Captura de células utilizando un dispositivo de microfluidos

Los dispositivos, tal como los preparamos, se empaquetan en kits de 10 o 20, y cuando llegan, se envían fríos en una caja y el kit contiene todos los componentes que necesita para funcionar. El experimento en el kit es, es un paquete con todas las jeringas y tampones, que pueden permanecer a temperatura ambiente. También hay una copia del protocolo que vamos a seguir en este experimento.

También hay una caja refrigerada, que contiene los dispositivos reales y todos los búferes de funcionamiento que deben refrigerarse. Por lo general, los kits se empaquetan en grupos de 10 o 20. Cuando no estén en uso, los kits deben refrigerarse.

Cada jeringa y cada componente del kit está cuidadosamente etiquetado y las etiquetas corresponden a la tabla del protocolo que seguimos. Por lo tanto, no hay ambigüedad en cuanto a qué jeringa o componente del kit se debe usar en los pasos individuales. Después de desempacar los dispositivos y colocarlos en un gabinete de seguridad biológica, realizaremos el procedimiento de aislar los neutrófilos y lisarlos para aplicaciones genómicas posteriores porque vamos a ser, porque la vida salvada que obtengamos se utilizará para aislar o extraeremos el ARN del lisado celular.

Por eso, queremos asegurarnos de que nuestra área esté limpia, no solo en el sentido estéril, sino también limpia de cualquier ARN que esté presente típicamente en el medio ambiente. Por lo tanto, es muy importante limpiar toda su área y sus dispositivos con la solución que destruye los ARN. Por lo tanto, por lo general, limpiaremos todas nuestras herramientas y nuestras superficies de trabajo con ARN SAP o ARN, que puede obtener de varios fabricantes.

El dispositivo viene empaquetado en una bolsa termosellada. Cada dispositivo está sellado y con código de barras. Debería, debe tomar nota de este código de barras si está trabajando con muestras clínicas.

Por lo tanto, el dispositivo se desprecinta, se quita la tapa y se coloca en el dispositivo del colector de retención de la bomba. La muestra de sangre que utilizamos es una muestra de sangre completa. Vamos a fluir a través de la jeringa BD estándar de una milésima de pulgada, y esta está etiquetada como jeringa uno.

Por lo general, lo que se hace es retirar la jeringa del paquete y quitar cuidadosamente la tapa del tubo de sangre. Y lo que haces es dejar caer 700 microlitros o 0,7 milésimas de pulgada de sangre e inyectar la mitad de eso o 350 microlitros en un tubo de 1,5 milésimas de pulgada. Gracias. De esa manera, su sangre puede pasar para su posterior procesamiento.

Su tubo de sangre puede ser transmitido y, sin embargo, aún le queda más sangre en caso de que falle un dispositivo. Así que ahora lo que vamos a hacer es cargar la jeringa que tiene sangre en ella, en, en esta aguja, que está conectada a un trozo de tubo con este dispositivo. Queremos estar muy, con, con el dispositivo de aislamiento microfluídico.

Queremos tener mucho cuidado de no introducir burbujas de aire en el dispositivo o, o el dispositivo funcionará mal. Por lo general, lo que hacemos es tomar la jeringa y empujar el émbolo hacia abajo y agregar el líquido a la superficie superior del dispositivo, asegurándonos de que esté completamente encajado antes de haber expulsado todo el líquido. Nos detenemos y retiramos con cuidado el cuerpo de la jeringa de la aguja y, básicamente, llenamos la punta de la aguja o el conector de señuelo de la aguja con el tampón restante que está en esta jeringa.

Nosotros nos deshacemos de eso. Luego vamos a tomar nuestra jeringa con sangre y la vamos a insertar en este centro de señuelos. Tener cuidado de no derramar la sangre y tener cuidado de no introducir burbujas de aire.

Lo mejor es usar un kemo que sostenga el cuerpo de la jeringa y el tubo en caso de que se derrame sangre. Una vez conectada la jeringa a la carcasa del tubo o a la aguja, le damos unos golpecitos bruscos para eliminar las burbujas de aire que pueda haber en el conector. A continuación, esta jeringa se carga en la bomba de jeringa y luego se asegura con el tornillo de bloqueo.

