La aplicación de un ratón ligado Ensayo placas de Peyer asa intestinal para evaluar la absorción por las células bacterianas M
December 17th, 2011
Las células M en un folículo especializada asociada a epitelio que recubre las placas de Peyer juegan un papel importante para el inmunovigilancia la mucosa en el intestino de tejido linfoide asociado. Aquí se describe el método de evaluación para transcitosis bacteriana por las células M En vivo. Este método proporciona un método para comprender M-función de las células del sistema inmunológico.
El objetivo general de este procedimiento es examinar la absorción bacteriana por las células M ubicadas dentro del sistema inmunológico de la mucosa intestinal. El primer paso de este procedimiento es exponer y ligar los parches de las piras intestinales de un ratón anestesiado. A continuación, se inyectan bacterias fluorescentes en la zona ligada.
Una hora más tarde, se extirpan los parches de las piras. A continuación, las células del tejido se impregnan y se tiñen para obtener el marcador de células M, GP dos. Finalmente, las muestras se observan utilizando un microscopio confocal y se pueden visualizar las bacterias que están siendo transcitosis por células M.
Además de proporcionar información sobre las bases moleculares de la transcitosis bacteriana por parte de las células m, la desestimación se puede aplicar a otros sistemas. Por ejemplo, este protocolo podría usarse para ayudar a la permeabilidad celular y, en el intestino enmarcado, usar cloro y microbios. Usando un esparcidor de vidrio estéril, raye las bacterias fluorescentes en una placa sinfín LB e incube la placa a 37 grados Celsius hasta que las colonias individuales sean visibles. Elija una sola colonia de la barrena sólida e inocule en dos mililitros de medio LB fresco.
A continuación, cultive las bacterias en una coctelera durante la noche a 37 grados centígrados. Una vez que el cultivo iniciador haya crecido, transfiera 500 microlitros de bacterias a 4,5 mililitros de medio LB e incube este nuevo cultivo a 37 grados centígrados durante tres o cuatro horas o hasta que su densidad óptica a 600 nanómetros alcance uno, lo que indica que el crecimiento bacteriano está en fase logarítmica. En este punto, centrifugar el cultivo a 3000 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para recolectar las bacterias después de la centrifugación, desechar el snat y lavar el pellet con cinco mililitros de PBS estéril Después de repetir el paso de lavado Resus suspender las bacterias en cinco mililitros de PBS.
Después de colocar al ratón bajo anestesia continua con flúor, utilice herramientas estériles para abrir asépticamente el abdomen del ratón. Comience por exponer el intestino delgado y ubique los parches del PI. Una vez que se hayan encontrado los parches de un PI, use hilo de coser estéril para ligar el intestino unos cinco milímetros a un lado del parche.
Tenga cuidado de evitar cortar los vasos sanguíneos durante el procedimiento. Una vez que el intestino esté ligado, use una jeringa para inyectar 50 microlitros de suspensión bacteriana, aproximadamente 10 por las siete UFC, en el bucle del parche de piras ligado en el lado suelto del intestino. Luego use hilo para ligar el otro lado del intestino.
Cierre el abdomen del ratón con una pinza y manténgalo bajo anestesia durante una hora antes de practicarle la eutanasia. Para cosechar el parche de piras, extirpe con cuidado el parche de piras. A continuación, enjuague enérgicamente el PBS a través de la sección extraída del intestino varias veces para lavar el lado apical del parche del PI y eliminar el exceso de líquido mucoso y bacterias.
Una vez que se haya lavado el parche del PI, colóquelo en un pocillo de una placa de 24 pocillos y agregue efectos citotérmicos o solución permanente de cito. Incubar la muestra en hielo durante una hora. Una vez que el parche P'S esté fijado, sumérjalo en un mililitro de tampón de lavado permanente durante cinco minutos.
Repite este paso de lavado tres veces. A continuación, coloque la muestra en un mililitro de tampón de bloqueo e incube en hielo durante 30 minutos. Después del paso de bloqueo, agregue el anticuerpo monoclonal anti ratón GP two a una concentración final de cinco microgramos por mililitro e incube la muestra durante la noche a cuatro grados Celsius para teñir las células M.
A continuación, lave la muestra como antes. Agregue un piso secundario para el anticuerpo conjugado e incube la muestra en hielo en la oscuridad durante dos horas. Una vez que la muestra esté teñida, lávela suavemente en PBS.
