Purificación de Complejos nativo para el estudio estructural se utiliza un método Tag Tandem Affinity

El objetivo general de este protocolo es purificar un complejo macromolecular nativo de calidad adecuada para estudios biofísicos. Este protocolo sirve no solo como una forma de purificar un complejo, sino también como una guía detallada para evaluar la calidad estructural de la muestra durante la purificación. La principal ventaja de este protocolo es que permite purificar un ensamblaje nativo en condiciones de tampón casi fisiológicas de manera simple y rápida, para garantizar la homogeneidad de la composición.

Después de la centrifugación de las células de S. cerevisiae y la decantación del sobrenadante de acuerdo con el protocolo de texto, agregue dos mililitros de tampón de lisis enfriado y agite y / o use una pipeta serelógica de 10 mililitros para suspender el pellet. Transfiera la suspensión de la celda a un tubo de centrífuga cónico de polipropileno vacío de 50 mililitros mantenido en hielo. A continuación, utilice dos mililitros adicionales de tampón de lisis refrigerado para lavar cada botella de centrífuga y añada la solución al tubo de 50 mililitros.

Después de determinar el peso húmedo del pellet de celda, cree un baño de nitrógeno líquido dentro y alrededor de un tubo centrífugo cónico de polipropileno de 50 mililitros. A continuación, extraiga las células suspendidas en una jeringa de cinco mililitros y conecte una aguja de calibre 16 a la jeringa. Luego, congele la suspensión celular pasándola a través de la jeringa y la aguja en el baño a una velocidad de aproximadamente un mililitro por minuto para generar gotas.

Para lisar las células de levadura, comience usando nitrógeno líquido para enfriar previamente un molinillo de café. Luego agregue hasta 40 gramos de células de levadura y muela durante 25 segundos, repitiendo la molienda ocho o nueve veces. Se recomienda no purificar durante más de 10 litros de cultivo celular a la vez.

Esto minimiza el tiempo de purificación y garantiza que se mantenga la integridad estructural del complejo. Después de cada dos rondas de molienda, agregue una capa poco profunda de nitrógeno líquido al molinillo y deje que se evapore. Para evitar que las células se aglomeren, evite que las células se descongelen utilizando una espátula refrigerada con nitrógeno líquido para agitar las células.

Después de la lisis, las células deben aparecer como un polvo blanco fino. Después de verificar la lisis celular y preparar el tampón de lisis con PMSF, DTT e inhibidores de proteasa de acuerdo con el protocolo de texto, use una espátula refrigerada con nitrógeno líquido para colocar gradualmente el polvo celular lisado congelado en los tubos preparados de 50 mililitros del tampón. Con cada incremento agregado, gire suavemente los tubos de 50 mililitros a temperatura ambiente para descongelar y disolver las células y evitar que se formen burbujas.

A medida que las células se disuelven, agregue más polvo celular. Después de que se hayan agregado todas las células, continúe descongelando y disolviendo las células hasta que no se observen grupos de células congeladas en los tubos. Esto debería tomar aproximadamente 50 minutos.

A continuación, centrifugar el lisado celular a 25.000 veces g y cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Una vez que las células se lisan y después de la centrifugación, puede observar una pequeña capa oscura en el gránulo insoluble. Transfiera el sobrenadante a tubos de ultracentrífuga de policarbonato y agregue 10 microlitros de PMSF de 200 milimolares a cada tubo lleno.

Centrifugar las muestras a 100.000 veces g y cuatro grados centígrados durante una hora. Al final del giro, cuatro capas deberían ser visibles. Una bolita dura y transparente que contiene principalmente complejos ribosómicos; un pellet suave y rico en lípidos; una capa grande, transparente y teñida de amarillo que contiene la mayoría de las proteínas y complejos solubles de la célula; y una capa superior escamosa formada por lípidos.

En una cámara frigorífica a cuatro grados centígrados, utilice una pipeta de un mililitro para eliminar la mayor cantidad posible de la capa lipídica escamosa superior y deséchela. Utilice una pipeta serológica de 10 mililitros para recuperar la mayor parte de la capa amarilla clara. A continuación, utilizando una pipeta de un mililitro para evitar alterar las dos capas inferiores, recupere los últimos mililitros de esta capa.

A partir de 40 gramos de pellet de celda húmeda, normalmente se recuperan aproximadamente 48 mililitros de la capa intermedia. Después de preparar la sefarosa IgG según el protocolo de texto, combine la resina IGG con el sobrenadante de fase media y dos mini comprimidos inhibidores de la proteasa por cada 40 gramos de células. Luego colóquelo en un rotador a cuatro grados centígrados durante dos horas.

