Name: Formulación de nanopartículas poliméricas mediante la técnica de dibloque Nanoprecipitation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Aprende a sintetizar nanopartículas poliméricas mediante nanoprecipitación de dibloques para aplicaciones en liberación de fármacos antitumorales. Este método mejora la solubilidad de terapéuticos poco solubles.

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Este trabajo fue financiado por los jugadores de golf contra el cáncer, Carolina del Centro para la Nanotecnología piloto beca para la excelencia, la Universidad de Cancer Research Fund y el Instituto Nacional de Salud K-12 Premio de Desarrollo Profesional.

1. Síntesis de PLGA-PEG-b polímero <ol><li> Poli (D, L-láctico-co-glicólico) (PLGA) con grupos terminales carboxilato (PLGA-carboxilato) se disuelve en los disolventes de PLGA (como se menciona en la sección de materiales) a una concentración de 5 mm. PLGA puede ser disuelto en esta concentración con agitación suave. </li><li> Ambos NHS (peso molecular 115,09) y el EDC (peso molecular 191,7) se disuelven en la solución de PLGA en una concentración de 25 mM. (Tanto la EDC y NHS se añaden en un exceso estequiométrico de 5 veces en comparación con PLGA). PLGA-carboxilato se convierte en PLGA-NHS mediante la adición de EDC y NHS de PLGA-carboxilato de solución con agitación suave durante 1 hora aproximadamente. </li><li> El producto de reacción PLGA-NHS se precipita por la adición de metanol de la solución de lavado. Aproximadamente 10 veces el exceso de volumen de metanol, se añade a la solución. La solución se centrifuga a 2000 xg para precipitar el PLGA-NHS y descartar el sobrenadante (elimina los rastros de la EDC y NHS. Este procedimiento de lavado con metanol se repite al menos tres veces. </li><li> El pellet de PLGA-NHS se seca al vacío durante 30 minutos para eliminar cualquier rastro de la solución de lavado. </li><li> El pellet de PLGA-NHS está re-disuelto en el mismo disolvente a la misma concentración que se utilizó inicialmente para disolver PLGA. El PEG heterobifuncionales (amino-PEG-carboxilato), se añade a la solución de PLGA en una concentración de 5 mm (relación estequiométrica de 1:1). La solución se incuba durante 24 horas con agitación constante. </li><li> Después de 24 horas, el producto de reacción PLGA-PEG-b de copolímero de bloque se precipita por la adición de la solución de lavado de metanol en exceso. Repita el proceso de lavado y centrifugación como se mencionó anteriormente en tres ocasiones. Esto eliminará todos los PEG exceso sin reaccionar. </li><li> El copolímero de PLGA-PEG-b bloques se seca al vacío. </li></ol> 2. PLGA-PEG-b preparación de nanopartículas Las nanopartículas con núcleo de PLGA cubiertos con PEG a la superficie se pueden preparar con estos copolímeros de bloque doble. Una variedad de diferentes fármacos hidrofóbicos pueden ser encapsulados en nanopartículas. Compuestos fluorescentes puede ser encapsulado en las nanopartículas, o puede ser conjugado con PLGA y por lo tanto estas nanopartículas se pueden utilizar para imágenes de fluorescencia. Nanoprecipitation método se utiliza para hacer las nanopartículas sobre todo cuando la carga que se desea encapsular es altamente hidrofóbico en la naturaleza. <ol><li> El PLGA-PEG-b de copolímero de bloque y de la droga / de carga (a encapsular) son disueltos en cualquier disolvente que disuelve PLGA. PLGA puede ser disuelto por muchos solventes comunes, como acetonitrilo, DCM, tetrahidrofurano, acetona o acetato de etilo. La elección del disolvente es crucial, ya que influye en las propiedades de las nanopartículas. Por lo tanto, disolvente apropiado se debe utilizar en este paso. </li><li> La mezcla de polímero / fármaco se añade gota a gota a 5.3 volúmenes de agua agitando dando una concentración de polímero final de alrededor de 3 mg / ml. (Fig. 2) </li><li> Se mantiene la agitación durante 2 horas a presión reducida para permitir que las nanopartículas se forman por el auto-ensamblaje y eliminar los restos de disolvente orgánico. </li><li> La recolección y purificación: Las nanopartículas son luego se concentró por centrifugación a 2.700 x g durante 10 minutos usando un filtro Amicon (MWCO 20 kDa), se lavan, y se reconstituyó en PBS. Esto elimina toda la carga sin atrapado drogas /. Caracterizaciones biofísicas básicas, tales como