Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 2:53 min. • April 28th, 2025
Tome una sección de cerebro de ratón fijada con tetróxido de osmio incrustada en un bloque de resina.
Obtenga una imagen de sección y alinéela con una imagen de atlas preparada previamente para identificar la región de interés.
Marque los límites de esta región en el bloque.
Calienta la resina para ablandarla y extirpar la región marcada.
Pegue la muestra a una barra de sujeción de vidrio y recórtela.
Con un ultramicrotomo, prepare secciones semifinas y ultrafinas.
Transfiera las secciones semifinas y ultrafinas a soportes de vidrio y rejillas de níquel, respectivamente.
Tiñe las secciones semifinas con un tinte que se une a los ácidos nucleicos, al citoplasma rico en ribosomas y a la matriz extracelular.
Lave las secciones y examínelas bajo un microscopio óptico para confirmar la presencia del área objetivo.
Observe las secciones ultrafinas bajo un microscopio electrónico de transmisión.
El tetróxido de osmio mejora la densidad de electrones de las membranas celulares y de orgánulos, proporcionando un alto contraste con el citoplasma menos denso en electrones, lo que permite la visualización de la ultraestructura celular.
Para representar cartográficamente un área de interés, seleccione una imagen que contenga el área de interés del atlas de imágenes preparado anteriormente. Cree un boceto de los bordes del área de interés en la imagen seccionada. Superponga ópticamente estos bordes en la muestra incrustada bajo el microscopio y use una aguja de calibre 26 de una pulgada para rayar estos bordes regionales en la muestra de resina. Luego, caliente las muestras a 95 grados centígrados para ablandar la resina.
A continuación, saque las muestras de resina tibia del horno y use una cuchilla de afeitar para extirpar las áreas de interés. Pegue las muestras en barras de sujeción de vidrio acrílico del calibre apropiado y recorte las muestras montadas para secciones semi y ultrafinas. Utilice un ultramicrotomo para adquirir secciones semifinas de 0,7 micrómetros y ultrafinas de 70 nanómetros, recogiendo las secciones semifinas en soportes de vidrio y las secciones ultrafinas en rejillas de níquel.
Tiña las secciones semifinas con azul de toluidina al 1% en PBS durante cuatro minutos, seguido de varios lavados en agua desionizada antes de examinar las secciones con microscopía óptica. Las secciones ultrafinas pueden evaluarse directamente mediante microscopía electrónica de transmisión a 180 kilovoltios, sin más modificaciones.