La bomba de jeringa está encendida y ya está preestablecida para nuestras condiciones de flujo. Vamos a hacer fluir esta sangre a través del dispositivo a 30 microlitros por minuto. Una vez que el cuerpo de la jeringa esté cargado en la bomba de la jeringa, presionaremos el botón en el brazo móvil del émbolo y lo deslizaremos hacia abajo hasta que toque la parte superior del émbolo y comience a empujar el líquido a través de la punta de este.

Es una aguja de acero inoxidable de punta roma. Una vez que sepamos que el sistema está preparado, vamos a pulsar ejecutar. Para iniciar el flujo de sangre, presionas stop para detenerlo y luego tomas un tubo de centrífuga limpio de 1.5 mil o un tubo fendor y vamos a desenchufar con cuidado.

Desconecte solo uno, desconecte el tubo de un puerto del dispositivo. Una vez que este tubo esté desenchufado, lo insertaremos en el tubo fendor de 1.5 milésimas de pulgada. Pulsaremos correr para iniciar de nuevo el flujo sanguíneo.

Y cuando vemos que se forma una gota de sangre, detenemos la bomba y la insertamos en la entrada que acabamos de abrir en el dispositivo. Pulsaremos run para iniciar el flujo de sangre y pondremos un temporizador de cinco minutos. Queremos asegurarnos de que la sangre llene por igual todas las cámaras y que no haya burbujas de aire evidentes en el dispositivo.

Si hay burbujas de aire que bloquean el flujo hacia cualquiera de las cámaras, puede tomar un par de pinzas y pasarlas a lo largo de los pequeños canales que conducen a las cámaras de captura o los pequeños canales que salen de las cámaras de captura. Este dispositivo se está llenando muy bien, por lo que después de cinco minutos, presiona detener la bomba de jeringa para detener el flujo de sangre, afloja la pinza de la jeringa y la saca del soporte de la bomba de jeringa. Luego vamos a usar la jeringa número tres, que está cargada con PBS libre de nucleasa. Vamos a usar, básicamente vamos a, nuevamente, asegurarnos de que la superficie del dispositivo esté unida para evitar burbujas de aire, golpearemos la jeringa para hacer alguna, asegúrese de que las burbujas de aire estén en la parte superior del cuerpo de la jeringa.

Afloje el brazo de la bomba de jeringa e inserte la jeringa de tres molinos en la bomba. Apriételo y luego empuje el émbolo hacia abajo hasta que toque el émbolo de la jeringa. Pulsamos correr y esperamos a que el líquido cebe el dispositivo y esperamos a que vea una gota en la punta de la aguja de acero inoxidable.

Cuando vea que se forma una gota, detenga la bomba. Vamos a sacar la sangre, la punta de acero inoxidable que tiene la sangre. Vamos a insertar el tampón de lavado y pulsamos ejecutar.

Y vamos a dejar que esto se ejecute durante cinco minutos. Y debe tomar una toallita limpia y simplemente limpiar cualquier pequeña cantidad de sangre, que puede estar en la entrada o en la salida durante Después de cinco minutos de ejecutar el tampón de lavado a través del dispositivo, el dispositivo debe estar completamente limpio de sangre y puede ver que, básicamente, no quedará sangre roja en el dispositivo, El dispositivo se verá claro. Entonces, lo que vamos a hacer es que después de los cinco minutos, vamos a detener el tampón de lavado para que no funcione.

Y de nuevo, vamos a quitar la jeringa de la bomba de la jeringa. Vamos a tapar el tubo de microcentrífuga de 1,5 milésimas de pulgada, justo en el tubo de salida flexible. Y vamos a levantar cuidadosamente el tubo, el tubo de micro centrífuga, sacando el tubo de desecho del dispositivo.

Vamos a tirar eso en un contenedor de riesgo biológico. En el kit hay un nuevo tubo de salida, que en realidad está hecho de teflón. Tiene, de nuevo, una punta de acero inoxidable.

Vamos a reemplazar el tubo de salida viejo con este nuevo tubo de salida. Vamos a tomar ese tubo de salida y vamos a tratar de doblarlo alrededor de una especie de U o una forma de V. Y luego también con el kit hay una columna trituradora de kaya, esta corta el ADN y básicamente homogeneiza la vida de su célula.

Así que vamos a abrir la tapa púrpura de la columna de la trituradora y colocar el tubo de salida en la columna de la trituradora Kay. Vamos a sacar del kit la jeringa número dos, que dice, para RLT la vamos a usar. Es una jeringa BD estándar de una milésima de pulgada con una punta roma de calibre 22, acero inoxidable.

