La grabación simultánea de señales de calcio en neuronas identificadas y comportamiento de alimentación de Drosophila melanogaster

El objetivo general de este procedimiento es monitorear la actividad neuronal mediante imágenes de calcio simultáneamente con la observación del comportamiento alimentario. Esto se logra insertando primero una mosca en el aparato de las moscas. A continuación, se disecciona la cabeza de la mosca para exponer el cerebro.

A continuación, el aparato de la mosca con la mosca disecada se coloca en la platina del microscopio. El paso final del procedimiento es la estimulación de pro Bois con una mecha de azúcar. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la activación de una neurona identificada a través de imágenes de calcio correlacionadas con la extensión de Probus a través de la grabación en video del comportamiento.

La primera vez que tuve la idea de este método fue cuando pensé en los ojos de las cervezas que nadan en la superficie del agua. Las cervezas tenemos los ojos divididos y podemos ver tanto por encima como por debajo de la superficie del agua. Un punto complicado de mi experimento es que el cerebro y las SCU están cerca el uno del otro, pero si están bien separados como los ojos de las cervezas, podemos mantener las SCU secas mientras el cerebro está expuesto en el satélite.

Esto hice una partición muy simple justo encima de las SCU para separar la cara seca del lugar de ancho, Dé forma a una plataforma con la tapa de un plato de halcón de 35 milímetros derritiendo la pared lateral y tallándola para formar un ángulo y grosor apropiados. Taladre un agujero en la plataforma para aceptar la cabeza de la mosca, de modo que las partes de la boca queden expuestas libremente al exterior de la cámara. Corta el extremo de la punta de una pipeta lo suficientemente ancho como para aceptar el cuerpo de la mosca y, a continuación, pega la punta a la plataforma.

Después de matar de hambre, una mosca adulta durante 24 horas a 25 grados centígrados. Anestesia a la mosca colocándola en un tubo de plástico de 15 mililitros, colocándola sobre hielo con pinzas. Inserte una mosca en la cámara de las moscas y empuje suavemente la mosca hasta que no pueda moverse.

Selle las partes circundantes del probos proximal o la tribuna hasta el borde interior del agujero aplicando una pequeña cantidad de pegamento fotopolimerizable a los lados y por encima de la tribuna, utilizando una pestaña o una herramienta similar para esparcir cuidadosamente el pegamento. También aplica el pegamento desde el interior de las moscas hasta el espacio entre la parte dorsal de la cabeza y el borde interior del agujero. Finalmente, cure el pegamento con la iluminación más débil de luz azul suficiente para el curado y evitar dañar la mosca.

Para estabilizar la cabeza de la mosca y exponer la parte ventral del SOG, coloque una rosca para mantener el rostro parcialmente levantado. Con la mosca en su lugar, llene la superficie de la plataforma con solución salina sin sacarosa. Abra la cápsula de la cabeza para exponer el SOG con una cuchilla de tungsteno y pinzas con puntas afiladas que llamamos pinzas afiladas.

Cremalleras de tisis. Esta es una demostración de cremalleras de cisco, cortando una fibra de una toallita Kim para comparar. Esto se realiza primero con tijeras de iris en el campo visual y luego frente a una regla graduada de un milímetro.

Primero, con la hoja de tungsteno, haga una incisión a través del borde posterior. A continuación, corte el lateral y los bordes anteriores con las pinzas afiladas. Levanta la pieza de cutícula cortada con las pinzas y retírala.

Corta las antenas y los nervios de las antenas con las pinzas. A continuación, retire selectivamente los sacos de aire entre el SOG y la cutícula para estabilizar el cerebro y evitar artefactos de movimiento. A continuación, corte el esófago en el extremo hacia la faringe y en el extremo entrando en el SOG para eliminar la conexión entre la faringe y el cerebro.

Luego, después de identificar y extraer el músculo 16, separe cualquier tráquea que conecte el cerebro y la cutícula. Coloque las moscas en la platina de un microscopio confocal de disco giratorio y cambie a la lente de inmersión en agua para obtener imágenes. A continuación, tome una sola sección óptica a cuatro hercios con un tiempo de exposición de 122 milisegundos utilizando un láser de excitación de 491 nanómetros enfocándose en la región de interés.

Use una aguja de jeringa con una mecha pequeña de japonés. ¿Era papel que sobresalía de la punta para ofrecer sacarosa a la mosca? Descargue una pequeña gota de solución de sacarosa en la mecha, luego aspire con un inyector conectado a la aguja a través de un tubo flexible usando un manipulador de palanca universal para sostener la aguja.

Aplique la mecha de papel lavada empapada en la punta de los probs, pero solo por un instante. Para evitar la saciedad. Monitoree la respuesta de la extensión PROBUS o el comportamiento de PER utilizando una cámara CCD conectada a un microscopio de disección simultáneamente con imágenes de calcio, y asegúrese de recopilar los datos dentro de una hora después de la disección.

Aquí se muestra una respuesta típica de extensión de prob Bois a la estimulación con un WIC que contiene 100 milimolares de sacarosa. Solución acuosa obtenida con un láser de 491 nanómetros para fluorescencia G CAMP. Las imágenes simultáneas de calcio durante el comportamiento de la respuesta de extensión de prosa que se muestran aquí primero antes y luego después de la estimulación permiten la visualización de las respuestas GAMP 3.0 inducidas por sacarosa en la neurona motora para el transportador del músculo del rostro.

En la estrella de estado, la cuantificación de la respuesta GAMP 3.0 inducida por sacarosa muestra que las neuronas motoras responden a un estímulo de sacarosa mediante un aumento brusco de la fluorescencia, seguido de una fase de restauración de varios segundos a la línea de base. La plataforma permite otros métodos como la electrofisiología o la optogenética o la psicogenética, o la activación química de las neuronas o las imágenes de laboratorio TimeLapse de estructuras marcadas con GFP para responder a preguntas adicionales como la correlación entre la plasticidad sináptica y la memoria.