FSL Construye: Un método simple para la modificación de células / virión superficies con una serie de marcadores biológicos sin afectar su viabilidad

El objetivo general de este procedimiento es etiquetar de forma inocua y rápida las superficies de células vivas o S con constructos bioactivos. Esto se logra primero preparando una solución de espaciador funcional, lípido o constructo FSL. A continuación, se mezcla una parte igual de la solución del constructo con una parte igual de la solución de células o VIRs.

Como tercer paso, la mezcla se incuba durante 60 minutos a 37 grados Celsius. El paso final consiste en lavar las células modificadas o cítos o VIRs modificados o VIRs y utilizarlos experimentalmente de forma habitual. En última instancia, las células vivas modificadas en su superficie o S pueden visualizarse mediante todas las técnicas rutinarias de análisis experimental, incluyendo citometría de flujo, microscopía y aglutinación.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la marcación covalente es que es rápida, robusta, flexible y no afecta la vitalidad de la célula modificada ni de Varian. Para preparar la solución stock del constructo FSL, primero agregue un mililitro de diluyente al frasco del producto para reconstituir el producto FSL seco, creando así una solución stock de un miligramo por mililitro. Somete el frasco a sonicación durante 30 segundos, alícuote la solución stock en recipientes estériles de 100 microlitros y almacene los recipientes a entre dos y ocho grados Celsius durante un máximo de una semana.

Para preparar soluciones de trabajo de los constructos FSL para la inserción justo antes de su uso, someta la solución nuevamente a ultrasonido durante 30 segundos para homogeneizar cualquier agregado de células, luego diluya el constructo FSL y el tampón a la concentración requerida. Almacene la solución de trabajo a entre dos y ocho grados Celsius durante un máximo de una semana después de la resuspensión en medio libre de lípidos o en PBS. Centrifugue las células para eliminar los lípidos no unidos antes de la modificación con FSL. A continuación, suspenda las células en 100 microlitros de diluyente y lave las células para los controles en las mismas condiciones hasta obtener 100 microlitros de células no modificadas.

Añada 100 microlitros de una dilución adecuada de la solución FSL si se desea. En paralelo, cree también controles negativos con soluciones FSL no relacionadas y/o con PBS. A continuación, incube todos los subconjuntos celulares durante una hora a 37 grados Celsius tras la incubación.

Lave todas las células dos veces con medio libre de lípidos o PBS para eliminar cualquier constructo FSL libre y prepare una suspensión adecuada en medio libre de lípidos. Una vez completado el proceso de modificación con FSL, los coys pueden almacenarse entre cuatro y ocho grados Celsius como una flor. Los constructos FSL constan de tres componentes principales: la cabeza funcional o F, que puede ser una variedad de grupos funcionalmente biológicos.

El espaciador RS está diseñado para inducir un espaciado de la cabeza funcional respecto a la membrana, con el fin de mejorar la dispersibilidad en agua y para que no reaccione con el suero humano ni con el lípido DAL o L, lo que permite que el constructo se incorpore espontáneamente en las superficies cuatro. Se muestran grupos FSL representativos en las siguientes cinco imágenes. Embriones murinos vivos fueron etiquetados directamente con FSL fluoresceína mediante el método de dos horas a 37 grados Celsius en medio de cultivo celular libre de suero, lavados y luego observados mediante microscopía de fluorescencia.

En esta primera imagen, puede observarse un embrión reflejado de dos células libre de zop palita. La tinción intensa en el centro del embrión representa una tinción clásica del cuerpo polar. En las dos imágenes siguientes, se muestran embriones reflejados de cuatro y ocho células libres de zop palita que presentan una tinción difusa en las células que se encuentran fuera del plano de enfoque del microscopio.

Se muestra una imagen de un embrión de 16 células con reflejo zop palita libre en esta última imagen de embriones vivos con reflejo marcados con fluoresceína FSL; embriones blastocísticos intactos de cuatro a cinco días de edad con reflejo, marcados tanto en el embrión como en zop LUCITA, se muestran en esta siguiente serie de imágenes. Se muestra el marcaje con fluoresceína FSL en pez cebra. Esta primera imagen corresponde a una microangiografía de una larva de pez cebra a las 52 horas post-fecundación a la que se le inyectó directamente fluoresceína FSL en la circulación.

Se puede observar aquí la tinción de la vasculatura del pez cebra. Se generaron ex vivo células de tejido renal heterogéneo de pez cebra o cito ZK marcadas con FSL fluoresceína, que luego se microinyectaron en la circulación de un pez cebra receptor de 52 horas post-fecundación. Las observaciones in vivo de los cito ZK se realizaron dos horas después de la inyección mediante imágenes de la vasculatura con microscopía de fluorescencia y lapso de tiempo. Se muestra un solo fotograma de video con células grandes, de movimiento lento o inmóviles indicadas con flechas naranjas, y células de movimiento rápido, que aparecen borrosas debido a su desplazamiento, indicadas con flechas verdes. En esta imagen, se muestra el marcado con FSL fluoresceína por absorción oral del constructo, logrado mediante la inmersión de embriones de pez cebra en un medio que contiene FSL fluoresceína durante hasta cinco días.