tamaño, carga superficial, y la eficiencia de carga de fármaco se puede realizar para comprender mejor las propiedades de las nanopartículas. </li></ol> 3. Almacenamiento La liofilización es un método comúnmente utilizado para almacenar las nanopartículas 11. La liofilización se conservan las características físicas y químicas de las nanopartículas para la estabilidad a largo plazo 12. El proceso de secado por congelación puede causar la tensión en las partículas y desestabilizar a la formulación, por lo que la crio-protectores (protección contra el estrés de congelación) y lyo-protectores (protección contra el estrés de secado) se utilizan comúnmente. La elección de estos protectores está determinado por el tiempo deseado de almacenamiento 13. <ol><li> En el secado por congelación, no es la solidificación total de la muestra mediante la congelación por debajo de su Tg. </li><li> En la etapa de secado, el hielo se elimina por sublimación. Temperatura y la presión debe ser optimizado para lograr un eficiente proceso de liofilización. </li></ol> 4. Los resultados representativos: Caracterización de PLGA-PEG-b-Di copolímero de bloque Diferentes técnicas se pueden utilizar para confirmar la conjugación exitosa de los polímeros. La composición de PLGA-PEG-b se puede caracterizar con un 400 MHz 1H resonancia magnética nuclear (RMN). Peso molecular del producto formado (PLGA-PEG-b) puede ser verificada por cromatografía de permeación en gel (GPC). El PLGA-b - PEG de peso molecular distribution la curva y el tiempo de elución debe ser diferente de PLGA y solo PEG. En combinación, estas técnicas deben caracterizar el producto formado y determinar si la reacción de conjugación se ha realizado correctamente. Caracterización de PLGA-PEG-b nanopartículas El tamaño de partícula y distribución de tamaño puede ser medido por dispersión de luz dinámica. Diferentes parámetros en el proceso de nanoprecipitation afectar el tamaño de las partículas. Pesos moleculares de los polímeros utilizados inicialmente (tanto PLGA y PEG) también afectan la distribución del tamaño de las partículas. Microscopía de transición de electrones (TEM) también se puede utilizar para confirmar la distribución del tamaño y la estructura de las nanopartículas como se ve en la figura 3. El rango de tamaño de partícula es generalmente en el rango nm. De gran tamaño de partículas con distribución de tamaño irregular podría indicar un error en la reacción de conjugación o la optimización del método nanoprecipitation necesidades. Además, la superficie potencial zeta puede ser medido por ZetaPALS. La eficiencia de carga de fármaco / carga se puede cuantificar con el estándar de HPLC. Las partículas se disuelven en disolventes orgánicos y HPLC se pueden realizar para medir la absorción de la droga / carga (Fig. 4). El estudio de cinética de liberación de fármacos se puede hacer cuando se conozca cantidades fijas de las nanopartículas se dializan en 30 Slide-A-Lyzer unidades de diálisis MINI. En intervalos de tiempo fijos, el contenido de la unidad de diálisis se recoge y el mismo volumen de disolvente orgánico, se añade la disolución de las nanopartículas. HPLC se lleva a cabo en estas muestras para cuantificar el contenido de drogas / carga. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. EDC / NHS química <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Nanoprecipitation método para la preparación de nanopartículas poliméricas. La solución orgánica de un disolvente (acetonitrilo o DCM) que contiene el bloque doble PEG-PLGA y la droga o la carga que se carga en la partícula se añade gota a gota a 5.3 mL de agitación H 2 O. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Microscopía Electrónica de Transmisión de nanopartices. Una imagen de TEM de PEG-PLGA nanopartículas que contienen wortamin. Ácido fosfotúngstico fue utilizado como un agente de contraste. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Liberación controlada de drogas a partir de nanopartículas. Liberación de paclitaxel a partir de nanopartículas después de la diálisis en PBS. En el momento señalado, las partículas fueron retirados de cassettes de diálisis y solubilizados en acetonitrilo. La solución se midió por HPLC. Dos lotes separados de las nanopartículas fueron comparados. <div id="myEventWatcherDiv"></div><div id="myEventWatcherDiv"></div>