A continuación, coloque tres o cuatro piezas de cubreobjetos circulares en un portaobjetos e incruste el parche pires en 200 microlitros de una solución de glicerol al 30% en PBS. En el portaobjetos, utilice un microscopio láser confocal DM IRE dos o un microscopio de deconvolución de restauración de la visión Delta para observar la muestra. En esta imagen, se puede ver que la salmonella typhimurium marcada con GFP verde está rodeada por GP dos que se muestra en rojo en la membrana plasmática apical.
En esta imagen rotada, las bacterias son visibles dentro de las vesículas citoplasmáticas subapicales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la transcitosis bacteriana por células M utilizando Lu asay intestinal ligada.
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Visión general
Este estudio se centra en las células M en el sistema inmunológico de la mucosa intestinal, específicamente su papel en la transcitosis bacteriana. El método descrito permite la evaluación de la función de las células M in vivo, contribuyendo a nuestra comprensión de la inmunovigilancia de la mucosa.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Microbiología
- Neurociencia
Antecedentes
- Las células M son células epiteliales especializadas en las placas de Peyer.
- Juegan un papel crucial en la respuesta inmune del intestino.
- Entender su función puede proporcionar información sobre la salud intestinal y las enfermedades.
- La transcitosis bacteriana es un proceso clave en la vigilancia inmune.
Propósito del estudio
- Evaluar la captación bacteriana por células M in vivo.
- Desarrollar un método para estudiar la función de las células M.
- Mejorar la comprensión de los mecanismos de inmunovigilancia de la mucosa.
Métodos utilizados
- Ligando las placas de Peyer intestinales en ratones anestesiados.
- Inyectando bacterias fluorescentes en el área ligada.
- Excisando las placas de Peyer después de una hora.
- Tiñendo muestras de tejido para el marcador de células M GP2 y observando con microscopía confocal.
Resultados principales
- Visualización exitosa de la transcitosis bacteriana por células M.
- Demostró la viabilidad del método de evaluación.
- Proporcionó información sobre la función inmune de las células M.
- Contribuyó a la comprensión del tejido linfoide asociado al intestino.
Conclusiones
- El método permite un estudio detallado de la función de las células M.
- Entender las células M puede informar estrategias para la salud intestinal.
- Investigaciones adicionales podrían explorar las implicaciones para las terapias inmunes.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of bacterial transcytosis by M cells in Peyer’s patches addresses a critical gap in understanding mucosal immune surveillance and host-microbe interactions. This assay enables mechanistic de-risking of antigen uptake pathways, supporting predictive confidence in early immunology and microbiome-targeted discovery. The method’s ability to distinguish bacterial species transcytosed by M cells informs target validation and portfolio triage for mucosal immunomodulation strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of M cell-mediated antigen uptake mechanisms in a physiologically relevant system.
- Supports functional target validation for molecules modulating mucosal immune responses.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying the role of Gp2 and bacterial ligands in transcytosis.
- Provides predictive confidence for advancing immunomodulatory or microbiome-based candidates.
Screening & Assay Development
- Establishes a validated ex vivo platform for quantifying bacterial uptake by M cells using fluorescence and confocal microscopy.
- Enables reproducible measurement of transcytosis events across bacterial strains and experimental conditions.
- Supports assay standardization for downstream screening of modulators affecting M cell function or permeability.
- Facilitates reliable evaluation of candidate compounds targeting mucosal immune pathways.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for studying host-microbe interactions in the gut mucosa.
- Provides translational continuity from discovery to preclinical validation of mucosal immune targets.
- Enables risk-adjusted advancement decisions for immunotherapeutic and vaccine candidates targeting gut immunity.
- Supports identification of translational biomarkers linked to M cell-mediated antigen uptake.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing of antigen uptake, supporting lead identification, and informing preclinical validation of mucosal immune modulators.
- Discovery Biology: Quantifies M cell-mediated transcytosis to clarify antigen uptake pathways and de-risk biological mechanisms.
- Screening: Provides standardized, quantitative readouts for comparing bacterial uptake across strains and interventions.
- Analytics: Delivers confocal imaging and fluorescence-based measurements to support statistical comparison of experimental groups.
- Translational Research: Bridges early discovery findings to preclinical models of gut immunity and host-microbe interaction.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for evaluating diverse bacterial species and candidate modulators in mucosal immunology workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in mucosal immune target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes bacterial uptake quantification and supports reproducibility across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for immunomodulatory and microbiome-targeted programs, enhancing capital efficiency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates targeting gut immune pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgical techniques and confocal microscopy.
- Demands access to fluorescence labeling reagents and imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of tissue processing and staining protocols.
- Adaptation may be needed for different bacterial species or model systems.
- Throughput is limited by surgical and imaging workflow constraints.