La microscopía de campo claro del pez cebra tratado con fluoresceína FSL a la izquierda corresponde a la imagen fluorescente adyacente a la derecha. La fluorescencia se localizó preferentemente en el tracto intestinal. No se observó tinción en los embriones control no tratados mostrados aquí.

Aquí se muestra el virus de la estomatitis vesicular o VSV marcado directamente con 10 microgramos por mililitro de fluoresceína FSL durante dos horas a 37 grados Celsius, seguido de fijación con paraformaldehído al 4 % y luego análisis mediante escaneo de citometría de flujo, sin purificación del virión de VSV. Se requirió el marcado posterior con fluoresceína FSL. Este histograma muestra células testiculares de cerdo infectadas con el virus humano A Puerto Rico 8 19 34 o H1N1 marcado con fluoresceína FSL.

Las células no fluorescentes no infectadas están representadas por la línea negra, mientras que la fusión del coronavirus H1N1 con las células de cerdo, que resultó en fluorescencia, se indica mediante la línea roja. En esta siguiente serie de imágenes, las células se marcaron primero con biotina FSL durante una hora a 37 grados Celsius, luego se lavaron y reaccionaron con avidina marcada con Fluor 4, seguido de otro lavado y montaje húmedo para microscopía de fluorescencia. La primera imagen muestra una imagen confocal compuesta de un blastocisto de embrión murino, y esta figura muestra una rebanada confocal central del embrión de la imagen anterior.

Aquí se observan espermatozoides humanos móviles en vida. El desenfoque ocurre como consecuencia de su movimiento. En esta figura se puede ver una imagen representativa más nítida de espermatozoides humanos fijados en paraformaldehído al 4 % tras la inserción.

Se muestra que la fijación con paraformaldehído al 4 % no afecta la marcación con FSL biotinilado en eritrocitos humanos, como se ilustra en las siguientes dos figuras. Aquí se pueden observar células de carcinoma endometrial humano RL 95 fijadas con paraformaldehído al 4 %. Mientras que en esta imagen, las células de carcinoma endometrial humano RL 95 no están fijadas. Prácticamente no se observan diferencias en la marcación entre las dos imágenes, con o sin fijación.

Se muestran aquí a la izquierda glóbulos rojos marcados con biotina FSL observados en una muestra de sangre tomada dos horas después de la infusión intravenosa de las citoes; a la derecha, las células se observaron mediante microscopía óptica; el mismo campo de células se observó mediante fluorescencia, y las dos citoes presentes pueden identificarse en verde. El cálculo de la proporción entre las citoes y las células no marcadas puede utilizarse como un indicador de supervivencia. Esta última imagen de citoes marcadas con biotina FSL muestra citoes endometriales humanas vivas que fueron visualizadas mediante unión a cuentas abatidas.

Esta serie final de imágenes muestra las interacciones del constructo FSL con marcadores de grupos sanguíneos. La primera imagen corresponde a glóbulos rojos humanos recubiertos con una concentración de 500 microgramos por mililitro de FSLG, probados frente a diluciones de suero humano. Los glóbulos rojos humanos no reaccionan naturalmente con el antígeno Xena ni con el antígeno GALI.

Por tanto, los cítidos pueden utilizarse para cuantificar los niveles de anticuerpos en suero. En este ejemplo, se determinó que el paciente tenía una titulación de anticuerpos de uno a 32 mediante la creación de cítidos con niveles decrecientes de FSL. De forma similar a la creación de un título de antígeno, puede determinarse un nivel óptimo de antígeno para detectar anticuerpos; luego pueden crearse células que den un resultado positivo solo cuando el nivel de anticuerpos supere un título específico.

El nivel de antígeno FSL necesario para obtener un resultado positivo depende de la calidad y cantidad de anticuerpo que se esté detectando. Típicamente, para antígenos de carbohidratos, una solución FSL de 100 microgramos por mililitro dará lugar a una reacción positiva fuerte. Los glóbulos rojos humanos del grupo O modificados para tener un nivel específico de antígeno a se denominan estandarizados.

Los citos se utilizan para cuantificar de manera precisa y reproducible los anticuerpos anti-A en suero humano. En este ejemplo, los citos se prepararon a partir de los glóbulos rojos del propio donante y se encontró que el nivel de anticuerpos anti-A en el suero del grupo O era de uno a 32. Aquí se muestra en el sexto tubo la utilización de antígenos de los grupos sanguíneos A y B insertados simultáneamente en una sola muestra de glóbulos rojos del grupo O para crear citos débiles en A y débiles en B.

Estas células se pueden utilizar con fines de control de calidad de VO. El análisis de las células formuladas específicamente, la célula de la semana A y la de la semana B, probadas frente a reactivos anti-A y anti-B, muestra las reacciones débiles esperadas, como se observa en esta figura, donde las reacciones ocurren en la zona inferior central de los tubos. Esta técnica sencilla puede realizarse en dos horas si se lleva a cabo correctamente.