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método nanoprecipitation con copolímeros de bloque doble representa un método sencillo, rápido para diseñar nanopartículas poliméricas. Las nanopartículas resultantes se componen de un núcleo hidrofóbico que puede ser utilizado para la entrega de los compuestos de baja solubilidad. La capa de superficie hidrofílica permite una excelente solubilidad en el agua mientras que proporciona una fracción de la conjugación más potencial a un ligando de orientación. Hay muchas plataformas de nanopa...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> EDC </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22980 </td><td> Conjugación del reactivo </td></tr><tr><td> NHS </td><td> Thermo Scientific </td><td> 24500 </td><td> Conjugación del reactivo </td></tr><tr><td> amino-PEG-carboxilato </td><td> Laysan Bio Inc. </td><td> NH2-PEG-CM-5000 </td><td> Polímero (se puede usar cualquier MW PEG, 5000 está en la lista) </td></tr><tr><td> PLGA-carbxylate </td><td> Lactel </td><td> B6013-2 </td><td> Polímero </td></tr><tr><td> Diclorometano (DCM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 34856 </td><td> Solvente </td></tr><tr><td> Acetonitrilo&gt; 99% de pureza </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 34851 </td><td> Solvente </td></tr><tr><td> Metanol&gt; 99% de pureza </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 34860 </td><td> Lavar </td></tr></tbody></table>

formulación de nanopartículas poliméricas mediante la técnica de dibloque nanoprecipitation

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

La nanotecnología es una rama relativamente nueva de la ciencia que consiste en aprovechar las propiedades únicas de partículas que están en la escala de nanómetros (nanopartículas). Las nanopartículas pueden ser diseñados de una manera precisa en que la química puede ser su tamaño, la composición y la superficie cuidadosamente controladas. Esto permite una libertad sin precedentes para modificar algunas de las propiedades fundamentales de su carga, como la solubilidad, la difusividad, las características de liberación de biodistribución y la inmunogenicidad. Desde su creación, las nanopartículas se han utilizado en muchas áreas de la ciencia y la medicina, incluyendo la administración de fármacos, imágenes, y la biología celular 1-4. Sin embargo, no se ha utilizado plenamente fuera de &quot;laboratorios de nanotecnología&quot;, debido a la barrera percibida técnica. En este artículo se describe un método simple para sintetizar una plataforma basada en nanopartículas de polímeros que cuenta con una amplia gama de aplicaciones potenciales. El primer paso es sintetizar un copolímero de bloque doble que tiene tanto un dominio hidrofóbico y un dominio hidrofílico. Utilizando PLGA y PEG como polímeros modelo, que describe una reacción de conjugación con EDC / NHS química 5 (Fig. 1). También se discute el proceso de purificación del polímero. El bloque doble sintetizado co-polímero puede auto-ensamblan en las nanopartículas en el proceso de nanoprecipitation a través de interacciones hidrofóbicas hidrofílicos. Las nanopartículas de polímeros se describe es muy versátil. El núcleo hidrofóbico de las nanopartículas pueden ser utilizadas para llevar a los medicamentos poco solubles para la administración de fármacos experiments6. Además, las nanopartículas pueden superar el problema de solventes tóxicos para los reactivos de biología molecular poco solubles, tales como wortmannin, que requiere un solvente como el DMSO. Sin embargo, el DMSO puede ser tóxico para las células e interferir con el experimento. Estos fármacos poco solubles y los reactivos pueden ser efectivamente entregados el uso de nanopartículas de polímeros con una toxicidad mínima. Nanopartículas de polímeros también se pueden cargar con un colorante fluorescente y se utilizan para los estudios de tráfico intracelular. Por último, estas nanopartículas de polímeros se pueden conjugar a la orientación a través de ligandos PEG superficie. Tales nanopartículas dirigidas pueden ser utilizados para etiquetar epítopos específicos en las células o en 7.10.

