Evaluación de la migración de las células madre del cáncer compartimentar Utilizando dispositivos de microfluidos y imágenes de células vivas

El objetivo general de este procedimiento es inspeccionar y caracterizar visualmente la migración de células cancerosas a través de un dispositivo microfluídico compartimentador. Esto se logra disociando primero las neuroesferas preexistentes de células madre de tumores cerebrales cultivadas en medio libre de suero. El segundo paso es fabricar un molde de litografía blanda A-P-D-M-S que tiene un diseño compartimentador.

A continuación, ensamble el dispositivo microfluídico y cárguelo con células madre tumorales cerebrales. Por último, las imágenes de lapso de tiempo a largo plazo de la migración de células madre de tumores cerebrales se logran utilizando un sistema microscópico todo en uno. En última instancia, los resultados muestran que las células madre de tumores cerebrales exhiben una secuencia giratoria de etapas morfológicas durante su migración a través de espacios ultraconfinados.

La principal ventaja de esta técnica sobre las masas existentes, como la cámara de Boyton de Transwell, es que el microdispositivo permite la inspección visual del proceso de migración, la colocación controlada de las células y la entrega precisa de los factores. Por lo tanto, la tecnología microfórica tiene características de selección y navegación de células individuales confiables, eficientes y rentables. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de la metástasis y la recurrencia del cáncer, ya que el análisis de células individuales de células altamente migratorias puede identificar posibles objetivos quimioterapéuticos futuros.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el comportamiento de migración del sistema oncológico, también se puede aplicar a otros sistemas, como el desarrollo embrionario, las respuestas inmunitarias, la cicatrización de heridas y la regeneración de órganos. Comenzando con la suspensión celular de las lanzas neuros derivadas de BTSC. Agrupe las células en un tubo cónico de 15 mililitros y centrifuérrelas a 900 RPM durante cinco minutos, pero no más rápido.

Aspirar la súper natina. A continuación, permita que las neuroesferas se aflojen incubándolas en 0,5 mililitros de Accutane precalentado durante cinco a 10 minutos a 37 grados centígrados. Después de la incubación, interrumpa mecánicamente las células con 10 a 20 movimientos suaves de una pipeta P 100.

A continuación, añada 1,5 mililitros de medio de células madre para neutralizar la centrífuga Accutane, la suspensión celular a 1300 RPM durante cinco minutos y vuelva a suspender las células en un mililitro de medio de células madre. Compruebe la densidad celular con un hemocitómetro y ajuste la densidad a 20.000 células por microlitro. Para comenzar la fabricación de la SU eight master, prepare dos máscaras fotográficas con Adobe Illustrator y película transparente de impresión láser con Image Setter incorporado.

La primera capa de fotomáscara consta de dos marcadores de referencia y una matriz de microcanales, y la segunda capa de fotomáscara tiene las cámaras de asiento y recepción. Limpia ambas capas de la mascarilla con isopropanol y deja que se sequen al aire. Ahora centrifuga una oblea de mango con SU eight de tres micras de grosor, seguido de un horneado suave.

Luego, con la mascarilla fotográfica de primera capa en contacto cercano con los rayos uv, exponga la foto, resista y deje que se cure. A continuación, hornee después y revele la oblea curada. Cubra las áreas de marcadores de referencia de la oblea del mango con cinta adhesiva.

A continuación, recubre la oblea con una fotorresistencia de 250 micras de grosor. Después, despega la cinta para revelar los marcadores con el fin de alinearlos. Coloque la segunda capa de fotorresistencia y alinee los marcadores de referencia.

Luego, exponga y cure la fotomascarilla de segunda capa, seguida de un horneado posterior y revelado. Ahora utilice el maestro SU eight a través de la deposición de vapor para reducir la pegajosidad de la superficie. Coloque las obleas en un desecado con varias gotas de solución de clina Tri Chloro al vacío durante al menos una hora.

A continuación, el maestro estará listo para su uso para moldear PDMS con el maestro. Comience mezclando bien la base de prepolímero con curado en una proporción de 10 a uno. A continuación, coloque la mezcla en un desecador para desgasificarla al vacío hasta que no se vea ninguna burbuja de aire.

