Cuantificación y análisis de la formación de HO-endonucleasa Estimulado translocaciones cromosómicas por un solo capítulo recocido en Saccharomyces cerevisiae

El objetivo general de este procedimiento es determinar el control genético de la formación de translocaciones por arrodillamiento monocatenario en células de levadura diploides en gemación. Esto se logra primero inoculando cultivos con colonias individuales de un genotipo específico y cultivándolos durante la noche. El segundo paso del procedimiento consiste en inducir la formación simultánea de roturas de doble cadena por endonucleasa en dos cromosomas mediante la adición de galactosa a los cultivos.

A continuación, la dilución de estos cultivos se siembra en medios selectivos y no selectivos. El paso final es determinar la frecuencia de translocación mediante el recuento de las colonias que surgen en medios selectivos y no selectivos. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el control genético de la formación de translocaciones por cadena única, un arrodillamiento a través de cambios en la frecuencia de formación de translocaciones estimuladas en cepas de diferentes genotipos.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia las consecuencias de la exposición terapéutica a la radiación de los pacientes con cáncer, ya que las roturas de doble cadena del ADN y la formación de translocaciones son las principales consecuencias de este tratamiento. Para comenzar el procedimiento de determinación de las frecuencias de translocación estimuladas, inocule de 10 a 20 cultivos independientes de un mililitro de medio de lactato de glicerol pico Y con colonias individuales del genotipo deseado, incube los cultivos durante la noche a 30 grados Celsius en un rotador. Cuando los cultivos hayan alcanzado la densidad celular deseada, agregue 20% de galactosa a los cultivos hasta una concentración final de 2%La galactosa inducirá la expresión de la endonucleasa ho, que dirigirá las roturas de doble cadena en la historia del alelo delta cinco prim en el cromosoma tres y tiene tres alelos delta tres prim en el cromosoma 15 incubar durante cuatro horas a 30 grados Celsius en un rotador.

El siguiente paso es fundamental para el éxito del procedimiento. Es imprescindible una dilución y un recubrimiento cuidadosos de los cultivos. Si se obtuvieran frecuencias de translocación que sean lo suficientemente reproducibles como para permitir comparaciones estadísticamente significativas entre cepas de diferentes genotipos: después de cuatro horas de dilución apropiada de los cultivos en un medio que carece de histidina, así como en YPD td aproximadamente de 100 a 200 colonias por placa, incubar las placas a 30 grados Celsius durante dos o tres días.

Cuando surgen colonias, se puede determinar la frecuencia de translocación. Las eficiencias de la siembra antes y después de la inducción de la expresión de endonucleasas ho indicarán si la presencia o ausencia de cualquiera de los cromosomas de translocación afecta la capacidad de sobrevivir a la formación de DSB. Eso fragmenta una copia de ambos cromosomas tres y cromosoma 15 para determinar la eficiencia de la siembra previa a la inducción.

Primero, extraiga una alícuota de células de cada cultivo nocturno y determine el número de células contando con un hemocitómetro. A continuación, use una dilución adecuada para colocar aproximadamente de 100 a 200 células en la incubación de YPD durante dos o tres días a 30 grados centígrados hasta que surjan las colonias. Agregue 20% de galactosa a los cultivos restantes hasta una concentración final de 2% e incube a 30 grados centígrados durante cuatro horas para determinar la eficiencia del recubrimiento posterior a la inducción.

Extraer una alícuota de células de cada cultivo después de cuatro horas de inducción y determinar el número de células mediante hemocitómetro Placa de recuento de aproximadamente 100 a 200 células utilizando una dilución adecuada en YPD incubar durante dos o tres días a 30 grados Celsius hasta que surjan las colonias. Una vez que surgen colonias en las placas, se puede determinar la eficiencia del recubrimiento. Los clones putativos portadores de translocación pueden examinarse mediante Southern blot.

Este procedimiento utiliza ADN genómico preparado a partir de un solo silbido más una colonia recombinante de cada ensayo independiente, digiere aproximadamente cuatro microgramos de cada muestra de ADN con BAM H, una endonucleasa de restricción, BAM H separada y uno fragmentos digeridos en un 0,7% de ella y luego se transfiere a una membrana de nailon cargada positivamente hibridada con una sonda marcada con P 32 obtenida por cebado aleatorio con un BMH de 1,8 KILOBASE, un BMH, un clon genómico que contiene el HIS tres genes. Visualice fragmentos de ADN mediante autorradiografía o imágenes de fósforo. Otra forma de examinar los clones portadores de translocaciones putativas es mediante el análisis de diagramas cromosómicos.

