La aplicación de un ratón ligado Ensayo placas de Peyer asa intestinal para evaluar la absorción por las células bacterianas M

El objetivo general de este procedimiento es examinar la captación bacteriana por las células M ubicadas dentro del sistema inmunitario mucoso intestinal. El primer paso de este procedimiento consiste en exponer y ligar las placas linfoides intestinales de un ratón anestesiado. Luego, se inyectan bacterias fluorescentes en el área ligada.

Una hora después, se extirpan los parches de piroles. Luego, las células del tejido se permeabilizan y tiñen para el marcador de células M, GP dos. Finalmente, las muestras se observan mediante microscopía confocal y se puede visualizar la transcitosis de bacterias por las células M.

Además de proporcionar información sobre la base molecular de la transcitosis bacteriana por células M, el método puede aplicarse a otros sistemas. Por ejemplo, este protocolo podría utilizarse para evaluar la permeabilidad celular y el intestino en fragmentos utilizando cloro y microbios. Con un asa de vidrio estéril, raye las bacterias fluorescentes sobre una placa de agar LB e incube la placa a 37 grados Celsius hasta que sean visibles colonias individuales. Seleccione una colonia individual del agar sólido e inócula en dos mililitros de medio LB fresco.

A continuación, cultive las bacterias en un agitador durante la noche a 37 grados Celsius. Una vez que el cultivo inicial haya crecido, transfiera 500 microlitros de bacterias a 4,5 mililitros de medio LB e incube este nuevo cultivo a 37 grados Celsius durante tres a cuatro horas o hasta que su densidad óptica a 600 nanómetros alcance uno, lo que indica que el crecimiento bacteriano se encuentra en fase logarítmica. En este punto, centrifugue el cultivo a 3000 × g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius para recolectar las bacterias; tras la centrifugación, deseche el sobrenadante y lave el sedimento con cinco mililitros de PBS estéril. Después de repetir el paso de lavado, resuspenda las bacterias en cinco mililitros de PBS.

Después de colocar al ratón bajo anestesia continua con isoflurano, use herramientas estériles para abrir asépticamente el abdomen del ratón. Comience exponiendo el intestino delgado y localice las placas de Peyer. Una vez encontradas las placas de Peyer, use hilo estéril para ligar el intestino aproximadamente cinco milímetros hacia un lado de la placa.

Tenga cuidado para evitar seccionar vasos sanguíneos durante el procedimiento. Una vez que se haya ligado el intestino, use una jeringa para inyectar 50 microlitros de suspensión bacteriana con aproximadamente 10⁷ UFC en el bucle del parche de Peyer ligado, en el lado libre del intestino. Luego, use hilo para ligar el otro lado del intestino.

Cierre el abdomen del ratón con una pinza y mantenga al ratón bajo anestesia durante una hora antes de sacrificarlo. Para obtener el parche de Peyer, extirpe cuidadosamente el parche de Peyer. Luego, pase PBS vigorosamente a través del segmento intestinal obtenido varias veces para lavar la cara apical del parche de Peyer y eliminar el exceso de líquido mucoso y bacterias.

Una vez lavado el parche de PI, colóquelo en un pocillo de una placa de 24 pocillos y añada la solución cyto effects o cyto perm. Incube la muestra en hielo durante una hora. Una vez fijado el parche de P'S, sumérjalo en un mililitro de tampón de lavado perm durante cinco minutos.

Repita este paso de lavado tres veces. A continuación, coloque la muestra en un mililitro de tampón de bloqueo e incúbela en hielo durante 30 minutos. Tras el paso de bloqueo, agregue anticuerpo monoclonal anti ratón GP2 hasta una concentración final de cinco microgramos por mililitro e incube la muestra durante la noche a cuatro grados Celsius para teñir las células M.

A continuación, lave la muestra como antes. Añada un anticuerpo secundario conjugado y incube la muestra en hielo, a oscuras, durante dos horas. Una vez teñida la muestra, lávela suavemente con PBS.

Luego, coloque tres o cuatro piezas de cubreobjetos circulares sobre un portaobjetos e incruste el parche de pires en 200 microlitros de una solución al 30 % de glicerol en PBS. En el portaobjetos, utilice un microscopio láser confocal DM IRE2 o un microscopio de desconvolución Delta Vision para observar la muestra. En esta imagen, se puede observar que la salmonella typhimurium marcada con GFP verde está rodeada por GP2 mostrado en rojo en la membrana plasmática apical.

En esta imagen rotada, se observan bacterias dentro de las vesículas citoplasmáticas subapicales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la transcitosis bacteriana por células M utilizando el ensayo de intestino yeyunal ligado Lu.