Microscopía holográfica de dos fotones para estudiar la actividad neuronal y la conectividad en un modelo de ratón

Comience con un ratón despierto colocado bajo un microscopio holográfico de dos fotones integrado con moduladores de luz espacial o SLM.

El ratón sostiene una placa de cabeza preimplantada.

En el cerebro del ratón, las neuronas expresan canales sensibles a la luz roja e indicadores de calcio fluorescentes verdes que se unen a los iones de calcio.

Para estudiar la actividad neuronal y la conectividad, establezca los parámetros de imagen.

Use un láser de 920 nanómetros para excitar los indicadores unidos al calcio dentro de las neuronas. Capture la imagen de fluorescencia de la neurona con un fotodaño mínimo.

Restablezca los parámetros de imagen y enfoque un rayo láser de infrarrojo cercano.

Los SLM dan forma al rayo láser en patrones holográficos precisos que permiten un enfoque selectivo en las neuronas objetivo en múltiples puntos.

Esto estimula los canales sensibles a la luz, provoca la afluencia de iones de calcio y mejora la fluorescencia de las neuronas objetivo.

Las neuronas diana activadas transmiten señales a las neuronas conectadas y aumentan la fluorescencia de la neurona conectada.

Nuevamente, capture una imagen de dos fotones. Un aumento de la fluorescencia en las neuronas diana y conectadas confirma la actividad neuronal y la conectividad.

Después de colocar el mouse bajo el microscopio y realizar imágenes de dos fotones, abra el software de imágenes comercial. En el modo de imágenes en vivo, ajuste el voltaje del detector de imágenes y la potencia del láser de imágenes, para optimizar el brillo de las neuronas que expresan GCaMP6m-P2A-ChRmine. Capture imágenes de las neuronas que expresan estas proteínas y luego ilumine las neuronas específicas siguiendo el procedimiento mostrado anteriormente.

Para investigar la conectividad funcional dentro de las neuronas de capa 2 y 3, use un modulador de luz espacial para generar patrones holográficos de estimulación optogenética. Y combínelo con imágenes de calcio de dos fotones. Ajuste la intensidad del láser de imagen a 920 nanómetros a 10 a 20 milivatios y el campo de visión a 256 micrómetros por 256 micrómetros. Medido a una profundidad de 100 a 150 micrómetros de la superficie cortical.

Establezca el tiempo de permanencia de píxeles en 1,5 microsegundos para 2 hercios o 100 nanosegundos para 30 hercios. Use 2 Hertz y 30 Hertz como velocidad de fotogramas de imagen para ver si un solo estímulo holográfico causó una respuesta de calcio en las neuronas. Establezca la intensidad del láser de estimulación holográfica que estimula una sola neurona en 10 milivatios, lo que es suficiente para inducir la actividad neuronal.

Simultáneamente, obtenga imágenes de la respuesta de iones de calcio a 920 nanómetros, con 10 estímulos holográficos a 1.040 nanómetros y intervalos de ocho segundos durante una duración de 50 milisegundos después de un período de referencia de 10 segundos.