Vierte la mezcla sobre la mascarilla y vuelve a desgasificar. Si se introducen nuevas burbujas de aire, cure el molde en una placa caliente nivelada durante dos horas a 90 grados centígrados. Después de que se enfríe a temperatura ambiente, suelte suavemente el sello PDMS.

Por lo tanto, los canales de cultivo se graban en PDMS y están listos para el montaje del dispositivo microfluídico. El maestro es reutilizable para moldear hasta que se agriete o se desgaste. Cuando el maestro se vuelve pegajoso, se puede volver a aplicar el recubrimiento antiadherente.

Comience haciendo entradas y salidas en el dispositivo microfluídico a través del sello PDMS. Con una punción en el orificio de la biopsia, limpie el sello PDMS sumergiéndolo en etanol al 70% durante 30 minutos y luego enjuáguelo con agua desionizada durante 10 minutos. Esterilizar y completar las reacciones de reticulación del sello PDMS mediante autoclave.

Ahora coloque el sello PDMS en un cubreobjetos de vidrio recubierto con poli L lisina. A continuación, el dispositivo se recubre con laminado llenando las cámaras con solución de laminado a través de las entradas del depósito y se incuba durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, aspire el laminado del dispositivo.

A continuación, lave el dispositivo inundándolo dos veces con medio de células madre. Ahora cargue 11 microlitros de células disociadas en uno de los depósitos de siembra Si es necesario, utilice la aspiración endouterina para forzar las células a entrar en la cámara. A continuación, cargue siete microlitros adicionales de células en el depósito de asiento contiguo.

Después de cinco minutos, los depósitos de asientos y recepción se inundarán de medios. Ahora coloque una hoja estéril de PDMS de 0,5 a un milímetro de grosor en el dispositivo. La adhesión natural de la superficie del PDMS consigo mismo sellará el dispositivo una vez sellado, está listo para el transporte, la incubación y la obtención de imágenes microscópicas.

Preequilibre el biot, IM haciéndolo funcionar durante 45 minutos. Para estabilizar la temperatura, la humedad y el suministro de aire, agregue varios platos de agua a la cámara de muestras para obtener la humedad adecuada. Cargue el dispositivo preparado en la cámara de muestras del microscopio.

Centre el dispositivo con micropinzas. Ahora configure los puntos de posición de enfoque y los puntos de tiempo utilizando el software Biot e inicie las grabaciones de lapso de tiempo si es necesario. Después de cinco días en cultura, reemplace los medios de cultura.

Los BTC sembrados en el dispositivo se registraron continuamente mediante una imagen de fase. Durante cinco días en la cámara de asiento, las células fusiformes permanecieron en la etapa previa a la migración. A medida que se acercaban a la entrada del microcanal, algunas células se expandían y generaban protuberancias adhesivas.

Solo una celda pudo ocupar la entrada y explorar la dirección de la migración. Una vez que la célula determinó la dirección de migración, procedió a navegar a través de todo el microcanal a una velocidad alta y constante. Al final de Microchannel, la célula procedió a explorar el espacio abierto de la cámara receptora antes de entrar finalmente en ella.

Al observar las células con intervalos de imagen de dos segundos, la potencia de migración pareció ser generada principalmente por una actividad de parloteo similar a la de las células OID. Al intentar el procedimiento, es importante recordar que el diseño del dispositivo es tan flexible que las dimensiones de los microcanales se pueden manipular para lograr el grado deseado de migración celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear un dispositivo microfluídico compartimentador único adecuado para cultivar sus células de interés y luego realizar imágenes de lapso de tiempo a largo plazo para definir cualitativa y cuantitativamente las características migratorias de estas células siguiendo este procedimiento.

Se pueden aplicar otros métodos, como la secuenciación de nueva generación o los microarrays de ADN, para responder a preguntas adicionales, como el grado de diferencia genética de las células cancerosas altamente migratorias.