Name: Purificación de Complejos nativo para el estudio estructural se utiliza un método Tag Tandem Affinity (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Aprende a purificar complejos macromoleculares nativos mediante el método TAP para estudios biofísicos utilizando células de S. cerevisiae. Este protocolo garantiza homogeneidad composicional y evalúa la calidad estructural.

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Los autores están agradecidos por el apoyo y los consejos de Nikolaus Grigorieff. Agradecemos a Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu y Mike Rigney por sus útiles debates y su orientación sobre los mercados emergentes. Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias, Premio No. 1157892. Las instalaciones de Brandeis EM cuentan con el apoyo de la subvención P01 de los Institutos Nacionales de Salud GM62580.

Nota: El siguiente protocolo se diseñó para la purificación de un complejo de 4 l de cultivo de células, aproximadamente 40 g de peso húmedo de células. Una vez preparada, todos los tampones deben almacenarse a 4 ° C y utilizarse dentro de un mes de su preparación. Los inhibidores de la proteasa y de agentes reductores sólo se incorporan al tampones justo antes de su uso. 1. Preparación del extracto de células enteras para Tandem Purificación por Afinidad <ol><li> El crecimiento de S. Las células cerevisiae <ol><li> Pasar la derivación deseada etiquetada S. cerevisiae cepa de almacenamiento (-80 ° C) en una solución de dextrosa de levadura peptona (YPD) plato. Incubar durante 3 - 5 días (30 ° C), hasta que las células de levadura aparecen en blanco y esponjoso. </li><li> Inocular una racha de aproximadamente 2 mm 2 de las células frescas de la placa en 10 ml de medio YPD en un tubo de centrífuga de polipropileno cónico de 50 ml. Agitar el tubo a 180 revoluciones por min (rpm) durante la noche (30m ° C). </li><li> Inocular 2 ml de la máscultura noche por litro de medio YPD en un Erlenmeyer de 2 L o frasco cónico. Se agita a 180 rpm (30 ° C). Monitor de crecimiento celular a una densidad óptica de 600 nm (OD 600) hasta la fase logarítmica tardía, OD 600 de 1,8 a 2, típicamente 20 a 24 hr. </li></ol></li><li> La recolección S. Las células cerevisiae <ol><li> Cosecha células por centrifugación a 5.400 xg durante 15 min (4 ° C). </li><li> decantar rápidamente el sobrenadante y mantener las células a 4 ° C o en hielo. </li><li> Suspender cada litro de sedimento celular con 2 ml refrigerados tampón de lisis (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; NaCl 300 mM; KCl 10 mM; 0,2 mM de EDTA, pH 8,0; imidazol 5 mM, pH 8,0; 10% de glicerol; 0,1% v NP-40 / v). Suspender las células agitando el recipiente y / o repetición de pipeteado utilizando una pipeta serológica de 10 ml. Nota: La importancia de NP-40 en lo que respecta a la calidad del complejo y el análisis posterior a la purificación se discuten a continuación. </li><li> Transferir la suspensión de células en un vacío de 50 ml cónico de polipropileno tubo de centrífuga kEPT en el hielo. Lavar cada botella de centrífuga con un adicional de 2 ml de tampón de lisis enfriado y añadir a la suspensión de células en el tubo de 50 ml. </li><li> Determinar el peso húmedo de sedimento celular pesando el tubo y restando el peso del tubo vacío, así como el añadido tampón de lisis. Nota: Un litro de cultivo celular que tiene un OD 600 de 1,8 es de aproximadamente 10 g. </li><li> Crear un baño de nitrógeno líquido en un tubo de centrífuga cónico de polipropileno de 50 ml. Dibuje células suspendidas en una jeringa de 5 ml. Conectar una aguja 16 G a la jeringa. Congelación de la suspensión de células haciéndolo pasar a través de la jeringa / aguja para generar células &quot;gotas&quot;. Velocidad de congelación debe ser de aproximadamente 1 min / ml. </li><li> Almacenar las gotitas de células congeladas (-80 ° C) o proceder a la lisis. </li></ol></li><li> Las células de lisis y clarificación de lisado <ol><li> Lyse las células de levadura utilizando un molinillo de café. lisar células de ocho a nueve veces con 25 segundos de molienda ráfagas, mientras se agita la cmolinillo de offee. Antes de su uso, pre-enfriar el molinillo de café con nitrógeno líquido. Cada dos rondas de molienda, añaden una capa superficial de nitrógeno líquido para el molino y deje que se evapore. </li><li> Remover con una espátula de nitrógeno líquido refrigerado, según sea necesario para mantener las células se agrupen. Tenga precaución para evitar la