Vamos a usar eso para inyectar 350 microlitros de RLT estándar de kyogen en el dispositivo. Debido a que el dispositivo tiene un volumen muerto de unos 50 microlitros, lo que queremos hacer es inyectar el RLT, pero detrás del RLT, queremos inyectar un tapón de aire, para liberar ese volumen muerto del dispositivo en la columna de la trituradora de chi. Así que la forma en que lo haremos es que tomaremos nuestra jeringa, tiraremos, extraeremos 350 microlitros de aire y luego seguiremos con 350 microlitros o 0,35 milésimas de pulgada de RLT y el RLT ahora está en el fondo de la jeringa.

Resista la tentación de voltear la jeringa e inyectar el aire. El aire está ahí para asegurarse de que metemos todo el RLT en nuestra columna trituradora Kay. Vamos a sacar el tubo que está en el tampón de lavado.

Vamos a insertar nuestra jeringa con el RLT y vamos a inyectar lentamente el RLT en el dispositivo durante un período de unos 30 segundos, asegurándonos de que el tubo de salida esté expulsando sus desechos en la columna de la trituradora de chi. Una vez que el aire comienza a inyectarse en el dispositivo, empuja hacia abajo la pluma y espera a que todo el líquido se libere en la columna Kay Shredder. Encendemos la columna trituradora y la hacemos girar en una espoleta de microcentro con un equilibrio de 15, 000 RPM o RPM máximas en un fusible de microcentro de sobremesa durante dos minutos.

Entonces, después de girar la columna durante dos minutos, vamos a sacar la muestra de ella, que ahora está en RLT y la colocaremos en uno de los viales criogénicos de tapa púrpura suministrados. Si está trabajando con una muestra clínica, muestree estos viales criogénicos, lo etiquetará al comienzo del experimento. Aquí está el lisado en el frasco criogénico.

Este vial criogénico se coloca inmediatamente en un congelador de CA a menos 80 grados y se almacena para su envío o extracción posterior de ARN. Por lo tanto, este es un protocolo alternativo para el aislamiento de neutrófilos. En lugar de lisar las células con tampón RLT, vamos a teñirlas con una tinción histológica estándar.

Una mancha. Así que sacamos el dispositivo sellado de la bolsa y lo volvemos a desenvolver, anotamos el número de lote en el dispositivo y colocamos la placa de Petri. En el soporte de la placa de Petri.

Vamos a sacar la jeringa de una milésima de pulgada de su jeringa de bolsa número uno, la vamos a cargar con 700 microlitros de sangre e inyectar la mitad de 350 microlitros en un tubo de DPH eend. Dejaremos eso a un lado. Tome la jeringa cuatro, que tiene el tubo que usaremos para seleccionar, inyectar la sangre en el dispositivo.

Va a sostener la base de la aguja desde la punta del tubo de una manera química. Quítale el cuerpo de la jeringa y llena el señuelo. El adaptador almacenaría en búfer y desecharía esa jeringa.

Insertaremos la jeringa que contiene sangre en la aguja usando la toallita química para recoger cualquier derrame. Golpearemos la jeringa para eliminar las burbujas de aire en la conexión entre la aguja y el cuerpo de la jeringa. Cargaremos la jeringa en la bomba de jeringa, cebaremos el tubo empujando hacia abajo el brazo móvil de la bomba de jeringa.

Desconectaremos el tubo de una de las salidas del dispositivo, el dispositivo de captura, y lo colocaremos en un tubo einor de 1,5 milésimas de pulgada. Y luego comenzaremos a hacer fluir la sangre empujando la bomba de la jeringa. Esperaremos a que se forme una gota de sangre en la punta de acero inoxidable.

Una vez que se forma la gota, presione detener, frote esa sangre, insértela en el dispositivo y presione ejecutar. Ahora configuramos un temporizador para cinco minutos. Bien, después de fluir a través del dispositivo durante cinco minutos, presione detener la bomba de jeringa y suelte la jeringa.

Y vamos a reemplazar esa jeringa con la jeringa de tres milésimas de pulgada que contiene nuestro tampón de lavado, que es solo un XPBS. Nuevamente, queremos asegurarnos de que la parte superior del dispositivo esté unida y luego vamos a quitar la punta de la aguja que contiene sangre o más. Comience a cebar el dispositivo.

