Câncer Colorretal Profiling proteína de superfície celular Usando um Microarray de anticorpos e Multiplexação de fluorescência

Seu objetivo geral do experimento a seguir é usar o microarray de anticorpos de varredura DOT para traçar o perfil molecular de antígenos de superfície no tecido de câncer colorretal. Além disso, a multiplexação fluorescente é empregada para distinguir tipos de células de perfis específicos dentro da população mista. Antígenos de cluster de diferenciação ou CD foram identificados como potenciais biomarcadores prognósticos ou metastáticos no câncer colorretal.

Esses antígenos são biomarcadores ideais, pois sua expressão geralmente muda com a progressão do tumor ou interação com outros tipos de células. Neste vídeo, empregamos o microarray de anticorpos de varredura DOT para capturar células vivas por meio dos antígenos de superfície expressos. O microarray de anticorpos de varredura DOT consiste em uma lâmina de vidro com uma camada de nitrocelulose.

O painel de microraios de anticorpos de varredura DOT é revestido por pontos de alinhamento que consistem em CD 29 e CD 44. Matrizes duplicadas também são pontilhadas em cada lado da matriz. O primeiro painel consiste nos 82 anticorpos originais do microarray de leucemia de varredura DOT e 40 anticorpos adicionais foram selecionados com base em um potencial prognóstico como o microarray satélite do câncer colorretal.

E o último painel consiste em anticorpos de controle do tipo gelo. Aqui, o tecido do câncer colorretal e a mucosa intestinal normal são digeridos e filtrados para obter uma suspensão unicelular viável. A suspensão pode ser congelada ou armazenada para mais tarde.

A suspensão celular é usada para captura celular em um anticorpo de varredura DOT, antígenos de microarray expressos em diferentes subtipos de células são perfilados por multiplexação de fluorescência. Os perfis de expressão resultantes mostram uma mudança significativa na expressão do antígeno entre as células cancerígenas colorretais e uma mucosa intestinal normal. Essa diferença também se reflete na população de leucócitos associados ao tumor.

O agrupamento hierárquico de vários perfis tumorais mostra agrupamento de assinaturas de doenças com estágios de câncer colorretal. Olá, sou Jerry, da Escola de Biociência Molecular da Universidade de Sydney, Austrália, e hoje mostrarei a vocês um experimento para o perfil de antígenos de superfície no tecido do câncer colorretal. Usando um microarray de anticorpos de varredura de pontos e multiplexação de fluorescência, os microarrays de varredura de pontos permitem o perfil de aproximadamente 140 antígenos de superfície em células cancerígenas vivas com os leucócitos inflamatórios associados.

Subconjuntos de células capturadas em microarrays podem ser distinguidos usando anticorpos marcados com fluorescência que se ligam a um antígeno marcador altamente expresso nas células de interesse. Até três subconjuntos diferentes de células podem ser perfilados em um único microarray usando marcadores fluorescentes apropriados em anticorpos com três especificidades diferentes. O ensaio de microarray de varredura DOT é um método relativamente simples e já foi usado para o perfil da superfície celular de vários tipos de câncer.

Uma característica fundamental do DOT scan é sua capacidade de capturar células vivas por meio de seus antígenos de superfície, de modo que o padrão de ligação que obtemos é um reflexo do perfil da superfície da célula. Os antígenos de superfície desempenham um papel importante no desenvolvimento tumoral e metastático e na resposta inflamatória para combater o câncer. Perfis de superfície extensos ou fenótipos imunológicos podem ser usados como assinaturas de doenças para melhorar a classificação do câncer, permitindo o tratamento ideal após a cirurgia.

Ok, vamos começar. No experimento mostrado aqui, amostras clínicas de tumor de câncer colorretal, graus A a D, são coletadas no tampão de Hank. Para começar a usar dois bisturis, corte cuidadosamente o tumor em fatias finas de um milímetro.

Coloque as fatias em uma solução de colágeno a 2% tipo quatro e 10% de DNA para digestão. Seções de mucosa intestinal normal do mesmo paciente são coletadas a 10 centímetros de distância do local do tumor primário. Isso atua como nosso controle e é processado de forma idêntica à amostra do tumor.

A digestão do tumor ocorre a 37 graus Celsius por uma hora para promover a quebra do tecido conjuntivo, o D ns limpará o DNA de quaisquer células danificadas. Após a incubação, a suspensão de tecido é passada através de uma lavagem de malha de arame chamada tampão Hanks sobre a amostra, enquanto o êmbolo de uma seringa de 10 mil é usado para ajudar a empurrar as células. Este processo é repetido várias vezes até que a maioria das células tenha passado pela tela de arame.

