Purificación de Complejos nativo para el estudio estructural se utiliza un método Tag Tandem Affinity

El objetivo general de este protocolo es purificar un complejo macromolecular nativo de calidad adecuada para estudios biofísicos. Este protocolo sirve no solo como un método para purificar un complejo, sino también como una guía detallada para evaluar la calidad estructural de la muestra durante la purificación. La ventaja principal de este protocolo es que permite purificar un ensamblaje nativo en condiciones de tampón cercanas a las fisiológicas de forma sencilla y rápida, asegurando así la homogeneidad composicional.

Después de la centrifugación de las células de S.cerevisiae y la decantación del sobrenadante según el protocolo descrito, agregue dos mililitros de tampón de lisis frío y agite suavemente o use una pipeta serológica de 10 mililitros para resuspender el precipitado. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de polipropileno de 50 mililitros vacío mantenido en hielo. Luego, utilice otros dos mililitros adicionales de tampón de lisis frío para lavar cada frasco de centrifugación y añada la solución al tubo de 50 mililitros.

Después de determinar el peso húmedo del pellet celular, cree un baño de nitrógeno líquido dentro y alrededor de un tubo cónico de centrífuga de polipropileno de 50 mililitros. A continuación, aspire las células suspendidas en una jeringa de cinco mililitros y conecte una aguja de calibre 16 a la jeringa. Luego, congele la suspensión celular pasándola a través de la jeringa y la aguja hacia el baño a una velocidad de aproximadamente un mililitro por minuto para generar gotas.

Para lisar las células de levadura, comience utilizando nitrógeno líquido para enfriar previamente un molinillo de café. Luego agregue hasta 40 gramos de células de levadura y muela durante 25 segundos, repitiendo la molienda de ocho a nueve veces. Se recomienda no purificar más de 10 litros de cultivo celular a la vez.

Esto minimiza el tiempo de purificación y asegura que se mantenga la integridad estructural del complejo. Después de cada dos rondas de molienda, agregue una capa superficial de nitrógeno líquido al molino y permita que se evapore. Para evitar que las células se aglomeren, evite que las células descongelen utilizando una espátula enfriada con nitrógeno líquido para mezclarlas.

Tras la lisis, las células deben presentarse como un polvo blanco fino. Después de verificar la lisis celular y preparar el tampón de lisis con PMSF, DTT e inhibidores de proteasas según el protocolo descrito en el texto, utilice una espátula enfriada con nitrógeno líquido para tomar progresivamente el polvo congelado de células lisadas y colocarlo en los tubos de 50 mililitros preparados con el tampón. Con cada adición, gire suavemente los tubos de 50 mililitros a temperatura ambiente para descongelar y disolver las células, evitando así la formación de burbujas.

Mientras las células se disuelven, agregue más polvo celular. Después de que se hayan añadido todas las células, continúe descongelando y disolviendo las células hasta que no se observen grumos celulares congelados en los tubos. Esto debería tomar aproximadamente 50 minutos.

A continuación, centrifugue el lisado celular a 25.000 × g y cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Una vez que las células están lisadas y tras la centrifugación, es posible que observe una pequeña capa oscura en el sedimento insoluble. Transfiera el sobrenadante a tubos de ultracentrifugación de policarbonato y agregue 10 microlitros de PMSF 200 milimolar a cada tubo lleno.

Centrifugar las muestras a 100,000 veces g y cuatro grados Celsius durante una hora. Al final de la centrifugación, deberían observarse cuatro capas: un sedimento duro y claro que contiene principalmente complejos ribosomales; un sedimento blando rico en lípidos; una capa grande, clara y con tonalidad amarillenta que contiene la mayor parte de las proteínas y complejos solubles de la célula; y una capa superior escamosa compuesta de lípidos.

En una sala fría a cuatro grados Celsius, utilice una pipeta de un mililitro para eliminar la mayor cantidad posible de la capa lipídica escamosa superior y deseche esta fracción. Use una pipeta serológica de 10 mililitros para recuperar la mayor parte de la capa amarilla clara. Luego, utilizando una pipeta de un mililitro para evitar perturbar las dos capas inferiores, recupere los últimos mililitros de esta capa.

De 40 gramos de pellet celular húmedo, típicamente se recuperan aproximadamente 48 mililitros de la capa intermedia. Después de preparar la sefarosa de IgG según el protocolo descrito, combine la resina de IgG con el sobrenadante de la fase intermedia y dos tabletas mini de inhibidor de proteasas por cada 40 gramos de células. Luego, coloque la mezcla en un rotador a cuatro grados Celsius durante dos horas.