descongelación de las células, lo que puede dar lugar a la formación de grumos de células. Las células deben aparecer como un polvo blanco fino después de la lisis. Un sedimento celular máximo de 4 L de cultivo de levadura (~ 40 g) se puede moler a la vez. Nota: Observaciones de método de lisis se discuten a continuación. </li><li> Evaluar el grado de lisis celular utilizando un hemocitómetro o método de recuento celular alternativo. Para proporcionar un análisis adecuado, tome las siguientes muestras: (1) antes de la lisis; (2) después de cuatro rondas de lisis; y (3) después de la lisis. Para comprobar estas muestras, tomar una pequeña cantidad de células con una espátula de nitrógeno líquido refrigerado y colocar en un tubo de 1,5 ml. </li><li> Una vez que se descongelan las células, de pipeta 5 l de célulasy mezclar con 495 l de agua. Si el 40 - 60% se observó lisis de las células, continúe con el siguiente paso en el protocolo. Nota: Observaciones de efecto de largos períodos de lisis se discuten a continuación. </li><li> , almacenar células lisadas Una vez que se observa lisis adecuada (-80 ° C) o proceder al siguiente paso. </li><li> Preparar dos 50 ml tubos de centrífuga de polipropileno cónico de 15 ml cada uno con tampón de lisis, incluyendo 1 mM de fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF), ditiotreitol 1 mM (DTT), y un cóctel disponible en el mercado de los inhibidores de la proteasa. Nota: Si se observa la proteólisis significativa, considere el uso de una cepa deficiente en proteasa. </li><li> Use una espátula de nitrógeno líquido refrigerado para sacar el polvo de células lisadas congelada en los preparados tubos de 50 ml. Añadir el polvo de células / sólido de forma incremental al tampón de lisis, que contiene tanto un reductor y el inhibidor (s) proteasa. </li><li> Rotar los tubos de 50 ml suavemente a TA con el fin de descongelar / disuelva las células, sino también para evitar la formación de burbujas. UNEs el polvo celular / sólido se disuelve, añadir celular adicional sólido / polvo. </li><li> Llene cada uno de los dos tubos de 50 ml hasta que cada una tiene aproximadamente 20 g de células o todas las células añadidas. Continuar descongelación / disolución hasta que no haya grumos de células congeladas se observan en los tubos de 50 ml. Esto debe tomar aproximadamente 50 minutos. </li><li> Centrifugar el lisado de células en suspensión durante 20 minutos a 25.000 xg (4 ° C). células lisadas bien pueden exhibir una pequeña cantidad de precipitado negro. </li><li> La transferencia de los 50 ml de sobrenadante a tubos de policarbonato ultra-centrífuga (26,3 ml tubos utilizados) y añadir 10 l de PMSF 200 mM a cada tubo completo. </li><li> Centrifugar durante 1 hora a 100.000 xg (4 ° C). Cuatro capas deben ser visibles, de abajo hacia arriba: (1) un sedimento duro clara, que contiene complejos ribosómicos; (2) una pastilla suave rica en lípidos; (3) una gran capa de color amarillo teñido transparente que contiene la mayor parte de las proteínas y los complejos solubles de la célula; y (4) una &#39;escamas&#39; capa superior que consiste en lípidos. </li><li> Realizar todos los subsequent pasos en una habitación fría (4 ° C). Eliminar la mayor cantidad de la capa de lípidos top &#39;escamas&#39; como sea posible usando una pipeta de 1 ml y desechar. Utilice una pipeta serológica de 10 ml a recuperar la mayor parte de la capa amarilla, clara. </li><li> Recuperar los últimos ml de esta capa usando una pipeta de 1 ml para no molestar a las dos capas inferiores. De 40 g sedimento celular húmedo, aproximadamente 48 ml de la capa del medio es típicamente recuperados y 8 ml de capa lipídica eliminan / desechado. Nota: La purificación en columna de flujo se ve obstaculizado en gran medida por la presencia de lípidos, que también pueden reducir la calidad del complejo, se discute a continuación. </li></ol></li></ol> 2. Columna etapa de purificación 1: Cromatografía de IgG <ol><li> Resina de equilibrado y Encuadernación <ol><li> Preparar un 300 l IgG Sepharose suspensión de 40 g de sedimento celular. Cortar el extremo de una punta de pipeta 1 ml de facilitar pipeteando la suspensión. Wash / equilibrar la resina IgG tres veces, cada vez con 5 ml IgGD150 Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; NaCl 150 mM; KCl 150 mM; 1 mM MgCl 2; imidazol 5 mM, pH 8; 0,1% v / v de NP-40; DTT 1 mM; una tableta de inhibidor de la proteasa por 50 volumen ml). <ol><li> Centrifugado para sedimentar a 160 xg (4 ° C) entre los