A malha separa as células de qualquer tecido conjuntivo não digerido. Em seguida, filtre ainda mais a suspensão celular levando-a em uma seringa de 10 M e filtrando através de um filtro fcon de 200 micrômetros seguido por um filtro fil con 50 micrômetros. Esses filtros mais finos devem garantir a remoção do excesso de muco ou DNA, bem como a quebra de aglomerados de células para obter uma suspensão unicelular viável.

O mesmo tratamento é feito para a mucosa normal. Descobrimos que a mucosa normal tende a conter mais tecido conjuntivo e, como resultado, leva mais algumas lavagens para passar pela suspensão de células centrífugas de malha a 410 G a 20 graus Celsius por cinco minutos. Em preparação para o armazenamento refrigerado, suspendemos o palete de células com 750 microlitros de soro fetal de bezerro, seguido de eco volumes de soro fetal de bezerro com DMS.

Então, solução neste DMS. Portanto, a solução gota a gota com alíquota de mistura constante do supinato em tubo criogênico e colocada em um recipiente isolador. Essas amostras podem ser armazenadas em menos 80 por até um ano.

O isolamento e o DMSO devem garantir que as células se liberem lentamente sem estourar. Um efeito colateral do armazenamento é a lise da população de glóbulos vermelhos. Felizmente para nós, eles não são necessários.

Para o experimento. Retire as amostras do armazenamento e jogue-as rapidamente. Em um banho de água de 37 graus Celsius, ressuspenda a suspensão celular em 10 mils de tampão de Hank, o tampão deve ajudar a diluir as células centrais de 10% DMSO e soro fetal de bezerro por cinco minutos a 410 GS a 20 graus Celsius.

Em seguida, decantar o snat e ressuspender em 500 microlitros de tampão de Hank, algumas células podem ser interrompidas durante o processo de congelamento e descongelamento, causando uma liberação de DNA em uma suspensão. Para combater esse problema, incube a amostra com 0,1% de DNAs à temperatura da vassoura. Durante esse tempo, uma contagem de viabilidade celular pode ser realizada.

Misture quantidades iguais de azul triam com 10 microlitros de suspensão celular e pipete 10 microlitros da mistura em um contador de células. Sob o microscópio, células saudáveis e viáveis parecem claras. Por outro lado, células não viáveis com suas membranas rompidas aparecerão em azul.

Um mínimo de 4 milhões de células viáveis são necessárias para a captura celular no anticorpo DOT scan. MICRORAY caindo. O tratamento com DNA lavou as células pela segunda vez com 10 mils de tampão de Hank e centrifugou a 410 G por cinco minutos e 20 graus Celsius.

Suspendemos a paleta de células final com 200 microlitros de mídia RPMI. Este meio contém relativamente mais nutrientes do que o tampão Hanks e é usado para facilitar a captura celular no microarray de anticorpos, mantendo a viabilidade celular. O microarray de anticorpos de varredura de pontos de câncer colorretal consiste em 140 pontos de anticorpos diferentes duplicados na nitrocelulose.

Cada ponto na matriz contém 10 nanolitros de um anticorpo monoclonal contra o antígeno da superfície celular. Para preparar o microarray de anticorpos, mergulhe-o em uma bandeja de PBS para umedecer a nitrocelulose e limpe a borda de vidro da matriz. Com os lenços umedecidos Kim, toma-se cuidado para não tocar na seção de nitrocelulose, colocar o microarray em uma bandeja e pipetar a suspensão celular na nitrocelulose.

Uma disseminação uniforme da suspensão celular garantirá que todos os anticorpos tenham o potencial de capturar células. Incube o microarray a 37 graus Celsius por uma hora. Durante a incubação, diferentes células desciam e entravam em contato com anticorpos nas células da matriz.

Os antígenos de superfície presentes correspondentes ao seu anticorpo se ligarão e capturarão a célula após a incubação. Lave as células não ligadas mergulhando suavemente as matrizes em três mudanças de PPS fresco. Fixe as células de ressalto em 10% da altura externa e solução PPS.

Pipete suavemente uma quantidade generosa de fixador para cobrir a seção de carga da célula nitro. Incube por 20 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, mergulhe os microarrays três vezes em PBS fresco.