Vamos a formar gotitas, lo insertamos en el dispositivo y presionamos para eliminar la sangre en la entrada o en el tubo de salida y lo dejaremos fluir durante cinco minutos después del paso de lavado. Nuevamente, detendremos la bomba de jeringa y retiraremos la jeringa del soporte de la bomba. Para hacer el sostenimiento GIM estándar, primero vamos a fijar las células y deshidratarlas usando metanol al 100%.

Así que tenemos una jeringa, una jeringa de tres milésimas de pulgada precargada con metanol. Nuevamente, vamos a cebar la jeringa, asegurarnos de que el metanol esté fluyendo, detener la bomba de la jeringa, insertarla en el dispositivo y presionar ejecutar. Vamos a fijarlos en esta solución de metanol durante dos a cuatro minutos.

Entonces, después de dos a cuatro minutos de fijación y metanol, detenemos la bomba, liberamos la jeringa con metanol y aquí vamos a cargar una jeringa, una jeringa de tres milésimas de pulgada que contiene eem sustain estándar eem sustain de Sigma diluido de uno a cinco en agua desionizada. Después de diluir, cargamos en la jeringa y al final de la jeringa colocamos un filtro de 0,8 micras para filtrar cualquier partícula que entrara, lo que terminaría obstruyendo el dispositivo. La mancha durante cinco a 10 minutos.

Y luego enjuagaremos con agua de Deion i. Entonces, después de cinco a 10 minutos de tinción, detendremos la bomba de jeringa y cambiaremos la jeringa con el tampón de tinción con la jeringa que contiene agua desionizada, básicamente vamos a lavar hasta que veamos que el color azul del SAI se ha lavado del dispositivo. Una vez que se ha enjuagado el exceso de gim sustain del dispositivo, detenemos la solución de lavado.

Y luego lo que vamos a hacer es quitar la jeringa de agua de la entrada. Luego vamos a tomar el tubo de salida del dispositivo. Vamos a agarrar ese tubo en el extremo con nuestras pinzas.

Se trata de un tubo de tigón flexible y lo vamos a volver a insertar en la entrada del dispositivo. Esto sella el dispositivo y mantiene las células hidratadas y su morfología intacta. Ahora, mi compañero de trabajo, el Dr. John Hong Chang, mostrará un protocolo alternativo para el aislamiento de linfocitos CD cuatro positivos, seguido de tinción inmunofluorescente directamente dentro del dispositivo microfluídico.

Así que mi nombre es Shong Hong y hoy voy a demostrarles la tinción de células en un dispositivo microfluídico en esta etapa ya puedo mostrarles cómo usar un dispositivo de aislamiento de inmunoafinidad micro flic para aislar específicamente las células sanguíneas de la sangre completa sin precedentes. Para su propósito, quiere piojos de las células y obtener el contenido de proteínas y ADN de esas células aisladas. Bueno, para el propósito de mi investigación, estoy interesado en obtener las células y luego obtener el recuento de células, por ejemplo, para obtener el recuento de células CD cuatro de la sangre completa y usar eso como un indicador con fines de diagnóstico.

Por lo tanto, el dispositivo que se usa es muy similar al dispositivo de Ken. Está hecho de cámara recta P-D-M-S-A. La geometría es ligeramente diferente, por lo que los parámetros de operación son ligeramente diferentes, mientras que, en general, el procedimiento de operación general es muy similar.

Así que voy a omitir todos los pasos de captura y enjuague de células y pasar directamente al paso de tinción celular en los procedimientos de recuento de células. Así que aquí tengo un dispositivo que ya es la mitad de las células capturadas de sangre entera y el dispositivo ya está enjuagado con PBS. Por lo tanto, las células salientes ya habían salido del dispositivo y preparé con anticipación una mezcla de anticuerpos que se usa específicamente para etiquetar las células que se aíslan en el dispositivo.

Por lo tanto, la concentración de anticuerpos que usamos aquí se ha optimizado para teñir las células con una intensidad fluorescente muy alta bajo un microscopio fluorescente. Así que el procedimiento es bastante sencillo. Cargamos la jeringa llena con la solución de anticuerpos en la bomba de jeringa y luego nos aseguramos de que el caudal esté ajustado a los parámetros correctos que necesitamos.

