un solo hilos en los extremos de los cromosomas rotos. 3) anneals SSA maquinaria complementaria 311 o 60 nucleótidos de cadena sencilla HIS3 secuencias formadas en cada uno de los sustratos de recombinación. No homólogas colas formadas en el recocido se eliminan mediante la digestión con endonucleasas. Complementarios cuatro aleros pb en los fragmentos restantes cromosómica formada por la endonucleasa HO-digestión también puede recocido. 4) Ligadura concluye la creación de un gen intacto HIS3 y válvula de expansión:: cromosoma III desplazamiento por la SSA. Células portadoras de este cromosoma puede ser seleccionado por su capacidad para crecer en medio carecen de histidina. La ligadura puede también generar el recíproco tiii:: cromosoma XV translocación de un mecanismo de NHEJ-como. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Ensayo para determinar la frecuencia de la translocación de la SSA. A) Un ml YPGly / Lac culturas son inoculados con colonias aisladas de las células de un genotipo seleccionar y crecido hasta una densidad adecuada de aproximadamente 5x10 7 1x10 8 células / ml. Galactosa se añade a una concentración final de 2% para crear DSBs en los sustratos de recombinación de los cromosomas III y XV. Para llevar a cabo el ensayo bajo condiciones selectivas, las diluciones adecuadas se hará de manera que entre 100 y 200 células se colocan en YPD y un número suficiente de células se colocan en medio carecen de histidina para producir una cantidad observable de sus colonias + recombinante. Para llevar a cabo el ensayo, sin selección, entre 100 y 200 células se colocan en YPD, crecido por dos o tres días a las colonias de una sola y luego réplica chapada en medio carecen de histidina. B) frecuencia de translocaciones se puede determinar al dividir el número de colonias que crecen en sus placas por la fracción que crecen en YPD. C) Las frecuencias de la translocación de las cepas del genotipo diferente (es decir, de tipo salvaje y rad51Δ - / -) puede ser graficada para comparar las diferencias en la capacidad de estas cepas para reparar el DSBs por la SSA. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Determinar la eficiencia de placas. (A) una alícuota de células se ha tomado de la cultura durante la noche antes y después de la inducción del OSD, las diluciones adecuadas se hacen, seguido de un recuento hemocitómetro para determinar el número total de cuerpos de células por ml de la cultura. Diluciones apropiadas se sembraron en un medio no selectivo para determinar el número total de células viables por ml, al contar las colonias que aparecen en YPD. (B) La eficiencia de plaqueo se determina dividiendo el número total de células viables por el número total de cuerpos celulares, y multiplicando este cociente por 100. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. La detección de eventos translocación cromosómica mediante transferencia genómica del Sur y los análisis de cromosomas blot. A) La representación gráfica de los cromosomas pertinentes antes (izquierda) y después de la formación desplazamiento (derecha). Los tamaños de los padres y los cromosomas recombinantes se enumeran en los pares megabase (Mb). Los tamaños de los fragmentos de restricción que contienen secuencias relevantes generados por la digestión BamHI del ADN genómico de los padres y las cepas recombinantes, y puso de manifiesto en transferencias por hibridación con una copia 1,8 kb BamHI HIS3 genómica, se enumeran en pares de kilobases (kb). Los cromosomas no están dibujados a escala. B) Análisis físico de los supuestos teniendo translocación-clones. (1) El análisis genómico por Southern blot - El ADN genómico se recogió y se digirió con la endonucleasa de restricción BamHI, fraccionado por electroforesis en gel, blotted de nylon, y se hibridó con un 32 P-etiquetados 1,8 kb HIS3 sonda para visualizar los siguientes fragmentos: 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 ', 4 kb tiii:: XV, 5 kb TXV:: III, y 8 kb his3-Δ5. Carriles: a) diploide padres, b) Su + no recíprocas translocación recombinante, c) Su desplazamiento + recombinantes recíprocas. (2) geles CHEF - cromosomas intactos fueron preparados en los enchufes de agarosa, separados por el chef, teñido con bromuro de etidio y visualizados con luz ultravioleta. Carriles: Igual que el anterior. (3) manchas cromosómicas - los cromosomas separados fueron borrados de nylon y se hibridó con los 32 P-etiquetados 1,8 kb HIS3 sonda para visualizar los cromosomas: 1.1 Mb intacta cromosoma XV, 0,8 Mb TXV: cromosoma III translocación, 0,6 Mb tiii: translocación XV cromosoma, y ​​0,3 Mb intacto el cromosoma III. Carriles: Igual que el anterior.