Esta es la solución por lotes de IgG. Prepare dos columnas de polietileno de 10 mililitros cortando los extremos de las columnas para producir una abertura plana. Vierta los 24 mililitros de lechada de resina IgG en suspensión o solución discontinua en cada columna y deje sedimentar por gravedad.

Esto corresponde a 200 microlitros de resina IgG empaquetada. Si la sedimentación tarda más de 30 minutos, es posible que la fase media haya sido contaminada por lípidos. Una vez completada la sedimentación, utilice cuatro volúmenes sucesivos de 10 mililitros de tampón IgG D150 para lavar la columna empaquetada.

Para llevar a cabo la escisión del virus del grabado del tabaco o de la proteasa TEV en la columna, selle la parte inferior de la columna y añada un mililitro de tampón IgG D150 y 100 microlitros de proteasa TEV. Selle la parte superior de la columna y con un mezclador térmico a 750 RPM y 18 grados centígrados, mezcle durante 20 minutos. Vuelve a suspender la resina y vuelve a mezclar durante 20 minutos.

Luego vuelva a suspender y repita la mezcla de 20 minutos por tercera vez. Regrese la columna a cuatro grados centígrados y use la gravedad para eluir el complejo de proteínas. A continuación, añadir 200 microlitros de IgG D150 para eluir el volumen muerto.

Después de preparar la resina de afinidad de calmodulina de acuerdo con el protocolo de texto, agregue el tampón de unión a calmodulina y la muestra a la resina, y use un rotador de tubo para incubar a cuatro grados Celsius durante una hora. Prepare una columna de preparación de polietileno de dos mililitros por cada 100 microlitros de lechada de calmodulina cortando el extremo de la columna para crear una abertura plana. El protocolo detalla los volúmenes específicos de amortiguación y residencia elegidos para mantener el complejo concentrado y minimizar su tiempo de residencia de resina.

Si se cambia el volumen cultural, se recomienda cambiar los volúmenes de resina y tampón de las columnas de gravedad para tener en cuenta el cambio. Empaque la columna con no más de 100 microlitros de lechada de calmodulina y, por gravedad, use 5 mililitros de tampón aglutinante de calmodulina para lavar la resina tres veces. Usando 200 microlitros de tampón de elución de calmodulina, eluya la proteína tres veces.

A continuación, selle la parte inferior de la columna y añada 20 microlitros de tampón de elución e incube durante 2,5 minutos antes de soltar el sello y permitir que la proteína eluya por gravedad. Vuelva a sellar la parte inferior de la columna y agregue 200 microlitros de tampón de elución antes de incubar durante cinco minutos. Luego, desprecinta la parte inferior de la columna y eluye la solución.

Para la sexta y última elución, selle el fondo de la columna e incube con tampón de elución durante 10 minutos. A continuación, desprecintar y eluir. Realice análisis posteriores a la purificación y almacene muestras de acuerdo con el protocolo de texto.

Como se muestra aquí, una purificación inicial de TAP del complejo siguiendo un protocolo publicado produjo un complejo que migró como tres bandas en un gel teñido de plata. Múltiples rondas de optimización del método TAP nos dan un complejo que migró como una sola banda en un gel nativo, indicativo de un ensamblaje más homogéneo. De acuerdo con el resultado del gel nativo, el western blot utilizando un anticuerpo TAP contra el complejo, purificado de acuerdo con el protocolo publicado, detectó proteólisis de la proteína marcada con TAP, SNU-71.

Las modificaciones del método TAP redujeron significativamente la cantidad de proteólisis, ya que casi todas las 17 proteínas del complejo U1 snRNP se resolvieron mediante SDS-PAGE y se identificaron positivamente mediante espectrometría de masas múltiples. La microscopía electrónica de tinción negativa muestra partículas monodispersas de una purificación exitosa después del primer y segundo paso de TAP. Por el contrario, no se observan partículas del tamaño correcto cuando la purificación no tiene éxito.

La calidad final del complejo se evaluó en un césped de partículas purificadas, que se muestran aquí, que aparecen monodispersas en la imagen RAW EM de tinción negativa. Además, los promedios de clase de las partículas revelan características distintivas que indican que la muestra es posiblemente adecuada para el estudio estructural. Una vez dominado, este protocolo se puede completar dentro de las 10 a 12 horas posteriores a la descongelación del polvo celular lisado congelado.

Al seguir este protocolo, es importante asegurarse de que todas las soluciones estén libres de proteasas y nucleasas, así como trabajar rápidamente para evitar la agregación o disociación del complejo. Después de ver este video, debe comprender cómo purificar un complejo nativo de calidad adecuada para el estudio estructural, así como cómo evaluar que esto se ha logrado.