Esta es la solución de lote de IgG. Prepare dos columnas poliprep de 10 mililitros cortando los extremos de las columnas para obtener una abertura plana. Vierta 24 mililitros de la suspensión de resina de IgG o solución de lote en cada columna y permita que sedimente por gravedad.

Esto corresponde a 200 microlitros de resina de IgG empaquetada. Si la sedimentación tarda más de 30 minutos, es posible que la fase intermedia se haya contaminado con lípidos. Cuando la sedimentación esté completa, utilice cuatro volúmenes sucesivos de 10 mililitros de tampón IgG D150 para lavar la columna empaquetada.

Para realizar la escisión con el virus del mosaico del tabaco o proteasa TEV en la columna, selle la parte inferior de la columna y agregue un mililitro de tampón IgG D150 y 100 microlitros de proteasa TEV. Selle la parte superior de la columna y, utilizando un mezclador térmico a 750 RPM y 18 grados Celsius, mezcle durante 20 minutos. Vuelva a suspender la resina y mezcle nuevamente durante 20 minutos.

Luego, re-suspenda y repita la mezcla de 20 minutos por tercera vez. Devuelva la columna a cuatro grados Celsius y utilice la gravedad para eluir el complejo proteico. A continuación, agregue 200 microlitros de IgG D150 para eluir el volumen muerto.

Después de preparar la resina de afinidad para calmodulina según el protocolo descrito, añada el tampón de unión a calmodulina y la muestra a la resina, e incube durante una hora a cuatro grados Celsius utilizando un rotador de tubos. Prepare una columna Polyprep de dos mililitros por cada 100 microlitros de suspensión de calmodulina, cortando el extremo de la columna para crear una abertura plana. El protocolo detalla volúmenes específicos de tampón y de residencia seleccionados para mantener el complejo concentrado y minimizar su tiempo de permanencia en la resina.

Si se modifica el volumen del cultivo, se recomienda ajustar los volúmenes de resina y tampón de las columnas por gravedad para compensar este cambio. Empaquete la columna con no más de 100 microlitros de suspensión de calmodulina y, por gravedad, utilice 5 mililitros de tampón de unión a calmodulina para lavar la resina tres veces. Usando 200 microlitros de tampón de elución de calmodulina, eluya la proteína tres veces.

A continuación, selle la parte inferior de la columna y agregue 20 microlitros de tampón de elución e incube durante 2,5 minutos antes de retirar el sello y permitir que la proteína se eluya por gravedad. Selle nuevamente la parte inferior de la columna y agregue 200 microlitros de tampón de elución antes de incubar durante cinco minutos. Luego, retire el sello de la parte inferior de la columna y eluya la solución.

Para la sexta y última elución, selle la parte inferior de la columna e incube con el tampón de elución durante 10 minutos. Luego, desprecinte y realice la elución. Lleve a cabo el análisis posterior a la purificación y almacene las muestras según el protocolo descrito en el texto.

Como se muestra aquí, una purificación inicial mediante TAP del complejo siguiendo un protocolo publicado produjo un complejo que migró como tres bandas en un gel teñido con plata. Tras varias rondas de optimización del método TAP, obtenemos un complejo que migra como una sola banda en un gel nativo, lo que indica un ensamblaje más homogéneo. De acuerdo con el resultado del gel nativo, el inmunotransferencia con un anticuerpo TAP contra el complejo, purificado según el protocolo publicado, detectó proteólisis de la proteína marcada con TAP, SNU-71.

Las modificaciones del método TAP redujeron significativamente la cantidad de proteólisis, ya que casi todas las 17 proteínas del complejo U1 snRNP fueron resueltas mediante electroforesis SDS-PAGE e identificadas positivamente por espectrometría de masas múltiple. La microscopía electrónica con tinción negativa muestra partículas monodispersas procedentes de una purificación exitosa tras la primera y segunda etapa del TAP. En contraste, no se observan partículas del tamaño correcto cuando la purificación no es exitosa.

La calidad del complejo final se evaluó en un césped de partículas purificadas, mostrado aquí, que aparecen monodispersas en la imagen cruda de microscopía electrónica con tinción negativa. Además, los promedios de clase de las partículas revelan características distintivas que indican que la muestra podría ser adecuada para un estudio estructural. Una vez dominado, este protocolo puede completarse en un período de 10 a 12 horas tras descongelar el polvo de células lisadas congelado.

Al seguir este protocolo, es importante asegurarse de que todas las soluciones estén libres de proteasas y nucleasas, así como trabajar rápidamente para prevenir la agregación o disociación del complejo. Después de ver este video, debería comprender cómo purificar un complejo nativo de calidad adecuada para su estudio estructural, así como cómo evaluar que esto se ha logrado.