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<li>Muller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-course+of+radiation-induced+chromosomal+aberrations+in+tumor+patients+after+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Radiation+Oncology+Biol.+Phys%22%5BJournal%5D)">Time-course of radiation-induced chromosomal aberrations in tumor patients after radiotherapy.</a> Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 63, 1214-1220 (2005).</li>
<li>Lin, F. L., Sperle, K., Sternberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+for+homologous+recombination+during+transfer+of+DNA+into+mouse+L+cells%3A+role+of+DNA+ends+in+the+recombination+process%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Model for homologous recombination during transfer of DNA into mouse L cells: role of DNA ends in the recombination process.</a> Mol. Cell. Biol. 4, 1020-1034 (1984).</li>
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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Altas dosis de radiación ionizante presente un riesgo inherente de la inestabilidad del genoma a través de la generación de un gran número de DSBs 19. Genomas eucariotas están repletos de secuencias repetitivas que son excelentes sustratos para la generación de translocaciones y reordenamientos genómicos otros 20,21. Translocaciones cromosómicas de recursos humanos se observan con frecuencia cuando DSBs se introducen entre las secuencias repetitivas 12,21,22. Hay pruebas abrumadoras que indican que gran parte de la inestabilidad genómica asociada con leucemias y linfomas se pueden atribuir a translocaciones cromosómicas, destacando la importancia de comprender cómo funciona este mecanismo se produce en las células eucariotas 22,23. Hemos desarrollado un sistema en ciernes levadura para examinar la formación de los cromosomas de translocación por el OSD inducida de recursos humanos entre las regiones cortas de homología en diferentes cromosomas que son similares en tamaño a los elementos repetitivos dispersos a lo largo de la levadura y el genoma humano. En el ensayo, el sustrato his3-Δ3 &quot;translocación se encuentra en una copia del cromosoma XV. El otro his3 alelo (his3-Δ200) tiene una deleción de ~ 1 kb del promotor y la secuencia codificante HIS3 que impide que esta secuencia sea utilizada como una plantilla para la reparación de 24. El sustrato his3-Δ5 &#39;se encuentra en el locus LEU2 en una copia del cromosoma III, con la otra copia del cromosoma III que contiene un alelo alterado LEU2 (Figura 1). A galactosa-inducible endonucleasa HO casete de expresión marcadas con KAN-MX se ha insertado en el locus del cromosoma trp1 IV (trp1:: GAL-HO-KAN-MX). Cada sustrato translocación está flanqueado por una secuencia de reconocimiento de endonucleasa HO-que pueden ser objeto de división mediante la inducción de la expresión del gen HO a través de la adición de galactosa en el medio. Después de HO-endonucleasa división inducida en el his3-Δ3 y his3-Δ5 &#39;sustratos, las células pueden usar eficientemente las vías compartidas por debajo de homología de secuencia HIS3 (311 pb o 60 pb) para reparar los cromosomas rotos de recursos humanos, la generación de un cromosoma por translocación con un alelo intacto HIS3 12-14,25. Debido a que las células madre carecen de una copia intacta del gen HIS3, que son incapaces de crecer en su medio. Sólo las células que han sufrido el evento translocación pueden ser seleccionados para el medio carece de histidina. Por lo tanto, la frecuencia de las translocaciones cromosómicas se