Una basada en PCR genotipificación método para distinguir entre las variedades de tipo silvestre y ornamental de Imperata cylindrica

El objetivo principal de este procedimiento es proporcionar un protocolo de genotipado molecular rápido y rentable que pueda diferenciar entre variedades de Retta cylindrica, típicamente llamadas pasto gon, que no se pueden distinguir solo por la morfología. Esto se logra identificando y aislando primero el tejido de una variedad de pasto gon de interés. El siguiente paso es extraer el ADN nuclear y enlucido del tejido recolectado.

A continuación, se realiza la reacción en cadena de la polimerasa en el ADN extraído utilizando cebadores específicos de la variedad que se dirigen a las diferencias de secuencia en la región LF de su giro de PLA, así como a los controles positivos y negativos adecuados. El paso final es realizar electroforesis en gel en cada una de las cuatro reacciones de PCR para visualizar los productos de PCR amplificados. En última instancia, la variedad de pasto gon recolectado se determina a través del análisis de la variedad resultante. Las prohibiciones de productos PCR en el gel cuestan a los Estados Unidos alrededor de 3.4 mil millones anuales, causando un daño sustancial tanto a los recursos agrícolas como a los naturales.

La hierba de tipo silvestre imparato Electrica, también conocida como Cogan, es una de las 10 peores malezas invasoras del mundo. La hierba Cogan se forma de rápida propagación en mono rodales que desplazan a la vegetación autóctona, y a su vez, los animales que dependen de esa vegetación autóctona infestan actualmente 490 millones de hectáreas en todo el mundo y alrededor de 500.000 hectáreas en Estados Unidos y la variedad ornamental de ti de tu centrica se comercializa ampliamente bajo los nombres de tus Centrica, Arbra, Baren rojo y sangre japonesa grosera como lo llamaremos JBG. Esta variedad es supuestamente estéril y no invasiva, y se considera deseable por sus hojas de color rojo.

Bajo ciertas condiciones, la hierba de sangre japonesa puede producir semillas viables y volver a una forma completamente verde que es indistinguible de la hierba cogan de tipo silvestre. Como puede ver, ambos poseen hojas verdes y son más grandes que la variedad ornamental tradicional con hojas más grandes. Además, las plantas de tipo revertido y silvestre tienen rizomas más grandes y la variedad ornamental aumenta su potencial reproductivo asexual.

La reversión hace la identificación solo a través de la morfología. Una tarea difícil. Los métodos moleculares proporcionan un medio para distinguir con precisión las plantas invasoras y los materiales vegetales que no se pueden identificar a través de medios visuales normales.

Los métodos moleculares son fundamentales para protegerse contra la propagación e introducción de plantas invasoras. La aplicación de este protocolo molecular proporciona un medio para distinguir con precisión la hierba de sangre japonesa de la hierba Kogan. Este protocolo puede ayudar a prevenir la co-ocurrencia con el pasto Kogan y la posible formación de híbridos viables.

La principal ventaja de esta técnica sobre las técnicas existentes, como el polimorfismo de longitud de fragmento amplificado, o el análisis A FLP y cosas como la secuenciación de ADN, es que proporciona una técnica de genotipado molecular muy rentable y rápida que puede distinguir fácilmente la diferencia entre la hierba kogan de tipo silvestre y las variedades de hierba de sangre japonesa. La demostración de la técnica estará a cargo de Joseph Hery, un estudiante de nuestro laboratorio. En primer lugar, identifique un espécimen de un sitio donde crezca la hierba de gon o la hierba de sangre japonesa y sea necesario distinguirlos entre sí.

La hierba de sangre japonesa se distingue fácilmente de la hierba gon de tipo silvestre por sus hojas de color rojo brillante. Sin embargo, la hierba de sangre japonesa es casi indistinguible de la hierba Kogan, ya que ambas tienen hojas verdes más largas, más área foliar y rizomas más grandes que la hierba de sangre japonesa ornamental. Este método se puede utilizar en tejidos de hojas frescas, congeladas y recién secas.

Si almacena tejidos para la extracción de ADN en una fecha posterior, el mejor método es congelar y almacenar el tejido a menos 80 grados Celsius de inmediato. Si es necesario almacenarlo en seco, coloque el pañuelo en un sobre de papel y guarde el sobre en gel de sílice deshidratado u otros desecantes activos a temperatura ambiente. Si se va a utilizar tejido fresco, asegúrese de que el ADN se extraiga dentro de las tres horas posteriores a la recolección para evitar la degradación.

Este procedimiento utiliza el mini kit de plantas DNEZ de Kyogen de acuerdo con las instrucciones del fabricante con una pequeña modificación. Aquí. El procedimiento se ha adaptado para que se utilicen más de 100 miligramos de tejido fresco o congelado o más de 20 miligramos de tejido seco. Primero muela más de 100 miligramos de tejido de hoja fresco o congelado, o más de 20 miligramos de tejido de hoja seco hasta obtener un polvo fino usando tres rondas de nitrógeno líquido con molienda en un mortero enfriado.

Pese el polvo congelado de papel fresco o congelado en alícuotas de 100 miligramos. Si usa tejido de hojas secas, pese el polvo en alícuotas de 20 miligramos. Después de este paso, proceda con la extracción de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando un espectrofotómetro como la prueba de espectrofotómetro NanoDrop, ADN, calidad y cantidad, buenos rendimientos de ADN deben estar entre 50 y 150 nanogramos por microlitro con dos relaciones de 60 sobre dos 80 y 2 32 80 cercanas a 2.0 como se ve. Aquí.