lavados y eliminar el sobrenadante. </li></ol></li><li> Girar la resina de IgG con el sobrenadante de fase media y dos tabletas de mini inhibidores de la proteasa por 40 g de células, utilizando un rotador apropiado, por 2 hr (4 ° C). Esta es la solución de proceso por lotes IgG. </li><li> Preparar dos 10 ml columnas poli-de preparación para el uso al cortar el extremo de la columna para producir un corte plano. Para acelerar el embalaje y el lavado de la columna por flujo de gravedad, cargar un máximo de 200 l de resina de IgG acondicionamiento o de ~ 25 ml de la solución de lote IgG por 10 ml de la columna. </li><li> Se vierte la solución de lotes de IgG en la columna y dejar sedimentar por gravedad. Si la sedimentación tarda más de 30 minutos, no era más probable la contaminación de lípidos cuando se recupera la fase media de la centrífuga tUBE. </li><li> Se lava la columna rellena con cuatro sucesivos volúmenes de 10 ml de Tampón IgGD150. </li></ol></li><li> La escisión en la columna TEV <ol><li> Sellar la parte inferior de la columna y se añade 1 ml de tampón de IgGD150 y 100 l de proteasa TEV (0,6 mg / ml de stock, la variante mutante S219V de TEV de producción propia). Sellar la parte superior de la columna y se mezcla durante 20 min (18 ° C) usando un mezclador térmico, agitando a 750 rpm. Resuspender resina y mezclar de nuevo durante 20 min, repita una vez más para un total de 1 h de incubación. Nota: Es muy importante para mantener el tiempo de incubación a un mínimo. </li><li> Volver la columna a 4 ° C y se eluye la proteína / complejo por la gravedad. Eluir el volumen muerto con un 200 l adicionales de tampón de IgGD150. </li></ol></li></ol> 3. La purificación en columna Paso 2: cromatografía de afinidad calmodulina <ol><li> Resina de equilibrado y Encuadernación <ol><li> Preparar 200 l de resina de afinidad de calmodulina por 40 g de célulasbolita. La resina se lava tres veces, cada vez con 5 ml de calmodulina tampón de unión (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; NaCl 150 mM; KCl 10 mM; 1 mM MgCl 2; imidazol 5 mM, pH 8; 2 mM CaCl 2; 0.1 % v / v de NP-40; 10 mM β-mercaptoetanol), centrifugando a 160 xg (4 ° C) para sedimentar para cada lavado. </li><li> Para cada 1 ml de eluido IgG, añadir 3 volúmenes de tampón de unión de calmodulina. Para mantener constante el nivel de calcio, añadir CaCl2 y β-mercaptoetanol para dar cuenta de la falta de estos componentes en la elución de IgG. Las concentraciones finales deben ser 2 mM CaCl 2 y 10 mM β-mercaptoetanol. </li><li> Añadir la muestra a la resina de calmodulina y se unen para 1 hr (4 ° C) utilizando un rotador tubo. </li></ol></li><li> Embalaje y que eluye de la resina de calmodulina <ol><li> Preparar una columna de poli-prep 2 ml por 100 l de suspensión calmodulina cortando el extremo de la columna para crear una abertura plana. No cargue más de 100 l calmodulina suspensión por columna para reducir al mínimo la cantidad de resina de la muestra entra en contacto con durante la elución. </li><li> Paquete de la columna por gravedad y se lava la resina en la columna tres veces con 5 ml de calmodulina tampón de unión. </li><li> Eluir la proteína con la adición de 200 l calmodulina tampón de elución (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; NaCl 150 mM; KCl 10 mM; 1 mM MgCl 2; imidazol 5 mM, pH 8,0; EGTA 4 mM, pH 8,0; 0,08% v / v NP-40; 10 mM β-mercaptoetanol). Repita seis veces la adición de 200 l de tampón de elución calmodulina. </li><li> Para eluciones 1 a 3, aplicar el volumen a la columna y recoger el eluido inmediatamente. Para la elución 4, sellar la parte inferior de la columna y se incuba con tampón de elución para 2,5 min y luego quitar el sello y permitir que para eluir por gravedad. Para la elución 5, incubar durante 5 min y luego quitar el sello y eluir. Para la elución 6, incubar durante 10 min y luego quitar el sello y eluir. Nota: La integridad del complejo puede variar entre eluciones / fracciones (ver sección de resultados representativos) &lt;./ Li&gt; <li> Dializar eluciones 2-6 individualmente durante la noche utilizando un método de diálisis micro apropiado. Se dializa contra las fracciones diálisis Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; NaCl 150 mM; KCl 10 mM; 1 mM MgCl 2; imidazol 5 mM, pH 8; 10 mM β-mercaptoetanol). Nota: NP-40 no pasa sensiblemente, en todo caso, a través de la membrana de diálisis. </li></ol></li></ol> 4. Los análisis post-purificación para evaluar la calidad del Complejo <ol><li> Nativo