puede calcular dividiendo el número de colonias prototróficas histidina por el número total de células viables plateado, determinado por la chapa en YPD. ADN genómico y los cromosomas intactos se pueden aislar de su representante colonias +, y la presencia de un cromosoma por translocación verificada por el sur de genómica y el análisis de cromosomas blot. Un cuidadoso análisis nos ha permitido obtener información adicional importante acerca de la prueba 12. El análisis genómico por Southern blot ha aportado pruebas de que existe el corte casi total de cromosomas XV y III después de 30 minutos de la endonucleasa HO-inducción, y por lo tanto no hay antecedentes importantes de cortar sustratos cromosómicas en la población (G. Manthey y Bailis A., resultados no publicados). Genómica análisis Southern blot y el cromosoma de su - los sobrevivientes indica que las células suelen perder uno, el otro, o ambos cromosomas cortar y seguir siendo viable (L. Liddell y Bailis A., resultados no publicados). Es importante destacar que la eficiencia de placas casi equivalente a un medio no selectivo, antes y después de la inducción de la expresión de HO-endonucleasa indica que ni la falta de reparación de los cromosomas rotos, ni el fracaso de la translocación de los cromosomas para mantener afecta a la capacidad de sobrevivir a la formación de OSD. Consistente con esto, la válvula de expansión: el cromosoma III translocación ha demostrado ser inestable en las células mitóticas en la ausencia de la selección. Esto fue demostrado por la creciente TXV:: III contiene su recombinantes + noche a la mañana no selectiva, placas colonias aisladas en placas no selectivos, y las planchas de réplica en un medio selectivo que carecen de histidina. Diez a 70% de las colonias que surgen de estas placas ha perdido la válvula de expansión:: translocación cromosómica III (N. Pannunzio y Bailis A., resultados no publicados). Translocación cromosomas generados por la exposición de infrarrojos en los seres humanos presentan una inestabilidad similar 26. Esto sugiere que la formación puede contribuir a la translocación de los primeros eventos en la tumorigénesis mediante la promoción de la pérdida de heterocigosidad. En segundo lugar, extensos análisis genéticos y moleculares sugieren que la SSA, un mecanismo eficiente y obligatoriamente no conservadora de recursos humanos, es el principal mecanismo de formación de recursos humanos por translocación después de la creación simultánea de DSBs en dos cromosomas 12,27,28. Esta es la consistent con la conclusión de que grandes dosis de resultado IR en una densidad de DSBs suficiente para crear saltos junto a varias secuencias repetitivas en el genoma de la levadura, y una alta frecuencia de formación de recursos humanos por translocación. En conjunto, estas observaciones sugieren que el efecto oncogénico de la exposición de infrarrojos en los seres humanos pueden, en parte, resultado de la reparación de DSBs por un mecanismo eficiente de los recursos humanos que genera desplazamientos que, a través de su inestabilidad intrínseca, promover los cambios genéticos que la tumorogénesis de lanzamiento. Dado que la radiación se usa a menudo para tratar el cáncer, reordenamientos del genoma que se derivan de la reparación de la radiación inducida DSBs puede contribuir a la generación de cánceres secundarios que aparecen con frecuencia en los pacientes. Así, este modelo nos puede ayudar a obtener una mejor comprensión de las bases genéticas y moleculares de una importante respuesta clínica al tratamiento IR.