Realice la electroforesis utilizando un gel estándar 1%AROS. Verifique la presencia de bandas relativamente grandes de más de 10 KB con ninguna o pocas rayas debido a la contaminación por ARN, si la concentración de ADN es alta, diluya las muestras a 70 nanogramos por microlitro para los pasos siguientes. Los cebadores de PCR utilizados en este protocolo indicados por las flechas roja y verde se basan en las diferencias de secuencia entre la región espaciadora LF de giro enyesado de los genotipos de pasto Cogan y pasto sangre japonés.

Estas diferencias se presentan en forma de polimorfismos de un solo nucleótido e inserciones y deleciones indicadas por las flechas negras verticales, que permiten el desarrollo de cebadores específicos de cada variedad. Al ubicar los cebadores en los sitios de secuencias únicas, las secuencias de cebadores están contenidas en la parte escrita del protocolo para cada muestra de ADN aislada configurada en dos reacciones de PCR de 50 microlitros en tubos de PCR de pared delgada de 0,2 mililitros en ICE utilizando cada conjunto de cebadores de acuerdo con el protocolo escrito. Si la concentración de ADN es baja, se puede agregar más ADN a cada reacción mientras se ajusta la cantidad de agua destilada doble libre de nucleasa para que el volumen total de la reacción siga siendo de 50 microlitros.

No utilice más de cinco microlitros de ADN o el 10% del volumen total por reacción, ya que las impurezas contenidas en las muestras de ADN pueden inhibir las reacciones de PCR para garantizar que todos los reactivos de PCR funcionen, configure bien el control positivo. El uso de los cebadores de control positivo configura el control negativo utilizando el mismo conjunto de cebadores de control que el control positivo, pero con agua destilada doble en lugar del ADN extraído en este punto, hay un total de cuatro reacciones de PCR para cada muestra que se está analizando. A continuación, lleve a cabo amplificaciones de PCR en un termociclador equipado con una tapa calentada utilizando los parámetros de ciclo de PCR en el protocolo escrito, puede ser necesaria la optimización de la temperatura de arrodillamiento principal, los tiempos de extensión y el número de ciclos, dependiendo de la calidad de los cebadores de ADN, la polimerasa pegajosa o el tipo de termociclador utilizado.

Una vez completadas las reacciones de PCR, separe los productos de PCR en un gel al 1% utilizando electroforesis estándar. Ejecute las muestras a alrededor de 120 voltios hasta que el frente D alcance las tres cuartas partes de la longitud total del gel. Visualice el gel bajo luz ultravioleta e inspeccione las bandas resultantes para ver si se amplificó un fragmento de ADN apropiado.

Este gel representativo muestra los resultados de la electroforesis de productos de PCR derivados de muestras de ADN de pasto Kogan, pasto de sangre japonesa y reversión de pasto de sangre japonesa combinados con cebadores específicos de pasto Kogan y JBG, así como el control positivo de LF a su vez y un control negativo sin plantilla. El juego de cebadores de control positivo turn LF funciona igual de bien para la hierba Cogan, la hierba sangre japonesa, la hierba sangre japonesa revert y otras hierbas, y dará como resultado una banda de 890 pares de bases. Si todos los reactivos de PCR están libres de contaminantes de ADN, la reacción de control negativo no dará lugar a un producto de PCR.

Si la muestra de ADN se deriva de la hierba kogan de tipo salvaje, una reacción de PCR utilizando el juego de cebadores específicos de la hierba Kogan dará como resultado una sola banda en alrededor de 595 pares de bases, mientras que los cebadores específicos de JBG no darán como resultado ninguna banda. Del mismo modo, si la muestra de ADN se deriva de JBG o de la reacción J-B-G-A-P-C-R revertida, el uso del conjunto de cebadores específico de JBG dará como resultado una sola banda en alrededor de 594 pares de bases. Mientras que las imprimaciones específicas para la hierba Kogan no darán como resultado ninguna banda.

Debido a que JBG y JBG revertido tienen una secuencia de ácido nucleico idéntica, por lo tanto, tendrán patrones de bandas idénticos. Sin embargo, las diferencias morfológicas entre las reversiones de JBG y JBG son bastante obvias, por lo que, si bien los resultados de la PCR serán los mismos, las variedades de JBG son fáciles de distinguir a nivel de planta. La secuenciación del ADN de los productos de PCR puede identificar posibles cambios en las secuencias de ADN para diferentes ecotipos de pasto cogan.

El desarrollo de esta técnica proporciona el primer método molecular simplificado que puede distinguir con precisión entre el tipo silvestre K y la hierba y la forma revertida de su variedad ornamental, la hierba de sangre japonesa. Animamos a los usuarios de este protocolo a que se pongan en contacto con nosotros para informar de los resultados derivados del uso de este protocolo. Dicha información compartida ayudará a proporcionar información sobre la distribución de la hierba japonesa.

Esto también ayudará a los reguladores del USDA a tomar decisiones informadas sobre las acciones que podrían ser necesarias para eludir la propagación y la posible hibridación de las variedades de pasto Cogan altamente invasivas.