En este artículo se describe un método para sintetizar nanoprecipitation a base de polímeros con nanopartículas de copolímeros de bloque doble. Vamos a discutir la síntesis de copolímeros de bloque doble, la técnica nanoprecipitation, y sus posibles aplicaciones.

Formulación de nanopartículas poliméricas mediante la técnica de dibloque Nanoprecipitation

La nanotecnología es una rama de la ciencia relativamente nueva que consiste en aprovechar las propiedades únicas de las partículas que tienen una escala de nanómetros...

El objetivo general de este procedimiento es sintetizar nanopartículas poliméricas utilizando un método de nanoprecipitación. Esto se logra primero realizando una reacción E-D-C-N-H-S para generar el copolímero A-P-L-G-A PEG. Luego, el copolímero PLGA PEG se utiliza para generar nanopartículas, encapsulando el fármaco o carga de interés mediante nanoprecipitación.En este momento, se puede realizar la caracterización biofísica básica, incluyendo tamaño, carga superficial y eficiencia de carga del fármaco, mediante microscopía electrónica de transmisión, dispersión dinámica de la luz o HPLC. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de tumores porque las nanopartículas pueden entregar fármacos anticancerígenos poco solubles, lo que podría ser más efectivo que los tratamientos actuales. Aunque este método puede proporcionar información sobre el tratamiento del cáncer.También puede utilizarse para estudiar otros sistemas, como el tráfico celular. Las nanopartículas pueden conjugarse con un ligando de direccionamiento y visualizarse in vivo o in vitro mediante el uso de un agente de imagen, demostrando así la técnica. Hoy estarán dos técnicos de nuestro laboratorio, Rohit Sukumar y Natalie Cummings, para comenzar la síntesis del copolímero PLGA PEG, disolviendo PLGA, carboxilato, en acetonitrilo a una concentración de cinco milimolar con agitación suave.Luego, agregue suficiente NHS y EDC para obtener concentraciones de 25 milimolares, proporcionando un exceso estequiométrico de cinco veces en comparación con PLGA, y agite suavemente la solución durante aproximadamente una hora para permitir que el carboxilato de PLGA se convierta en PGA NHS. Después de una hora, precipite el producto de reacción de PGA NHS añadiendo la solución de lavado, metanol, en un volumen aproximadamente diez veces mayor, en exceso respecto a la solución; centrifugue la solución a 2000 × g para formar el pellet de P-L-G-A-N-H-S. Tras la centrifugación, deseche el sobrenadante para eliminar los rastros de EDC y NHS. Este procedimiento de lavado con metanol se repite al menos tres veces.Una vez finalizado el lavado, seque el pellet de P-L-G-A-N-H-S bajo vacío durante 30 minutos para eliminar cualquier rastro de la solución de lavado. A continuación, vuelva a disolver el pellet de P-L-G-A-N-H-S en acetoni­trilo a la misma concentración que se utilizó inicialmente para disolver el PLGA.Una vez disuelto, agregue PEG heterobifuncional a la solución de PLGA. Agregue una concentración de cinco milimolares.Incube la solución de mezcla durante 24 horas con agitación constante después de 24 horas. Precipite el producto de reacción del copolímero en bloque PLGA PEG añadiendo metanol en exceso. Realice el lavado y el proceso de centrifugación tres veces adicionales para eliminar todo el PEG no reaccionado en exceso.Como paso final en la síntesis, seque el copolímero en bloque PLGA PEG bajo vacío. La precipitación de nanopartículas comienza disolviendo el copolímero en bloque PLGA PEG y el fármaco que se encapsulará en el disolvente A-P-L-G-A. La elección del disolvente es crítica, ya que influye en las propiedades de la nanopartícula. Luego, añada la mezcla de polímero y fármaco gota a gota a tres o diez volúmenes de agua en agitación para obtener una concentración final de polímero de aproximadamente tres miligramos por mililitro. Gotas a gotas.La adición de la solución orgánica a la fase acuosa es fundamental para formar nanopartículas del tamaño correcto. Continúe agitando durante dos horas bajo presión reducida para permitir que las nanopartículas se formen por autoensamblaje y eliminar los residuos del disolvente orgánico. Después de dos horas de agitación.Concentre las nanopartículas mediante centrifugación a 2.700 × g durante 10 minutos utilizando un filtro Amon. Luego, lave las nanopartículas con PBS para eliminar cualquier fármaco no atrapado y proceda con la centrifugación. Finalmente, reconstituya las nanopartículas en PBS en este punto.La caracterización biofísica básica, que incluye tamaño, carga superficial y eficiencia de carga del fármaco, puede realizarse para comprender mejor las propiedades de las nanopartículas. Las nanopartículas pueden almacenarse según lo descrito en el protocolo escrito; para caracterizarlas, se utilizó microscopía electrónica de transmisión para confirmar el tamaño, la distribución y la estructura de las nanopartículas de PLGA PEG. El tamaño de las partículas generalmente se encuentra en el rango de nanómetros.Tamaños grandes de partículas con distribuciones de tamaño irregulares podrían indicar ya sea un error en la reacción de conjugación o que el método de nanoprecipitación necesita optimización. Aquí se muestra un estudio cinético de liberación de fármacos en el que se cuantificó la eficiencia de carga y la liberación de paclitaxel mediante HPLC estándar. Se dializaron cantidades fijas conocidas de las nanopartículas a intervalos de tiempo fijos.Se recogió el contenido de la unidad de diálisis y se añadió un volumen igual de disolvente orgánico para disolver las nanopartículas. A continuación, se realizó HPLC en estas muestras. Para cuantificar el contenido de paclitaxel, una vez dominada, esta técnica de nanoprecipitación puede realizarse adecuadamente en tres horas.Recuerde que al realizar esta técnica debe agregar siempre la fase orgánica lentamente a la fase acuosa para evitar la formación de partículas grandes tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores del cáncer en el campo de la nanomedicina exploraran el uso de fármacos poco solubles que antes se consideraban demasiado tóxicos en pacientes con cáncer tras este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como estudios de eficacia in vivo o estudios de imagen, para responder preguntas como si los fármacos poco solubles son efectivos cuando la toxicidad sistémica ya no es un problema, o si los ligandos de direccionamiento dirigen adecuadamente las nanopartículas hacia su destino.