cuantificación y análisis de la formación de ho-endonucleasa estimulado translocaciones cromosómicas por un solo capítulo recocido en saccharomyces cerevisiae</em

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

La variación genética es frecuentemente mediado por reordenamientos genómicos que se presentan a través de la interacción entre los dispersos elementos repetitivos presentes en cada genoma eucariótico. Este proceso es un mecanismo importante para la generación de la diversidad entre y dentro de los organismos 1.3. El genoma humano consta de aproximadamente 40% de secuencias repetitivas de origen retrotransposon, incluyendo una variedad de líneas y Sines 4. Eventos de intercambio entre estos elementos repetitivos puede dar lugar a reordenamientos del genoma, incluyendo desplazamientos, que pueden alterar la dosis génica y la expresión que puede resultar en enfermedades autoinmunes y cardiovasculares 5, así como el cáncer en los seres humanos 6-9. Intercambio entre los elementos repetitivos se produce en una variedad de maneras. Intercambio entre las secuencias que comparten perfecta (o casi perfecto) homología se produce mediante un proceso llamado recombinación homóloga (HR). Por el contrario, de extremos no homólogos de unión (NHEJ) utiliza poco o no-homología de secuencia para el intercambio de 10,11. El propósito principal de recursos humanos, en células mitóticas, es la reparación de roturas de doble cadena (DSB) generada endógenamente por la replicación del ADN aberrante y lesiones oxidativas, o por la exposición a las radiaciones ionizantes (RI), y otros agentes que dañan el ADN exógeno. En el ensayo que se describe aquí, DSBs se crean, simultáneamente limítrofes sustratos de recombinación en dos loci diferentes cromosomas en las células diploides por un galactosa-inducible HO-endonucleasa (Figura 1). La reparación de los cromosomas rotos genera translocaciones cromosómicas por solo hilo recocido (SSA), un proceso donde las secuencias homólogas adyacentes a los extremos cromosómicos son unidos covalentemente posterior al recocido. Uno de los sustratos, his3-Δ3 &quot;, contiene un 3 &#39;truncado HIS3 alelo y se encuentra en una copia del cromosoma XV en el lugar natal HIS3. El segundo sustrato, his3-Δ5, se encuentra en el locus LEU2 en una copia del cromosoma III, y contiene un 5 &#39;truncado HIS3 alelo. Ambos soportes están flanqueadas por un sitio de reconocimiento HO endonucleasa que pueden utilizarse para efectuar la incisión por la endonucleasa HO-. HO sitios de reconocimiento de endonucleasa de nativos con el locus MAT, en ambas copias del cromosoma III, se han suprimido en todas las cepas. Esto impide la interacción entre los sustratos de recombinación y otros extremos de los cromosomas rotos de interferir en el ensayo. La KAN-MX-marcada en galactosa inducible endonucleasa HO casete de expresión se inserta en el locus trp1 en el cromosoma IV. Los sustratos comparten 311 pb y 60 pb de la secuencia de codificación HIS3 que puede ser utilizado por la maquinaria de recursos humanos para la reparación de la SSA. Las células que utilizan estos soportes para reparar los cromosomas rotos por HR formar una intacta HIS3 alelo y una válvula de expansión:: translocación cromosómica III que pueden ser seleccionadas por la capacidad de crecer en medio carecen de histidina (Figura 2A). Frecuencia de translocaciones por el AR se calcula dividiendo el número de colonias prototróficas histidina que surgen en el medio selectivo por el número total de células viables que surgen después de placas diluciones adecuadas en un medio no selectivo (Figura 2B). Una variedad de mutantes de reparación del ADN se han utilizado para estudiar el control genético de la formación de desplazamiento por la SSA mediante este sistema 12-14.

El ensayo de translocación HO-estimulado monitores de una sola hebra de recocido después de la creación de ADN de doble filamento se rompe en múltiples loci en diploide<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Este mecanismo puede ser modelo de reordenamientos del genoma en las células somáticas de los eucariotas superiores después de la exposición a altas dosis de radiación ionizante.

Cuantificación y análisis de la formación de HO-endonucleasa Estimulado translocaciones cromosómicas por un solo capítulo recocido en Saccharomyces cerevisiae</em

La variación genética es mediada frecuentemente por reordenamientos genómicos que surgen a través de la interacción entre elementos repetitivos dispersos presentes en cada...