del gel y tinción con plata <ol><li> Preparar un 4 - gel nativo prefabricado 16% para el análisis del complejo según las instrucciones del fabricante. Utilice un patrón de proteína de peso molecular adecuado y la carga de 15 l de cada uno de los calmodulina de elución / fracciones dializadas en el gel. </li><li> La electroforesis el gel a 150 V durante aproximadamente 3 hr (4 ° C). </li><li> La tinción con plata del gel para evaluar la calidad de cada uno de los seis eluciones. Como alternativa, el uso comercial igualmente sensiblesmancha fluorescente (s). En esta etapa, es más probable por debajo del nivel de detección de tinción con azul de Coomassie de la concentración del complejo. </li></ol></li><li> Métodos adicionales análisis en gel <ol><li> Para detectar la proteína mediante inmunotransferencia de tipo Western, resolver el complejo mediante SDS o PAGE nativa y, a continuación sondear el gel para el epítopo de unión al péptido La calmodulina (CBP) utilizando un anticuerpo tag TAP según las instrucciones del fabricante. </li><li> El uso de una mancha fluorescente específico (s), confirmar la presencia y la integridad de la proteína y / o ácido nucleico en un complejo TAP purificado. Tenga cuidado de que no se detecta ningún solapamiento espectral entre estas manchas. </li></ol></li><li> La visualización de la mancha negativa Microscopía Electrónica <ol><li> Utilizar rejillas continuas de carbono-resplandor descarga a -15 mA durante 30 segundos, a los 30 minutos de aplicación compleja. </li><li> Aplicar 3 l de complejo TAP purificado (típicamente a una concentración de 1 nM) a la red. Se incuba durante un minuto. f blotesde el lado de la parrilla para eliminar el exceso de tampón. </li><li> Lavar dos veces con 20 gotas l de agua desionizada. blot lateral entre lavados. </li><li> Aplicar cuadrícula a un 50 l gota de tinción negativa y se incuba durante un minuto. Se recomienda la tinción con acetato de uranilo (2%) o formato de uranilo (0,75%). Precaución: sales de uranilo y soluciones son débilmente radiactivos y contienen metales pesados. Estos deben ser manejados con cuidado y todo el material que entra en contacto con el mismo deberán eliminarse siguiendo las directrices de residuos recomendados estas soluciones institucionales. </li><li> Aplicar rejilla a un nuevo máximo de 50 l gota de tinción negativa, sin goteo. Se incuba durante un minuto, y luego por transferencia lateral, y finalmente secarse al aire y visualizar. </li></ol></li><li> Cryo Microscopía Electrónica (crio-ME) Visualización <ol><li> Realizar la crio-EM complejo con TAP purificado, aunque la optimización puede ser necesario, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Nota: La presencia de detergente en altas concentraciones may obstaculizan los avances y se discute a continuación. </li></ol></li></ol> 5. Complejo de almacenamiento <ol><li> Preparación de Complejo de almacenamiento <ol><li> Se concentra el complejo, si es necesario, usando un filtro centrífugo que tiene un peso molecular de corte apropiado para el complejo. Girar a 14.000 xg durante 1 min incrementos hasta que se alcanza la concentración deseada. Nota: la concentración de NP-40 se incrementará en la concentración durante la concentración, ya que no pasa a través de la membrana de filtro ni de diálisis. </li><li> Flash congelar el complejo en 30 ml de alícuotas en nitrógeno líquido o hielo seco se enfrió baño de etanol y luego se almacena a -80 ° C. </li></ol></li><li> La eliminación opcional post-purificación de detergente </li></ol> Nota: La presencia de un detergente tal como NP-40 y a una concentración por encima de su concentración micelar crítica pueda obstaculizar o inhibir el progreso para algunas aplicaciones. Las consecuencias de su retirada de la protocol así como la sustitución con otros aditivos o co-disolventes se discuten a continuación. Si no se desea NP-40, una opción es utilizar una aplicación comercial para la eliminación de, por ejemplo, Bio-perlas. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Pre-Equilibrar disponibles en el mercado de detergentes de absorción de los granos en la diálisis de amortiguamiento. Mezclar cinco perlas por 30 l de complejo (por lo general en una concentración de 10 nM). </li><li> Incubar cuentas equilibradas desde el paso 5.2.1 con el complejo purificado TAP durante 15 minutos en hielo. Utilice complejo dentro de unas pocas horas después de la eliminación de detergente. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