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Un protocolo para el análisis de nanopartículas de seguimiento (NTA) y de alto rendimiento de citometría de flujo para evaluar las nanopartículas poliméricas de suministro de genes se describe. NTA se utiliza para caracterizar la distribución del tamaño de partícula de nanopartículas y la distribución de partículas por plásmido. De alto rendimiento de la citometría de flujo permite una evaluación cuantitativa eficacia de la transfección de una biblioteca de biomateriales de suministro de genes.

La evaluación de la administración de genes nanopartículas poliméricas por nanopartículas de análisis de seguimiento y de alto rendimiento Citometría de Flujo

Se describe el método de las células madre de programación para sobreexpresar factores terapéuticos para la angiogénesis usando nanopartículas poliméricas biodegradables. Procesos descritos incluyen la síntesis de polímeros, la transfección de células madre derivadas de tejido adiposo in vitro, y la validación de la eficacia de las células madre programado para promover la angiogénesis en un modelo de isquemia de las extremidades posteriores murino.

Células Madre Programación para Terapéutico Angiogénesis Uso Biodegradable polimérico nanopartículas

Dos fluidos adyacentes que pasan a través de un canal microfluídico ranurado pueden ser dirigidos para formar una vainta alrededor de un núcleo de prepolímero; determinando así tanto la forma como la sección transversal. La polimerización fotoiniciada, como la química de tiol click, es muy adecuada para solidificar rápidamente el fluido central en una microfibra con tamaño y forma predeterminados.

Fabricación Microfluídica De Fibras Poliméricas Y Biohíbridas Con Tamaño y Forma Prediseñados

Aprende a sintetizar nanopartículas poliméricas mediante nanoprecipitación de dibloques para aplicaciones en liberación de fármacos antitumorales. Este método mejora la solubilidad de terapéuticos poco solubles.

Formulación de nanopartículas poliméricas mediante la técnica de dibloque Nanoprecipitation

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