El objetivo general de este procedimiento es determinar el control genético de la formación de translocaciones mediante el plegamiento de cadenas sencillas en células diploides de levadura con brotamiento. Esto se logra primero inoculando cultivos con colonias individuales de un genotipo específico y cultivándolos durante la noche. El segundo paso del procedimiento consiste en inducir la formación simultánea de roturas de doble cadena mediante la endonucleasa Ho en dos cromosomas, añadiendo galactosa a los cultivos.A continuación, se siembran diluciones de estos cultivos en medios selectivos y no selectivos. El paso final consiste en determinar la frecuencia de translocación mediante el conteo de colonias que aparecen en los medios selectivos y no selectivos. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestren el control genético de la formación de translocaciones por cadena sencilla, un arrodillamiento a través de cambios en la frecuencia de formación de translocaciones inducidas por ho en cepas de diferentes genotipos.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia las consecuencias de la exposición a radiación terapéutica en pacientes con cáncer, ya que las roturas de doble cadena del ADN y la formación de translocaciones son las consecuencias principales de este tratamiento. Para comenzar el procedimiento destinado a determinar las frecuencias de translocación inducidas, inocule entre 10 y 20 cultivos independientes de un mililitro de medio de glicerol-lactato Y con colonias simples del genotipo deseado e incube los cultivos durante la noche a 30 grados Celsius en un rotador. Cuando los cultivos hayan alcanzado la densidad celular deseada, añada galactosa al 20 % a los cultivos hasta una concentración final del 2 %. La galactosa inducirá la expresión de la endonucleasa ho, que dirigirá roturas de doble cadena en el alelo his3δ5' del cromosoma tres y en el alelo his3δ3' del cromosoma 15; incube durante cuatro horas a 30 grados Celsius en un rotador.El siguiente paso es fundamental para el éxito del procedimiento. Es imprescindible una dilución y siembra cuidadosas de los cultivos. Si obtiene frecuencias de translocación suficientemente reproducibles como para permitir comparaciones estadísticamente significativas entre cepas de distinto genotipo, tras cuatro horas siembre la dilución adecuada de los cultivos en medio sin histidina, así como en YPD td, aproximadamente de 100 a 200 colonias por placa, e incube las placas a 30 grados Celsius durante dos o tres días.Cuando aparecen las colonias, se puede determinar la frecuencia de translocación. Las eficiencias de siembra antes y después de la inducción de la expresión de la endonucleasa ho indicarán si la presencia o ausencia de cualquiera de los cromosomas translocados afecta la capacidad de sobrevivir a la formación de roturas de doble cadena (DSB). Que fragmentan una copia de ambos cromosomas tres y cromosoma 15 para determinar las eficiencias de siembra previas a la inducción.Primero, retire una alícuota de células de cada cultivo nocturno y determine el número de células mediante el conteo con un hemocitómetro. A continuación, utilice una dilución adecuada para sembrar aproximadamente de 100 a 200 células en YPD e incube de dos a tres días a 30 grados Celsius hasta que aparezcan colonias. Añada 20 % de galactosa a los cultivos restantes hasta una concentración final de 2 % e incube a 30 grados Celsius durante cuatro horas para determinar la eficiencia de siembra posterior a la inducción.Retire un alícuota de células de cada cultivo tras cuatro horas de inducción y determine el número de células mediante un hemocitómetro. Siembre aproximadamente de 100 a 200 células en una placa usando una dilución adecuada en YPD e incube de dos a tres días a 30 grados Celsius hasta que aparezcan colonias. Una vez que surjan colonias en las placas, puede determinarse la eficiencia de siembra. Los clones portadores de translocaciones putativas pueden examinarse mediante hibridación Southern.Este procedimiento utiliza ADN genómico preparado a partir de una única colonia recombinante de his aislada de cada ensayo independiente. Se digiere aproximadamente cuatro microgramos de cada muestra de ADN con la endonucleasa de restricción BAM H1, se separan los fragmentos digeridos con BAM H1 en un gel de agarosa al 0,7 % y luego se transfieren a una membrana de nailon con carga positiva. La hibridación se realiza con una sonda marcada con P-32 obtenida por cebado aleatorio, utilizando un clon genómico de 1,8 KILOBASE BMH1 que contiene el gen HIS3. Se visualizan los fragmentos de ADN mediante autorradiografía o imagen fosforescente. Otra forma de analizar los clones portadores de translocaciones putativas es mediante el análisis de cariotipo cromosómico.Primero se preparan los cromosomas a partir de recombinantes hiss positivos en tapones de agarosa, separando los cromosomas