Y luego encenderemos la bomba de la jeringa, observaremos el final del tubo, nos aseguraremos de que la solución ya salga para que no haya más burbujas en el tubo. Y luego podemos conectar el tubo al dispositivo microfluídico que hemos capturado las células. Así que ahora el anticuerpo está fluyendo hacia el dispositivo para teñir las células que hemos aislado en el, en el dispositivo, la tasa de flujo aquí, estoy usando cinco microlitros por minuto, pero dependiendo de la geometría del dispositivo allí, podría haber diferentes parámetros de flujo que desee usar para su propósito.

Y pasaremos el flujo de la solución de anticuerpos durante cinco minutos, que es suficiente para tener un volumen suficiente para reemplazar toda la solución dentro del canal micropho. Entonces, después de la inyección de anticuerpos, detendremos el flujo. Así que flotamos en anticuerpo a cinco microlitros por minuto durante cinco minutos para reemplazar toda la solución dentro del microcanal.

A continuación, detenemos el flujo y dejamos que el dispositivo se incube y se caliente a temperatura ambiente durante 30 minutos. Por lo tanto, esto debe hacerse en la oscuridad para que el anticuerpo no se apague mientras que las células, los anticuerpos fluorescentes pueden apagarse mientras las células se incuban con un anticuerpo de tinción. Por lo tanto, después de teñir durante generalmente 15 a 30 minutos, simplemente desenchufaremos el tubo del dispositivo y reemplazaremos la jeringa de anticuerpos con una jeringa tampón para lavar los anticuerpos no unidos del dispositivo.

Por lo tanto, la solución de lavado aquí contiene 1% de BSA en la solución PBS. BSA se utiliza para bloquear la no unión de anticuerpos en la superficie y haremos lo mismo. Por lo tanto, primero ajustamos el caudal de la bomba de jeringa para asegurarnos de que es el caudal correcto que queríamos y luego encendemos la bomba de jeringa y nos aseguramos de que realmente salga líquido del tubo antes de enchufarlo al dispositivo.

El propósito de hacer eso es que no queden burbujas como sobras en el tubo. Por lo tanto, cuando inyectamos, no entra ninguna burbuja en nuestro dispositivo. Así que simplemente conectamos el tubo al dispositivo y dejamos que fluya durante otros cinco minutos para reemplazar todo el lavado, todos los anticuerpos no unidos del dispositivo.

Después del paso de lavado, fijaremos las celdas con 1% de PFA. El propósito de hacer eso es que el dispositivo se pueda almacenar durante unas semanas hasta unas pocas semanas si las imágenes se pueden realizar de inmediato. Así que el procedimiento es bastante sencillo.

Es similar a lo que hemos hecho antes. Cargamos la jeringa en la bomba, ajustamos el caudal al que queríamos, y luego ponemos en marcha la bomba de jeringa y conectamos el tubo a nuestro dispositivo para inyectar la solución IDE de paraforma, que es el fijador en nuestro dispositivo para fijar las células. De nuevo, lo dejamos fluir durante unos cinco minutos.

Por lo tanto, PFA reemplaza todo el búfer del dispositivo para fijar todas las celdas del dispositivo. Entonces, después del paso de fijación de PFA, simplemente quitamos la jeringa de PFA y ahora el dispositivo está listo para la obtención de imágenes. En algunos casos, las personas quieren tener una tinción de núcleo para mostrarla y superponerla con la tinción de su marcador de superficie celular.

Entonces, para ese propósito, haremos la tinción de núcleos usando DPI al final. Así que simplemente cargamos la jeringa DPI para encender la bomba de jeringa y fluir DPI en nuestro dispositivo. Así que ahora el núcleo se teñirá en esas células para mostrar la ubicación de las células.

Y esto, la imagen de tinción DPI se puede superponer más tarde con la tinción del marcador de superficie para mostrar dónde están las células. Por lo tanto, al final de la tinción de DPI, debemos lavar nuevamente la banda L DPI P con una solución tampón. Así que, de nuevo, estamos usando PBS que contiene 1%BSA para lavar los ppp de salida.

Y el funcionamiento es similar a lo que hemos hecho antes. Simplemente conectamos la jeringa tampón a nuestro dispositivo y dejaremos que el tampón fluya hacia el dispositivo para lavar el dap no unido. Así que ese es todo el procedimiento de tinción de células en un dispositivo de micro fluido.

Y después de todos los procedimientos de tinción, los dispositivos están listos para la obtención de imágenes. Y debido a que hicimos la fijación de PFA, los dispositivos también se pueden almacenar durante unas semanas. Si la imagen no se pudo realizar de inmediato.