La grabación simultánea de señales de calcio en neuronas identificadas y comportamiento de alimentación de Drosophila melanogaster

El objetivo general de este procedimiento es monitorear la actividad neuronal mediante imágenes de calcio simultáneamente con la observación del comportamiento alimentario. Esto se logra primero insertando una mosca en el aparato para moscas. A continuación, se disecciona la cabeza de la mosca para exponer el cerebro.

El aparato con la mosca diseccionada se coloca entonces sobre la platina del microscopio. El paso final del procedimiento consiste en estimular pro Bois con una mecha de azúcar. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestren la activación de una neurona identificada mediante imágenes de calcio, correlacionadas con la protrusión de Probus a través de la grabación en video del comportamiento.

La primera vez que tuve la idea para este método fue cuando pensé en los ojos de los escarabajos nadadores que flotan en la superficie del agua. Nosotros los escarabajos tenemos ojos divididos y podemos ver tanto por encima como por debajo de la superficie del agua. Un aspecto complicado de mi experimento es que el cerebro y las UCIs están muy cercanos entre sí, pero si están bien separados, como los ojos de nosotros los escarabajos, podemos mantener las UCIs secas mientras el cerebro está expuesto en el satélite.

Esto creó una partición muy simple justo encima de las UCs para separar la cara seca del lugar de anchura; forme una plataforma a partir de la tapa de un recipiente Falcon de 35 milímetros derritiendo la pared lateral y tallándola para formar un ángulo y grosor adecuados. Perfore un orificio en la plataforma para alojar la cabeza de la mosca, de modo que las piezas bucales queden libremente expuestas al exterior de la cámara. Corte el extremo de una punta de pipeta de modo que sea lo suficientemente ancho para alojar el cuerpo de la mosca, y luego pegue la punta a la plataforma.

Después de someter a una mosca adulta a ayuno durante 24 horas a 25 grados Celsius, anestesie la mosca colocándola en un tubo plástico de 15 mililitros, de pie sobre hielo, utilizando pinzas. Introduzca una mosca en la cámara de las moscas y empuje suavemente la mosca hasta que no pueda moverse.

Selle las partes circundantes del probóscide proximal o rostrum hasta el borde interno del orificio, aplicando una pequeña cantidad de adhesivo curable con luz en los lados y encima del rostrum, utilizando una pestaña o una herramienta similar para extender cuidadosamente el adhesivo. Aplique también el adhesivo desde el interior de las moscas al espacio entre la parte dorsal de la cabeza y el borde interno del orificio. Finalmente, cure el adhesivo con la iluminación más débil de luz azul suficiente para lograr el curado, con el fin de evitar dañar a la mosca.

Para estabilizar la cabeza de la mosca y exponer la parte ventral del SOG, sujete un hilo para mantener el rostro parcialmente elevado. Con la mosca en su lugar, cubra la superficie de la plataforma con solución salina sin sacarosa. Abra la cápsula cefálica para exponer el SOG utilizando una cuchilla de tungsteno y pinzas con puntas afiladas que llamamos pinzas afiladas.

Cierra cremalleras. Esta es una demostración de cierre de cremalleras, cortando una fibra de una toalla Kim para comparación. Primero se realiza con tijeras de iris en el campo visual, y luego frente a una regla graduada de un milímetro.

Primero, utilizando la hoja de tungsteno, realice una incisión a través del borde posterior. Luego, corte a través de los bordes lateral y anterior utilizando la pinza afilada. Levante el trozo de cutícula cortado con la pinza y retírelo.

Corte las antenas y los nervios antenales utilizando la pinza. Luego, elimine selectivamente las bolsas de aire entre el SOG y la cutícula para estabilizar el cerebro y prevenir artefactos de movimiento. A continuación, corte el esófago en el extremo hacia la faringe y en el extremo que va hacia el SOG, con el fin de eliminar la conexión entre la faringe y el cerebro.

Luego, tras identificar y extraer el músculo 16, separe cualquier tráquea que conecte el cerebro con la cutícula. Coloque las moscas en la platina de un microscopio confocal de disco giratorio y cambie al objetivo de inmersión en agua para la adquisición de imágenes. A continuación, obtenga una única sección óptica a cuatro hertzios con un tiempo de exposición de 122 milisegundos, utilizando un láser de excitación de 491 nanómetros enfocado en la región de interés.

Utilice una aguja de jeringa con una mecha pequeña de papel japonés que sobresalga por la punta para ofrecer sacarosa a la mosca. Deposite una pequeña gota de solución de sacarosa sobre la mecha y luego aspírela con un inyector conectado a la aguja mediante un tubo flexible, utilizando un manipulador con joystick para sostener la aguja.

Aplique la mecha de papel absorbente empapada a la punta de las probóscides, pero solo durante un instante, para evitar la saciedad. Supervise la respuesta de extensión de la PROBUS o el comportamiento de PER utilizando una cámara CCD acoplada a un microscopio de disección simultáneamente con la imagen de calcio, y asegúrese de recopilar los datos dentro de una hora a partir del disección.

Se muestra aquí una respuesta típica de extensión del probóscide a la estimulación con un WIC que contiene sacarosa 100 milimolar. Solución acuosa imagenada usando un láser de 491 nanómetros para la fluorescencia de G CAMP. La imagen simultánea del calcio durante el comportamiento de respuesta de extensión del probóscide mostrada aquí primero antes y luego después de la estimulación permite la visualización de las respuestas inducidas por sacarosa de GAMP 3.0 en la neurona motora del músculo protractor del rostro.

En la etapa inicial de la cuantificación del estado, la respuesta GAMP 3.0 inducida por sacarosa muestra que las neuronas motoras responden a un estímulo de sacarosa mediante un aumento brusco de la fluorescencia, seguido de una fase de restauración de varios segundos hasta el nivel basal. La plataforma permite otros métodos como electrofisiología, optogenética o psicogenética, o activación química de neuronas, así como imágenes de lapso de tiempo para estructuras marcadas con GFP, con el fin de responder preguntas adicionales, como la correlación entre plasticidad sináptica y memoria.