en un gel de agarosa al 1 % en un campo eléctrico homogéneo con fijación de contorno o CHEF a 14 grados Celsius. Se utilizan los siguientes parámetros: primer bloque a 14 grados Celsius, tiempo de conmutación de 72 segundos y 15 horas a seis voltios por centímetro; segundo bloque a 14 grados Celsius, tiempo de conmutación de 122 segundos y 11 horas a seis voltios por centímetro. Al finalizar la electroforesis, se visualizan los cromosomas tiñendo el gel con bromuro de AUM durante 30 minutos, seguido de irradiación con luz ultravioleta y revelado, y se transfiere el agua destilada a una membrana con carga positiva mediante acción capilar.Bajo condiciones desnaturalizantes, se hibridiza con una sonda marcada con P 32 obtenida por cebado aleatorio con un clon genómico de 1,8 kilobases bam H uno bam H uno que contiene el hiss. Tres genes visualizan cromosomas mediante auto radiografía o imagen fosforescente. La frecuencia de translocaciones cromosómicas puede calcularse dividiendo el número de colonias fototróficas de histamina entre el número total de células viables determinado mediante siembra en YPD.En este ejemplo, la frecuencia de recombinación calculada es de aproximadamente 3%. El ensayo para frecuencias de translocación estimuladas por ho puede realizarse utilizando cepas de diferentes genotipos para comparar las diferencias en la capacidad de reparar roturas de doble cadena por medio de cadena sencilla. Una inclinación como la mostrada en esta gráfica representativa. Las frecuencias de translocación obtenidas tanto selectiva como no selectivamente con el homocigoto nulo delta RAD 51 fueron estadísticamente diferentes de las obtenidas utilizando las condiciones correspondientes con la cepa silvestre, tanto antes como después de la siembra inducida.Los rendimientos se determinan dividiendo el número total de células formadoras de colonias viables por el número total de cuerpos celulares en el cultivo, determinado mediante recuento con hemocitómetro, como se muestra en esta tabla antes y después del siembra post-inducción. Los rendimientos no fueron significativamente diferentes para las células de tipo salvaje, lo que sugiere que la presencia o ausencia de cualquiera de los cromosomas de translocación no afecta la capacidad de supervivencia. Formación de roturas de doble cadena (DSB).Los clones portadores de translocaciones putativas pueden examinarse mediante análisis de hibridación genómica Southern blot. Aquí se muestra una representación gráfica de los cromosomas relevantes antes y después de la formación de la translocación. Los tamaños de los fragmentos de restricción que contienen las secuencias relevantes, generados por digestión con BAM H uno del ADN genómico de cepas parentales y recombinantes, se revelan en las hibridaciones mediante un fragmento de 1,8 kilobases de BAM H uno.Sus tres clones genómicos se enumeran en pares de kilobases para el análisis por blot de Southern. El ADN genómico se digiere con la endonucleasa BMH I y se hibrida con una sonda de 1,8 kilobases marcada con P 32. La sonda HIS tres permite visualizar estos fragmentos diagnósticos.Fragmentos de 0,8 kilobases de HIS tres delta 201,7 kilobases de hiss tres delta tres prima, 4 kilobases de T 3 15, 5 kilobases de T 15 tres y 8 kilobases de hiss tres delta cinco prima. La pista A es el diploide parental. La pista B es un recombinante con translocación no recíproca hiss más, y la pista C es una translocación recíproca his más.El análisis recombinante de cromosomas mediante BLO también puede emplearse para examinar clones portadores de translocaciones. Los cromosomas intactos preparados en tapones de agarosa se separan mediante electroforesis CHEF y el gel se tiñe con bromuro de iridio y se visualiza bajo luz ultravioleta. Luego, los cromosomas separados se transfieren a nylon e hibridan con la sonda de 1,8 kilobases marcada con P-32.Sus tres sondas permiten visualizar el cromosoma 15 intacto de 1,1 megabase, el cromosoma de translocación T15:3 de 15,8 megabases, el cromosoma de translocación T3:15 de 0,6 megabase y el cromosoma 3 intacto de 0,3 megabase. La línea A corresponde al progenitor desplegado. La línea B es A his más recombinante con translocación no recíproca, y la línea C es A his más recombinante con translocación recíproca.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar la frecuencia de formación de translocaciones tras múltiples roturas de doble cadena inducidas por ho.

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Cuantificación y análisis de la formación de HO-endonucleasa Estimulado translocaciones cromosómicas por un solo capítulo recocido en Saccharomyces cerevisiae /em (Video) | JoVE Journal

Cuantificación y análisis de la formación de HO-endonucleasa Estimulado translocaciones cromosómicas por un solo capítulo recocido en Saccharomyces cerevisiae

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