Los cromosomas se preparan primero a partir de silbidos seleccionados más recombinantes en tapones aros, cromosomas separados en un gel 1%aros en un campo eléctrico homogéneo sujetado por contorno o chef a 14 grados centígrados. Se utilizan los siguientes parámetros: primer bloque 14 grados centígrados, 72º tiempo de conmutación y 15 horas a seis voltios centímetro, segundo bloque, 14 grados centígrados, 122º tiempo de conmutación y 11 horas a seis voltios por centímetro. Al finalizar la electroforesis, visualice los cromosomas tiñendo el gel con bromuro AUM durante 30 minutos, seguido de la irradiación con UV y la retención y el agua destilada transfieren los cromosomas a una membrana cargada positivamente por acción capilar.

Las condiciones de desnaturalización se hibridan con la sonda marcada con P 32 obtenida por cebado aleatorio con un clon genómico de 1,8 kilobases bam H, un bam H que contiene el silbido. Tres genes visualizan los cromosomas mediante autorradiografía o imágenes de fosfo. La frecuencia de las translocaciones cromosómicas se puede calcular dividiendo el número de colonias fototróficas de histamina por el número total de células viables determinado por siembra en YPD.

En este ejemplo, la frecuencia de recombinación calculada es de aproximadamente el 3%El ensayo para las frecuencias de translocación estimuladas ho se puede realizar utilizando cepas de diferentes genotipos para comparar las diferencias en la capacidad de reparar roturas de doble cadena por una sola cadena. Un arrodillamiento como se muestra en este gráfico representativo. Las frecuencias de translocación obtenidas tanto selectivamente como no selectivamente con el homocigoto nulo delta RAD 51 fueron estadísticamente diferentes de las obtenidas utilizando las condiciones correspondientes con la cepa de tipo salvaje tanto antes como después de la inducción.

Las eficiencias se determinan dividiendo el número total de células viables formadoras de colonias por el número total de cuerpos celulares en el cultivo, determinado por el recuento de hemocitómetros, como se muestra en esta tabla, antes y después de la siembra inducción. Las eficiencias no fueron significativamente diferentes para las células de tipo salvaje, lo que sugiere que la presencia o ausencia de cualquiera de los cromosomas de translocación no afecta la capacidad de supervivencia. Formación de DSB.

Los clones putativos portadores de translocación pueden examinarse mediante análisis genómico de Southern blot. Aquí se muestra una representación gráfica de los cromosomas relevantes antes y después de la formación de la translocación. Tamaños de los fragmentos de restricción que contienen secuencias relevantes generadas por la digestión de BAM H en una digestión de ADN genómico de cepas progenitoras y recombinantes y reveladas en blots por hibridación con una BAM H de 1,8 kilobases.

Sus tres clones genómicos se enumeran en pares de kilobases para el análisis de Southern blot. El ADN genómico se digiere con la endonucleasa BMH one y se hibrida a una P 32 marcada con 1,8 kilobases. Tres sondas HIS para visualizar estos fragmentos de diagnóstico.

0.8 kilobase HIS tres delta 201.7 kilobase silbido tres delta tres primos cuatro kilobase T 3 15 5 kilobase T 15 tres y ocho kilobase silbido tres delta cinco fragmentos primos. El carril A es el diploide principal. El carril B es un silbido más translocación no recíproca recombinante y el carril C es una translocación recíproca his plus.

El análisis de BLO cromosómico recombinante también se puede emplear para examinar clones de portadores de translocación. Los cromosomas intactos preparados en tapones aros se separan por electroforesis y el gel se tiñe con un bromuro de iridio y se visualiza bajo luz ultravioleta. A continuación, los cromosomas separados se transcriben a nailon y se hibridan con el P 32 marcado con 1,8 kilobases.

Su sonda de tres para visualizar el cromosoma 1.1 megabase intacto, el cromosoma 15.8 megabase T 15 de tres translocaciones de tres cromosomas de translocación, el cromosoma de translocación de 15 megabases T y el cromosoma de translocación de 1.3 megabases intacto tres. El carril A es el padre desplegado. El carril B es recombinante con translocación no recíproca A y el carril C es recombinante con translocación recíproca para bis.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar la frecuencia de formación de translocaciones después de múltiples roturas de doble cadena estimuladas.