El método TAP utiliza dos etiquetas que equilibren la necesidad de más rigurosa y selectiva la unión a una resina de afinidad con el deseo de mantener cerca de condiciones de solución fisiológica. Este equilibrio sirve para preservar la interacción estable (s) de la proteína de la etiqueta con el factor de interacción (s) para la caracterización posterior a la purificación. Además, TAP individuo etiquetada ORFs están disponibles de una fuente comercial, de modo que se puede obtener cualquier cepa de levadura con una pro...

Muchos de los principales procesos celulares se llevan a cabo por gran proteína y proteína-ARN complejos 1. Un cuello de botella significativo para la realización de estudios biofísicos y estructurales de tales complejos de ellos es la obtención de una calidad adecuada (es decir, homogeneidad) y a una concentración apropiada. El aislamiento de un complejo de una fuente nativa tiene muchas ventajas, incluyendo la retención de las modificaciones post-transcripcionales y / o traduccionales relevantes de subunidades y asegurar complejo montaje adecuado. Sin embargo, grandes complejos celulares están a menudo presentes en una célula en un bajo número de copias y la purificación deben ser altamente eficiente y producir en condiciones fisiológicas cerca para asegurar que se mantiene la integridad del complejo. La purificación de un complejo de una fuente eucariota es particularmente difícil y puede ser económicamente prohibitivo. Por lo tanto, es muy deseada estrategias o métodos que sean eficientes y producen un complejo homogéneo. Una estrategia que ha sidoéxito en la purificación de los complejos nativos de células eucariotas para su caracterización inicial es el tándem de purificación de afinidad (TAP) Método de 2,3. El método TAP fue ideado inicialmente para purificar una proteína nativa de la levadura en ciernes (S. cerevisiae) en el complejo con la interacción de los factores (s) 2. El método TAP utiliza dos etiquetas, cada etiqueta fusionado en tándem para la misma secuencia del gen codificante de la proteína. Las etiquetas fueron seleccionados a fin de equilibrar la necesidad de apretado y selectiva la unión a una resina de afinidad con un deseo de mantener cerca de las condiciones de solución fisiológica. Este equilibrio sirve para preservar la interacción estable (s) de la proteína de la etiqueta con el factor de interacción (s) para la caracterización posterior a la purificación. La etiqueta TAP genómicamente incorporada se coloca en el extremo (C-terminal) de un gen que codifica la proteína y consistía en una secuencia que codifica para un calmodulina de unión al péptido (CBP) seguido de proteína A - una adición de un poco más de 20 kDa a la etiquetado proteína. CBP es corta, 26 aminoácidos, y reconocidos por el ~ 17 kDa proteína calmodulina (CaM) en presencia de calcio con una K D del orden de 10 -9 M 4. La etiqueta de la proteína A es más grande, que consiste en dos repeticiones de 58 residuos con un enlazador corto entre las repeticiones. Cada repetición de 58 aminoácidos es reconocido por la inmunoglobulina G (IgG) con una K D ~ 10 -8 M 5. Entre estas dos etiquetas se incorporó un sitio de reconocimiento para la proteasa TEV, una endopeptidasa de la Virus del grabado del tabaco 6,7. Como se ilustra en la Figura 1, en ​​la primera etapa de afinidad del método de la TAP proteína marcada se une a una resina de IgG a través de la proteína A. La proteína marcada se eluye por escisión en la columna tras la adición de la proteasa TEV, específicamente en el sitio de escisión entre las dos etiquetas. Este es un paso necesario como la interacción de IgG y proteína A es muy fuerte y sólo puede ser perturbado adecuadamente bajo condiciones de solución de desnaturalización. A falta de un PrOtein Una etiqueta, la proteína se une a la resina de CaM en presencia de calcio y se eluyó de esta resina con adición de EGTA el quelante de iones metálicos (ácido etilen glicol) (Figura 1). Poco después de la introducción del método de TAP, que se utilizó en un estudio a gran escala para generar un &quot;mapa&quot; de las interacciones complejas en S. 8 cerevisiae. Es importante destacar que, como consecuencia de este esfuerzo una biblioteca entera del marco de levadura-TAP Tagged de lectura abierto (ORF), así como TAP individuo etiquetado ORFs 9 están disponibles de una fuente comercial. Por lo tanto, se puede obtener cualquier cepa de levadura con una proteína etiquetada para cualquier complejo de levadura. El método TAP también estimuló modificaciones o variaciones de la etiqueta TAP, incluyendo: su uso para la purificación de complejos de otros eucariotas, así como células bacterianas 10,11; el diseño de una &quot;etiqueta dividir&quot;, en el que la proteína A y CBP se colocan en diferentes proteínas de 12; y la tags cambiado, así como para dar cabida a la necesidad del investigador, tales como la sensibilidad del complejo de Ca 2+ o EGTA 13. Los recientes avances, tanto en instrumentación y metodología han dado lugar a avances significativos en la aplicación de la microscopía electrónica (EM) para la determinación de la estructura, que han conducido a alta, cerca de imágenes de resolución atómica de complejos macromoleculares 14. La resolución obtenible de un complejo por EM, sin embargo, sigue dependiendo de la calidad del complejo en estudio. En este estudio se ha utilizado la estrategia de etiquetas de TAP para purificar a partir de S. cerevisiae U1 snRNP, un joven de 18 subunidad (~ 0,8 MDA) bajo número de copias ribonucleoprotein complejo que forma parte de la spliceosome 15,16. Una serie de medidas se han adoptado para purificar este complejo tal que es homogéneo y de una concentración adecuada. Los problemas potenciales encontrados en diversas etapas de la purificación se describen y estrategias adoptadas para superar challEnges resaltados. Mediante la evaluación y optimización de las operaciones en la purificación cuidado, el U1 snRNP purificada es de una calidad y en cantidad adecuada para la tinción negativa y crio (crio-EM) los estudios de microscopía de electrones. Un protocolo TAP método optimizado para la purificación de complejos nativas para estudios estructurales se describe en este documento.

