Microinyección estereotáctica de un vector viral para la manipulación génica en un cachorro de ratón estriado

Tomemos un cachorro de ratón modificado genéticamente que lleva un casete STOP flanqueado por loxP que bloquea la expresión de proteína fluorescente roja o RFP.

Asegure al cachorro en un marco estereotáxico hecho a medida y cúbralo con hielo para mantener la anestesia.

Desinfecte el cuero cabelludo y marque lambda como punto de referencia.

Alinee la aguja de inyección con las coordenadas estriatales en relación con lambda y perfore el cráneo.

Retraiga la aguja a la superficie del cráneo, luego insértela en la profundidad objetivo.

Inyecte el vector viral mezclado con colorante en el cuerpo estriado a una velocidad controlada. El vector codifica proteínas fluorescentes verdes o GFP y Cre recombinasa.

Retire la aguja lentamente para evitar el reflujo de la solución.

Retire al cachorro y permita la recuperación.

En las células estriatales, el virus libera su genoma, lo que permite la expresión de Cre recombinasa y GFP. Cre extirpa el casete STOP flanqueado por loxP, activando la expresión RFP.

La expresión simultánea de GFP y RFP confirma la manipulación exitosa de genes.

Coloque al cachorro con el guante en la bandeja para la cabeza y coloque un poco de hielo picado alrededor de la manga de látex para mantener la anestesia por hipotermia. Luego frote la cabeza del cachorro con etanol al 70% y ubique el punto de referencia lambda. Márcalo con un marcador. Luego apunte la punta de la aguja a la lambda y establezca las coordenadas laterales anterior, posterior y medial en cero.

A continuación, consultando un atlas cerebral, mueva el brazo de inyección al sitio objetivo. Por ejemplo, el cuerpo estriado de las crías P2 es 2,4 milímetros anterior a la lambda, 1,0 milímetros a cada lado de la línea media y 1,7 milímetros ventral. A continuación, marque la posición del tinte verde rápido en el tubo PE10 con un bolígrafo. Luego, comience lentamente a penetrar la aguja a través de la piel y el cráneo hasta que la punta de la aguja entre en contacto con la superficie del cráneo.

Establezca la coordenada ventral dorsal como cero. Luego baje la aguja lentamente hasta el sitio objetivo. Una vez en posición, espere un minuto para permitir que el parénquima vuelva a su forma normal. Luego ejecute el programa de microinyección a 100 nanolitros por minuto. Durante la inyección, observe cómo se mueve el tinte verde rápido en el tubo de PE.

Es fundamental penetrar lentamente la aguja a través de la piel y el cráneo hasta que la punta de la aguja entre en contacto con la superficie del cráneo. Durante la inyección, es imperativo observar cómo se mueve el tinte Fast Green en el tubo de PE.

Una vez completada la inyección, espere un minuto y luego suba lentamente la aguja a la mitad de la profundidad de DV penetrada. Luego espere otros 30 segundos antes de proceder con la retirada lenta de la aguja de la cabeza del cachorro.

Después de completar la inyección, es importante esperar un minuto antes de subir lentamente la aguja a la mitad de la profundidad DV penetrada, luego esperar otros 30 segundos antes de retirar lentamente la aguja de la cabeza del cachorro.

Después de inyectar todos los sitios objetivo, caliente al cachorro durante 20 minutos en una incubadora a 33 grados centígrados.

Revise al cachorro cada cinco minutos hasta que haya recuperado la decúbito esternal. Luego devuelva al cachorro a su madre.