FSL Construye: Un método simple para la modificación de células / virión superficies con una serie de marcadores biológicos sin afectar su viabilidad

El objetivo general de este procedimiento es etiquetar de forma inofensiva y rápida las superficies de las células vivas o S con construcciones bioactivas. Esto se logra preparando primero un espaciador de función, lípidos o solución de construcción FSL. A continuación, se mezcla una parte igual de la solución de construcción con una parte igual de la solución de células o VIR.

Como tercer paso, la mezcla se incuba durante 60 minutos a 37 grados centígrados. El paso final es lavar las células o citos modificados o los VIRs o VIRs modificados y utilizarlos experimentalmente como de costumbre. En última instancia, las células vivas modificadas en la superficie o S se pueden visualizar a través de todas las técnicas de análisis experimental de rutina, incluida la citometría de flujo, la microscopía y la aglutinación.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el marcaje covalente, es que es rápida, robusta, flexible y no afecta a la vitalidad de la célula modificada o de Varian. Para preparar primero la solución madre de construcción FSL, agregue un mililitro de diluyente a la ficha del producto para reconstituir el producto FSL seco, creando una solución madre de un miligramo por mililitro. Sonicar el vial durante 30 segundos, alícuota el caldo en recipientes estériles de 100 microlitros y almacenar los recipientes a dos a ocho grados centígrados durante un máximo de una semana.

Para preparar soluciones de construcción de FSL que funcionen para la inserción justo antes de su uso, vuelva a sonicar la solución durante 30 segundos para homogeneizar cualquier celda mis, luego diluya la construcción de FSL y el tampón a la concentración requerida. Almacene la solución de trabajo a dos a ocho grados Celsius hasta una semana después de la suspensión de Resus en medios libres de lípidos o centrífuga PBS las células para la modificación de FSL libres de lípidos no unidos. A continuación, empaque las células en 100 microlitros de diluyente, lave las células para los controles en las mismas condiciones a 100 microlitros de células no modificadas.

Agregue 100 microlitros de una dilución adecuada de solución de FSL si lo desea. Paralelamente, también cree controles negativos con soluciones FSL o PBS no relacionadas. A continuación, incubar todos los subconjuntos de células durante una hora a 37 grados centígrados después de la incubación.

Lave todas las células dos veces con medios libres de lípidos o PBS para eliminar cualquier construcción libre de FSL y prepare una suspensión adecuada en medios libres de lípidos. Una vez que se ha completado el proceso de modificación de FSL, los coys se pueden almacenar a cuatro u ocho grados centígrados como una flor. Los constructos FSL constan de tres componentes principales, la cabeza funcional o F, que puede ser una variedad de grupos biológicamente funcionales.

El espaciador RS está diseñado para inducir el espaciamiento de la cabeza funcional lejos de la membrana para mejorar la dispersión del agua y no ser reactivo con el suero humano y el lípido DAL o L, lo que permite que la construcción se incorpore espontáneamente a las superficies cuatro. Los grupos representativos de FSL se muestran en las siguientes cinco imágenes. Los embriones murinos vivos se marcaron directamente con fluoresceína FSL mediante el método de dos horas a 37 grados Celsius en medios de cultivo celular libres de suero lavados y luego se observaron bajo microscopía de fluorescencia.

En esta primera imagen, se puede ver un embrión de dos células sin espejo de zop palita. La tinción intensa en el centro del embrión es representativa de una tinción corporal polar clásica. En las siguientes dos imágenes, se muestran embriones libres de cuatro células y ocho células que exhiben una tinción sombría de las células que están fuera del microscopio P de enfoque.

En esta última imagen se muestra una imagen de un embrión de 16 células sin ZOP, Palita en esta última imagen de embriones vivos con fluoresceína espejada, de cuatro a cinco días de edad, blastos de espejamiento intactos, embriones con embrión y zop LUCITA marcados en esta siguiente serie de imágenes. Se muestra el marcaje con fluoresceína FSL del pez cebra. Esta primera imagen es de una micro angiografía de una larva de pez cebra 52 horas después de la fertilización a la que se le ha inyectado fluoresceína FSL directamente en la circulación.

Aquí se puede observar la tinción de la vasculatura del pez cebra. La fluoresceína FSL, las células heterogéneas de tejido renal de pez cebra o los citos ZK se crearon exvivo y luego se microinyectaron en la circulación de un pez cebra receptor 52 horas después de la fertilización. Las observaciones in vivo de los citos ZK se realizaron dos horas después de la inyección mediante imágenes de la vasculatura bajo fluorescencia con microscopía de lapso de tiempo. los cuales aparecían borrosos debido a su movimiento indicado con flechas verdes. En esta imagen, se muestra el marcaje de fluoresceína FSL mediante la absorción oral del constructo logrado mediante la inmersión de embriones de pez cebra y medios que contienen fluoresceína FSL durante un máximo de cinco días.