<table><tbody><tr><td>Cepa marcada con TAP de S. cerevisiae</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1177</td><td>Esta es la principal cepa de levadura utilizada para desarrollar el protocolo TAP. Su fondo es S288C: ATCC 201388: MATa, his3&Delta; 1, leu2 y Delta; 0, met15 y Delta; 0, ura3 y Delta; 0, SNU71::TAP::HIS3MX6</td></tr><tr><td>Molinillo de café</td><td>Mr. Coffee</td><td>IDS77</td><td>Utilizado para la lisis celular</td></tr><tr><td>Hemocitómetro, Bright Line</td><td>Hausser Scientific</td><td>3120</td><td>Utilizado para evaluar la lisis celular</td></tr><tr><td>JA 9.100 rotor centrífugo&nbsp;</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Se utiliza para cosechar las células de levadura</td></tr><tr><td>JA 20 rotor centrífugo de ángulo fijo</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Se utiliza para limpiar el extracto celular de material celular no soluble</td></tr><tr><td>Rotor centrífugo de ángulo fijo Ti 60</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Se utiliza para limpiar aún más el extracto de células solubles</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>R5355</td><td>Agitador de temperatura controlada</td></tr><tr><td>Novex sistema de gel Thermo</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resina IgG</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0969-01</td><td>Sepharose 6</td></tr><tr><td>resina de calmodulina</td> de flujo rápido <td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>214303</td><td>Resina de afinidad</td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de la proteasa, mini comprimidos</td><td>Sigma Aldrich</td><td>589297</td><td>Mini cOmplete ultra sin EDTA Cóctel de</td></tr><tr><td>inhibidores de la proteasa, comprimidos grandes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5892953</td><td>cOmplete ultra sin EDTA Fluoruro</td></tr><tr><td>de fenilmetanosulfonilo (PMSF)</td><td></td><td></td><td>Disuelto en isopropanol</td></tr><tr><td>2 ml Columna Bio-spin</td><td>Bio-Rad Laboratorios, Inc.</td><td>7326008</td><td>Se utiliza para empacar y lavar la</td></tr><tr><td>columna de preparación de resina de calmodulina de 10 ml</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>7311550</td><td>Se utiliza para envasar y lavar la resina IgG</td></tr><tr><td>Prefabricada PAGE Bis-Tris geles</td> Life <td>Technologies</td><td>BN1002</td><td>Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% geles de poliacrilamida prefabricados</td></tr><tr><td>NativeMark Estándar de proteínas Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>LC0725</td><td>Estándar de proteínas sin tinción utilizado para PAGE nativo. Carga 7.5 &mu; l para un gel teñido de plata y 5 &mu; l para un SYPRO Gel teñido de rubí</td></tr><tr><td>Prefabricado SDS PAGE Bis-Tris geles Life</td><td>Technologies</td><td>NP0321</td><td>Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% geles prefabricados de poliacrilamida &nbsp;</td></tr><tr><td>PageRuler estándar de proteínas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26614</td><td>Estándar de proteínas sin teñir utilizado para Western bólter</td></tr><tr><td>tampón SDS</td><td>Life Technologies</td><td>NP0001</td><td>1x NuPAGE MOPS SDS Tampón</td></tr><tr><td>anticuerpo TAP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CAB1001</td><td>Anticuerpo primario contra la etiqueta CBP</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31341</td><td>Fosfatasa alcalina anti-conejo de cabra conjugada</td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34042</td><td>5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato/nitro azul tetrazolio&nbsp;</td></tr><tr><td>Unidades de dializamiento</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88401</td><td>Miniunidades de diálisis Slide-A-Lyzer</td></tr><tr><td>Unidades de filtro centrífugo, 100kDa MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC5100008</td><td>Amicon Ultra-0.5 Unidad de filtro centrífugo con membrana Ultracel-100</td></tr><tr><td>Perlas absorbentes de detergente</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>1523920</td><td>Bio-bead SM-2 absorbentes</td></tr><tr><td>SYBR Green II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S-7564</td><td>Colorante fluorescente para la tinción de ácidos nucleicos, cuando se detecta con SYPRO Ruby presente, utilice una longitud de onda de excitación de 488 nm y una longitud de onda de emisión de 532 nm</td></tr><tr><td>Sondas moleculares</td><td>SYPRO Ruby</td><td>S-12000</td><td>Colorante fluorescente para la tinción de proteínas, cuando se detecta con SYBR Green II presente, utilice una longitud de onda de excitación de 457 nm y una longitud de onda de emisión de 670 nm</td></tr><tr><td>Rejillas de cobre</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>G400-CP</td><td></td></tr></tbody></table>

