Formulación de nanopartículas poliméricas mediante la técnica de dibloque Nanoprecipitation

El objetivo general de este procedimiento es sintetizar nanopartículas poliméricas utilizando un método de nanoprecipitación. Esto se logra realizando primero una reacción E-D-C-N-H-S para generar el copolímero A-P-L-G-A PEG. A continuación, el copolímero PLGA PEG se utiliza para generar nanopartículas, encapsulando el fármaco o la carga de interés a través de la nanoprecipitación.

En este punto, la caracterización biofísica básica, incluido el tamaño, la carga superficial y la eficiencia de la carga del fármaco, se puede realizar mediante microscopía electrónica de transmisión de dispersión dinámica de luz o HPLC. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de tumores porque las nanopartículas pueden administrar terapias anticancerígenas poco solubles, que pueden ser más efectivas que los tratamientos actuales. Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre el tratamiento del cáncer.

También se puede utilizar para estudiar otros sistemas, como el tráfico celular. Las nanopartículas pueden conjugarse con un ligando objetivo y visualizarse in vivo o in vi in vitro mediante el uso de un agente de imagen que demuestre la técnica. Hoy serán dos técnicos de nuestro laboratorio, Rohit Sukumar y Natalie Cummings, para comenzar la síntesis del copolímero PLGA PEG disolver PLGA, carboxilato en acetonitrilo a una concentración de cinco milimolares con agitación suave.

A continuación, añada suficiente NHS y EDC para obtener concentraciones de 25 milimolares, proporcionando un exceso métrico de cinco veces en comparación con el PLGA, agite suavemente la solución durante aproximadamente una hora para permitir que el carboxilato de PLGA se convierta en PGA NHS. Después de una hora, precipite el producto de reacción PGA NHS agregando la solución de lavado metanol a aproximadamente 10 veces el volumen, el exceso de metanol a la solución centrífuga la solución a 2000 veces G a pellet, el P-L-G-A-N-H-S después de la centrifugación desecha la SUP natin para eliminar las trazas de EDC y NHS. Este procedimiento de lavado con metanol se repite al menos tres veces.

Después de que se complete el lavado. Seque el P-L-G-A-N-H-S al vacío durante 30 minutos para eliminar cualquier rastro de la solución de lavado. Ahora disuelva el pellet P-L-G-A-N-H-S en el ensayo de aceto NI a la misma concentración que se utilizó inicialmente para disolver el PLGA.

Una vez disuelto. Añada PEG hetero bifuncional a la solución PLGA. Añadir una concentración de cinco milimolares.

Incubar la solución de la mezcla durante 24 horas con agitación constante después de 24 horas. Precipite el producto de reacción del copolímero de bloque PLGA PEG agregando metanol en exceso. Realice el proceso de lavado y centrifugación y tres veces adicionales para eliminar todo el exceso de clavija no reactiva.

Como paso final en la síntesis, el copolímero de bloque PLGA PEG se seca bajo un vacío, la precipitación de nanopartículas comienza con la disolución del copolímero de bloque PLGA PEG y el fármaco que se encapsulará en el solvente A-P-L-G-A. La elección del disolvente es fundamental, ya que influye en las propiedades de la nanopartícula. A continuación, añada la mezcla de polímeros y fármacos, gota a gota, a tres a 10 volúmenes de agua de agitación para obtener una concentración final de polímero de alrededor de tres miligramos por mililitro. Gota a gota.

La adición de la solución orgánica a la fase acuosa es fundamental para formar nanopartículas del tamaño correcto. Continúe la agitación durante dos horas a presión reducida para permitir que las nanopartículas se formen por autoensamblaje y eliminen los restos del solvente orgánico. Después de dos horas de remover.

Concentrar las nanopartículas por centrifugación a 2.700 veces G durante 10 minutos utilizando un filtro Amon. A continuación, lave las nanopartículas con PBS para eliminar cualquier fármaco no atrapado y siga mediante centrifugación. Finalmente, reconstituir las nanopartículas en PBS en este punto.

La caracterización biofísica básica, incluido el tamaño, la carga superficial y la eficiencia de la carga del fármaco, se puede realizar para comprender mejor las propiedades de las nanopartículas. Las nanopartículas se pueden almacenar como se describe en el protocolo escrito para caracterizar las nanopartículas PLGA Se utilizó microscopía electrónica de transmisión de nanopartículas PEG para confirmar el tamaño, la distribución y la estructura de las nanopartículas. El tamaño de partícula está generalmente en el rango nanométrico.

Los tamaños de partícula grandes con distribuciones de tamaño desiguales podrían indicar un error en la reacción de conjugación o que el método de nanoprecipitación necesita optimización. Aquí se muestra un estudio cinético de liberación de fármacos en el que se cuantificó la eficiencia de carga y liberación de Paclitaxel con HPLC estándar. Las cantidades fijas conocidas de las nanopartículas se dializaron a intervalos de tiempo fijos.

Se recolectó el contenido en la unidad de diálisis y se agregó un volumen igual de solvente orgánico para disolver las nanopartículas. A continuación, se realizó HPLC en estas muestras. Para cuantificar el contenido de Paclitaxel, una vez dominado, esta técnica de nano precipitación se puede realizar adecuadamente en tres horas.

Recuerde al realizar esta técnica agregar siempre la fase orgánica lentamente a la fase acuosa para evitar la generación de partículas grandes después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores del cáncer en el campo de la nanomedicina exploraran el uso de medicamentos poco solubles que alguna vez se consideraron demasiado tóxicos en pacientes con cáncer después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como los estudios de eficacia in vivo o los estudios de imagen, para responder a preguntas como si los fármacos poco solubles son eficaces, cuándo la toxicidad sistémica ya no es un problema, o si los ligandos dirigidos correctamente dirigen las nanopartículas a su destino.