La microscopía de campo claro del pez cebra tratado con fluoresceína FSL de la izquierda corresponde a la imagen fluorescente adyacente de la derecha. La fluorescencia se localizó preferentemente en el tracto intestinal. No se observó tinción en los embriones de control no tratados que se muestran aquí.

En este caso, el virus de la estomatitis vesicular o VSV se marcó directamente con 10 microgramos por mililitro de fluoresceína FSL durante dos horas a 37 grados centígrados, seguido de una fijación con aldehído paraforme al 4%, y luego el análisis por escaneo de hechos no muestra purificación del VSV vir. Se requirió el etiquetado posterior a FSL. Este histograma muestra células testiculares porcinas infectadas con VIRs humanos A Puerto Rico 8 19 34 o H one N one marcados con fluoresceína FSL.

Las células no fluorescentes no infectadas están representadas por la línea negra, mientras que la fusión de la H one N one coron con las células porcinas, que dio lugar a la fluorescencia, está indicada por la línea roja. En esta siguiente serie de imágenes, las células se marcaron primero con biotina FSL durante una hora a 37 grados Celsius, luego se lavaron y reaccionaron con avadon marcado con flúor cuatro y luego se lavaron y se montaron en húmedo para microscopía de fluorescencia. La primera imagen muestra una imagen confocal compilada de un embrión murino con la asistencia de blastos, y esta figura muestra un corte confocal central del embrión de la imagen anterior.

Aquí hay humanos móviles vivos perm zoa. El desenfoque se produce como consecuencia de su movimiento. En esta figura se puede ver una imagen representativa más clara de los espermatozoides humanos fijados en aldehído al 4%Paraform después de la inserción.

Se muestra que la fijación con aldehído de aldehído con 4%paraforme no afecta al marcaje de FSL, como se ilustra en las dos figuras siguientes aquí, se pueden observar células de carcinoma humano RL 95 fijas con 4%parmal. Mientras que en esta imagen, las células de carcinoma humano endometrial RL 95 no son fijas. Prácticamente no se observan diferencias en el etiquetado entre las dos imágenes con o sin fijación.

Los citos glóbulos rojos marcados con biotina FSL observados en una muestra de sangre tomada dos horas después de la infusión intravenosa de los citos se muestran aquí a la izquierda, las células se observaron bajo microscopía óptica a la derecha, el mismo campo de células se observó bajo fluorescencia y los dos citos presentes se pueden identificar en verde. El cálculo de la proporción de citos a células no marcadas se puede utilizar como indicador de supervivencia. Esta última imagen de célula marcada con biotina FSL muestra citos de biotina endometrial humana vivos que se visualizaron uniéndose a perlas disminuidas.

Esta última serie de imágenes muestra las interacciones de los constructos de FSL con los marcadores del grupo sanguíneo. La primera imagen es de citos GLI de glóbulos rojos humanos recubiertos con una concentración de 500 microgramos por mililitro de FSLG probado contra diluciones de suero humano. Los glóbulos rojos humanos no reaccionan de forma natural con el antígeno Xena, antígeno GALI.

Como tal, los citos se pueden usar para cuantificar los niveles de anticuerpos en suero. En este ejemplo, se determinó que el paciente tenía un título de antígeno de uno a 32 mediante la creación de citos con niveles decrecientes de FSL. De manera similar a la creación de un título de antígeno, se puede determinar un nivel óptimo de antígeno para detectar anticuerpos, se pueden crear células para dar un resultado positivo solo cuando el nivel de anticuerpos supera un título específico.

El nivel de antígeno FSL requerido para dar un resultado positivo depende de la calidad y el nivel de anticuerpo que se detecte. Por lo general, para los antígenos de carbohidratos, una solución de FSL de 100 microgramos por mililitro dará como resultado una fuerte reacción positiva. Los glóbulos rojos del grupo humano O modificados para tener un nivel específico de un antígeno o los llamados estandarizados.

Los citos se utilizan para cuantificar de forma precisa y reproducible los antia en el suero humano. En este ejemplo, los citos se prepararon a partir de los propios glóbulos rojos del donante y se encontró que el nivel de antia en el suero del grupo O analizado era de uno a 32. Se muestra aquí en el sexto tubo los antígenos del grupo sanguíneo A y B insertados simultáneamente en una sola muestra de glóbulos rojos del grupo O para crear una semana y una semana B.

Estos citos se pueden utilizar con fines de control de calidad de VO. El análisis de los citos específicamente formulados a una semana, B semana y probados contra reactivos antia y anti B dan las reacciones débiles esperadas, como se evidencia en esta figura, con las reacciones que ocurren en el área inferior media de los tubos. Esta sencilla técnica se puede realizar en dos horas si se realiza correctamente.