purificación de complejos nativo para el estudio estructural se utiliza un método tag tandem affinity

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

enfoques de purificación por afinidad han tenido éxito en el aislamiento de los complejos nativos para la caracterización proteómica. La heterogeneidad estructural y un grado de heterogeneidad de composición de un complejo por lo general no impiden el progreso en la realización de dichos estudios. En contraste, un complejo destinado a la caracterización estructural debe ser purificado en un estado que es a la vez de composición y estructuralmente homogéneo, así como a una concentración mayor que la requerida para la proteómica. Recientemente, se han producido avances significativos en la aplicación de la microscopía de electrones para la determinación de la estructura de grandes complejos macromoleculares. Esto ha aumentado el interés en los enfoques para purificar complejos nativas de calidad y cantidad suficiente para la determinación estructural mediante microscopía electrónica. El método de purificación de afinidad en tándem (TAP) ha sido optimizado para extraer y purificar un joven de 18 subunidad, ~ 0,8 ensamblaje ribonucleoproteína MDA a partir de levadura en ciernes (Saccharomyces cerevisiae) </em&gt; adecuado para la tinción negativa y microscopía electrónica de crio. En este documento se detalla las modificaciones introducidas en el método TAP, la justificación para hacer estos cambios, y los enfoques adoptados para el ensayo de un complejo de composición homogénea y estructuralmente.

Un método TAP modificado se utiliza para purificar a partir de S. cerevisiae, el U1 snRNP, un complejo de ribonucleoproteína 18 de la subunidad. Una purificación TAP inicial del complejo después de la 2,3 protocolo publicado produjo un complejo que apareció heterogénea, migrando como tres bandas en un plata manchadas gel de poliacrilamida nativo (Figura 2A). Múltiples rondas de optimización del método de TAP, produjeron un complejo que migró como prin...

El método de Purificación por Afinidad en Tándem (TAP) se ha utilizado ampliamente para aislar complejos nativos de extractos celulares, principalmente eucariotas, para proteómica. Aquí, presentamos un protocolo de método TAP optimizado para la purificación de complejos nativos para estudios estructurales.

Purificación de Complejos nativo para el estudio estructural se utiliza un método Tag Tandem Affinity

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

El objetivo general de este protocolo es purificar un complejo macromolecular nativo de calidad adecuada para estudios biofísicos. Este protocolo sirve no solo como un método para purificar un complejo, sino también como una guía detallada para evaluar la calidad estructural de la muestra durante la purificación. La ventaja principal de este protocolo es que permite purificar un ensamblaje nativo en condiciones de tampón cercanas a las fisiológicas de forma sencilla y rápida, asegurando así la homogeneidad composicional.Después de la centrifugación de las células de S.cerevisiae y la decantación del sobrenadante según el protocolo descrito, agregue dos mililitros de tampón de lisis frío y agite suavemente o use una pipeta serológica de 10 mililitros para resuspender el precipitado. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de polipropileno de 50 mililitros vacío mantenido en hielo. Luego, utilice otros dos mililitros adicionales de tampón de lisis frío para lavar cada frasco de centrifugación y añada la solución al tubo de 50 mililitros.Después de determinar el peso húmedo del pellet celular, cree un baño de nitrógeno líquido dentro y alrededor de un tubo cónico de centrífu

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Investigación

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Biología

Tandem purificación de afinidad es un enfoque sólido para la identificación de socios de la unión a proteínas. Como prueba de concepto, esta metodología se aplicó a la traducción factor eIF4E bien caracterizado iniciación a co-precipitado los factores implicados en la célula huésped iniciación de la traducción. Este método se adapta fácilmente a cualquier proteína celular o viral.

