La aplicación de un ratón ligado Ensayo placas de Peyer asa intestinal para evaluar la absorción por las células bacterianas M

Las células M en un folículo especializada asociada a epitelio que recubre las placas de Peyer juegan un papel importante para el inmunovigilancia la mucosa en el intestino de tejido linfoide asociado. Aquí se describe el método de evaluación para transcitosis bacteriana por las células M

El objetivo general de este procedimiento es examinar la absorción bacteriana por las células M ubicadas dentro del sistema inmunológico de la mucosa intestinal. El primer paso de este procedimiento es exponer y ligar los parches de las piras intestinales de un ratón anestesiado. A continuación, se inyectan bacterias fluorescentes en la zona ligada.

Una hora más tarde, se extirpan los parches de las piras. A continuación, las células del tejido se impregnan y se tiñen para obtener el marcador de células M, GP dos. Finalmente, las muestras se observan utilizando un microscopio confocal y se pueden visualizar las bacterias que están siendo transcitosis por células M.

Además de proporcionar información sobre las bases moleculares de la transcitosis bacteriana por parte de las células m, la desestimación se puede aplicar a otros sistemas. Por ejemplo, este protocolo podría usarse para ayudar a la permeabilidad celular y, en el intestino enmarcado, usar cloro y microbios. Usando un esparcidor de vidrio estéril, raye las bacterias fluorescentes en una placa sinfín LB e incube la placa a 37 grados Celsius hasta que las colonias individuales sean visibles. Elija una sola colonia de la barrena sólida e inocule en dos mililitros de medio LB fresco.

A continuación, cultive las bacterias en una coctelera durante la noche a 37 grados centígrados. Una vez que el cultivo iniciador haya crecido, transfiera 500 microlitros de bacterias a 4,5 mililitros de medio LB e incube este nuevo cultivo a 37 grados centígrados durante tres o cuatro horas o hasta que su densidad óptica a 600 nanómetros alcance uno, lo que indica que el crecimiento bacteriano está en fase logarítmica. En este punto, centrifugar el cultivo a 3000 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para recolectar las bacterias después de la centrifugación, desechar el snat y lavar el pellet con cinco mililitros de PBS estéril Después de repetir el paso de lavado Resus suspender las bacterias en cinco mililitros de PBS.

Después de colocar al ratón bajo anestesia continua con flúor, utilice herramientas estériles para abrir asépticamente el abdomen del ratón. Comience por exponer el intestino delgado y ubique los parches del PI. Una vez que se hayan encontrado los parches de un PI, use hilo de coser estéril para ligar el intestino unos cinco milímetros a un lado del parche.

Tenga cuidado de evitar cortar los vasos sanguíneos durante el procedimiento. Una vez que el intestino esté ligado, use una jeringa para inyectar 50 microlitros de suspensión bacteriana, aproximadamente 10 por las siete UFC, en el bucle del parche de piras ligado en el lado suelto del intestino. Luego use hilo para ligar el otro lado del intestino.

Cierre el abdomen del ratón con una pinza y manténgalo bajo anestesia durante una hora antes de practicarle la eutanasia. Para cosechar el parche de piras, extirpe con cuidado el parche de piras. A continuación, enjuague enérgicamente el PBS a través de la sección extraída del intestino varias veces para lavar el lado apical del parche del PI y eliminar el exceso de líquido mucoso y bacterias.

Una vez que se haya lavado el parche del PI, colóquelo en un pocillo de una placa de 24 pocillos y agregue efectos citotérmicos o solución permanente de cito. Incubar la muestra en hielo durante una hora. Una vez que el parche P'S esté fijado, sumérjalo en un mililitro de tampón de lavado permanente durante cinco minutos.

Repite este paso de lavado tres veces. A continuación, coloque la muestra en un mililitro de tampón de bloqueo e incube en hielo durante 30 minutos. Después del paso de bloqueo, agregue el anticuerpo monoclonal anti ratón GP two a una concentración final de cinco microgramos por mililitro e incube la muestra durante la noche a cuatro grados Celsius para teñir las células M.

A continuación, lave la muestra como antes. Agregue un piso secundario para el anticuerpo conjugado e incube la muestra en hielo en la oscuridad durante dos horas. Una vez que la muestra esté teñida, lávela suavemente en PBS.

A continuación, coloque tres o cuatro piezas de cubreobjetos circulares en un portaobjetos e incruste el parche pires en 200 microlitros de una solución de glicerol al 30% en PBS. En el portaobjetos, utilice un microscopio láser confocal DM IRE dos o un microscopio de deconvolución de restauración de la visión Delta para observar la muestra. En esta imagen, se puede ver que la salmonella typhimurium marcada con GFP verde está rodeada por GP dos que se muestra en rojo en la membrana plasmática apical.

En esta imagen rotada, las bacterias son visibles dentro de las vesículas citoplasmáticas subapicales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la transcitosis bacteriana por células M utilizando Lu asay intestinal ligada.