Deixe as matrizes em PBS de molho por 30 segundos em cada lavagem, pois o excesso de altura do exterior pode interferir na multiplexação de fluorescência. Podemos verificar agora se temos ligação celular segurando um microarray sob alguma luz para uma análise muito mais precisa. O scanner de varredura DOT e o software de análise nos permitem escanear o padrão de ligação e produzir resultados quantificados da expressão do antígeno em uma população de células mistas.

O software compara a intensidade da ligação celular com o ruído de fundo em uma escala de granulação de oito bits. As unidades de intensidade são normalizadas para um valor máximo de 256. Para facilitar a comparação entre uma matriz, qualquer ligação de controle do tipo gelo positivo é deduzida dos anticorpos com os isotipos IG correspondentes.

Adicione 200 microlitros de tampão de bloqueio ao microarray e incube por 20 minutos em temperatura ambiente. Em preparação para multiplexação de fluorescência em 118 microlitros de tampão de bloqueio, adicione 10 microlitros de CD ardente e conjugado três e 20 microlitros de epam conjugado Alexa. Além disso, dois microlitros de soro inativado também são adicionados à mistura para evitar ligações inespecíficas.

Quando o bloqueio estiver concluído, o buffer de bloqueio é substituído por uma solução de multiplexação e incubado no escuro por 30 minutos. À temperatura ambiente durante a incubação, o CD três anticorpos conjugados se ligará às células T expressas do CD três ligadas à matriz, enquanto o anticorpo conjugado com EPAM se ligará às células epiteliais ou células de câncer colorretal na matriz. Em seguida, observe o micro array três vezes em PBS fresco para que sequem no escuro antes de verificar a fluorescência.

A fluorescência é detectada com um tufão FLA 9, 000 scanner cd. O perfil FICO ery é escaneado usando um laser de 5 2 3 nanômetros e um filtro de emissão 5 8 0 BP 30 EP camm Alexa 6 4 7 é escaneado usando um laser de 6 3 3 nanômetros e um filtro de emissão 6 7 0 BP 30. As imagens fluorescentes resultantes são convertidas para o formato de ponta para análise.

Usando um software de varredura DOT. A multiplexação fluorescente nos permite distinguir perfis de antígenos de diferentes populações de células dentro da mesma amostra de tecido. As imagens mostradas aqui são de uma amostra de câncer colorretal.

Essas três imagens são de uma varredura óptica, varredura fluorescente para células que expressam CD três e varredura fluorescente para células que expressam EPAM. Os resultados do microray de varredura DOT devem mostrar padrões consistentes de ligação celular entre as duas lâminas duplicadas. A intensa ligação de pontos de alinhamento ao longo da borda da lâmina indica que quantidades adequadas de células foram capturadas.

Um relatório em PDF pode ser gerado para fornecer valores quantitativos à vinculação de células. O gráfico de barras. A representação da ligação celular mostra uma diferença na expressão do antígeno entre a mucosa normal e a amostra do tumor.

Os resultados ópticos dada a representação geral da expressão do antígeno em todos os tipos de células dentro da amostra, os resultados da multiplexação AAM mostram uma imagem mais clara da diferença na expressão do antígeno entre células epiteliais normais e cancerígenas. Embora muitos dos antígenos diferencialmente expressos sejam biomarcadores de câncer colorretal conhecidos como um grupo, eles fornecem uma assinatura de doença muito mais precisa para estratificação do que qualquer biomarcador único pode alcançar. Os resultados da multiplexação CD três mostram mais células T na amostra de câncer em comparação com o normal.

Freqüentemente, as células T cancerígenas estão expressando marcadores de ativação, dando origem à possibilidade de que essas células T sejam linfócitos infiltrantes de tumor ou células T associadas a inflamações. A análise em larga escala pode ser conduzida pelo visualizador de vários experimentos versão 4.4, um software de análise de dados e mapa de calor de código aberto. O agrupamento hierárquico de amostras de câncer colorretal pode ser usado para correlacionar com o estágio da doença ou o prognóstico do paciente.

Uma extensa biblioteca de assinaturas de doenças é uma ferramenta valiosa na previsão de prognóstico Em pacientes com câncer colorretal ou na determinação do curso do tratamento pós-operatório, acabamos de mostrar seu procedimento para traçar o perfil da expressão de antígenos de superfície em uma população de células mistas em tecido de câncer colorretal usando o microarray de anticorpos de varredura DOT e multipley de fluorescência. Um aspecto importante deste experimento a ser lembrado é que sempre use tecido fresco e pelo menos 4 milhões de células viáveis são necessárias para que esse experimento funcione. Obrigado por assistir a este vídeo e boa sorte com seus experimentos.