Identificación de los socios interacción de proteínas en tándem de purificación de afinidad

La purificación por afinidad de las proteínas etiquetadas en combinación con espectrometría de masas (APMS) es un potente método para la asignación sistemática de las redes de interacción de proteínas y para la investigación de la base mecánica de los procesos biológicos. A continuación, se describe un péptido secuencial optimizado afinidad (SPA) APMS procedimiento desarrollado por la...

Identificación de los complejos de proteínas en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem

Este video muestra la purificación por afinidad en tándem, una técnica para purificar complejos de proteínas de células eucariotas para estudiar la interacción proteína-proteína. El complejo contiene dos proteínas marcadas con diferentes etiquetas de epítopos. Tras la purificación del complejo utilizando dos resinas con afinidad por las dos marcas diferentes de forma secuencial, la presencia de ambas proteínas en el eluido confirma la interacción entre ambas.

Ensayo de purificación de afinidad en tándem para estudiar las interacciones proteína-proteína

Complejos de proteínas catalizan las funciones celulares clave. Caracterización detallada funcional y estructural de muchos complejos esenciales requiere la producción recombinante. MultiBac es un sistema de células de baculovirus / insecto particularmente adaptado para la expresión de proteínas eucarióticas y sus complejos. MultiBac se implementó como una plataforma de acceso libre, y los procedimientos operativos estándar desarrollados para maximizar su utilidad.

El Protein Complex Plataforma de Producción MultiBac en el EMBL

Se describe un método para la purificación eficiente de proteínas de fusión doble-Strep-etiquetados y sus complejos específicos sobre estreptavidina modificada (Strep-Tactin) de resina covalentemente reticulado con bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3). El método tiene las ventajas de velocidad rápida, buena recuperación proteína diana y alta pureza, y es compatible con el análisis posterior por espectrometría de masas.

De un solo paso de purificación de proteínas etiquetadas-Twin-Strep y sus complejos de Strep-Tactin resina reticulado con Bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3)

Aquí se describe protocolos para romper las células de mamíferos por molienda en estado sólido a una temperatura criogénica, producir un extracto celular a partir del polvo de células resultante, y aislar los complejos de proteínas de interés por captura de afinidad sobre perlas paramagnéticas a escala micrométrica de anticuerpos acoplados.

Complejo de proteínas de captura por afinidad a partir de células de mamífero Cryomilled

Describimos aquí un novedoso, robusto y eficiente método de purificación de afinidad en tándem (TAP) para la expresión, aislamiento y caracterización de complejos de proteínas de células eucariotas. Este protocolo podría utilizarse para la caracterización bioquímica de complejos discretos, así como para la identificación de nuevos interactores y modificaciones postraduccionales que regulen su función.

Tandem Affinity purificación de complejos de proteínas a partir de células eucariotas

Un método para estabilizar y separar los complejos de proteínas nativas de lisado de tejido no modificado utilizando un proteína reticulante reactivo con amina acoplada a una novela de dos dimensiones electroforesis en gel de poliacrilamida se presenta sistema (PAGE).

Multímero-PAGE: Un método para capturar y Proteína Resolver Complejos en muestras biológicas

Aquí presentamos protocolos para la purificación por afinidad de los complejos de proteínas y su separación por PAGE nativa azul, seguido por la proteína de perfiles de correlación utilizando etiqueta espectrometría de masa libre cuantitativo. Este método es útil para resolver interactomes en complejos de proteínas distintas.

Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

Aquí presentamos un protocolo probado y comprobado para la purificación del cloroplasto importación complejos (complejo TIC TOC) usando la etiqueta de grifo. El protocolo de aislamiento de afinidad de un paso potencialmente se puede aplicar a cualquier proteína y se utiliza para identificar a nuevos socios de interacción por espectrometría de masas.

Purificación de la afinidad del cloroplasto Translocon complejos utilizando la etiqueta de grifo

Este artículo proporciona un procedimiento para la purificación por afinidad de una proteína recombinante humana, la endonucleasa flap 1 (FEN1), que ha sido marcada con una etiqueta de histidina 6X. El protocolo implica la utilización de dos columnas de iones metálicos inmovilizadas distintas para la purificación de la proteína marcada.

Purificación por afinidad de una proteína marcada con 6X His utilizando un sistema de cromatografía líquida rápida de proteínas 

Aprende a purificar complejos macromoleculares nativos mediante el método TAP para estudios biofísicos utilizando células de S. cerevisiae. Este protocolo garantiza homogeneidad composicional y evalúa la calidad estructural.

Purificación de Complejos nativo para el estudio estructural se utiliza un método Tag Tandem Affinity

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