Evaluación de la expresión de GFP y viabilidad mediante el Tali basada en imágenes citómetro

Este video muestra un procedimiento para determinar la viabilidad celular en células que expresan GFP utilizando el citómetro basado en imágenes de tallo. Las células transducidas GFP se tiñen utilizando el kit de viabilidad de conteo de células muertas rojas, que tiñe todas las células muertas de rojo con yoduro de propidio, las células se pipetean en un portaobjetos de análisis celular de recuento y se cargan en el citómetro, que adquiere y analiza imágenes de campo claro y de fluorescencia roja y verde. A continuación, se generan histogramas para mostrar el recuento de células, el tamaño de la célula, la intensidad de la fluorescencia PI y la intensidad de la fluorescencia GFP en comparación con la citometría de flujo tradicional.

Tali puede proporcionar datos similares sobre la viabilidad y la expresión celular. Sin embargo, esta citometría basada en imágenes proporciona información visual adicional sobre la población celular que se está examinando. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la citometría de flujo o la microscopía de fluorescencia, es que el citómetro basado en imágenes de recuento proporciona información cuantitativa y visual simultáneamente sobre la muestra de células.

Además, el instrumento de conteo es más fácil de usar, es menos costoso y ocupa menos espacio que un citómetro de flujo o un microscopio de fluorescencia. Esto permite a los investigadores realizar rápidamente ensayos cuantitativos como la viabilidad en células que expresan GFP en la mesa de trabajo. En este procedimiento, las células U2 OS a una concentración de una por 10 a seis células por mililitro se transducieron con una construcción viral GFP de luz celular dirigida nuclear para mantener las células muertas con yoduro de propidio y transferir 100 microlitros de la suspensión celular a un nuevo tubo de microcentrífuga.

Tenga en cuenta que se recomienda una concentración de uno por 10 a la quinta a una por 10 a la séptima células por mililitro para el ensayo, aunque la concentración no tiene que ser exacta. A continuación, agregue un microlitro de reactivo de rojo de células muertas. A continuación, agite brevemente para mezclar, incube el reactivo de tinción y la mezcla de células a temperatura ambiente en la oscuridad durante uno a cinco minutos.

Después de la incubación, proceda inmediatamente al análisis en el citómetro basado en imágenes de tallo. El conteo utiliza portaobjetos de análisis celulares de plástico desechables diseñados específicamente para el instrumento. Asegúrese siempre de sujetar la corredera por los bordes para cargarla.

Pipetear lentamente 25 microlitros de muestra en una de las áreas de carga de muestras en forma de media luna. Aquí, las células de control no transducidas no teñidas se cargan en la cámara A y las células que expresan GFP teñidas se cargan en la cámara B.To realizar un ensayo de viabilidad en células que expresan GFP, toque G-F-P-R-F-P en la pantalla de inicio del citómetro. A continuación, aparecerán las opciones de ensayo a la derecha: seleccione GFP más viabilidad.

A continuación, el instrumento preguntará si se debe nombrar la serie de muestras para nombrar la serie de muestras. Presione nombre ahora. Luego, usando la pantalla táctil, escriba el nombre de la serie de muestras y presione guardar, el citómetro de conteo avanzará automáticamente a la pantalla de medición.

A continuación, para medir la fluorescencia de fondo, presione la pestaña de fondo en la mitad inferior derecha de la pantalla de medición como se puede ver aquí. La configuración predeterminada indica que se generarán imágenes de nueve campos de celdas. Ahora, con la muestra de control en dirección opuesta al instrumento, inserte la corredera en el puerto de carga hasta que se detenga.

No aplique fuerza en la pantalla de fondo, toque la prensa para insertar un nuevo control de celda sin manchar. La corredera se introducirá automáticamente en el instrumento y se mostrará una imagen en vivo de las celdas en la pantalla. Con la perilla de enfoque, coloque las celdas en el plano de visión adecuado mientras enfoca.

Deslice el botón rojo de zoom a cuatro x o 16 x. Para ver mejor la población de células, las celdas deben ser uniformemente oscuras con un halo brillante alrededor de cada una. Como se muestra aquí, las celdas pueden estar subestimadas cuando la transición entre el fondo y los bordes de las celdas es difusa, por lo que los límites de las celdas no están bien definidos.

Las células pueden estar sobrecontadas cuando tienen centros brillantes y perímetros oscuros. Una vez que las células se hayan enfocado, toque, presione para ejecutar el control celular sin manchas. Para medir la fluorescencia de fondo, el citómetro capturará automáticamente imágenes y mostrará miniaturas de cada campo de visión.

La barra de progreso proporciona una actualización continua del análisis. Una vez completada la captura de la imagen, el citómetro expulsa automáticamente el portaobjetos y proporciona los datos del análisis de las imágenes capturadas. Los datos almacenados se muestran en el menú desplegable de la pestaña de fondo.

A la muestra de control en segundo plano se le asignará el mismo nombre que el que se le dio al experimento. Para ejecutar la muestra transducida GFP teñida con PI, retire el portaobjetos del instrumento, gírelo y vuelva a insertarlo con la muestra transducida en dirección opuesta al instrumento. Presione la pestaña de muestra y, a continuación, toque presionar para insertar una nueva muestra.

Cuando la imagen aparezca en la pantalla, use la perilla de enfoque para enfocar las celdas. Como antes, luego toque presionar para ejecutar la muestra. Una vez completada la captura de la imagen, los datos del análisis aparecen en la pestaña de muestra y el citómetro expulsa automáticamente el portaobjetos de forma adecuada.

Deseche la diapositiva de análisis celular de conteo. Como residuo biopeligroso, estos portaobjetos no se pueden reutilizar. Una vez que se ejecuta la muestra, se pueden aplicar umbrales a la muestra.

Para analizar poblaciones de células específicas aquí, ajustaremos los umbrales para determinar el porcentaje de células vivas y muertas. En las células que expresan GFP en la pestaña de muestra, el número y el porcentaje de células que expresan GFP, células vivas y muertas que expresan GFP viabilidad total. Se muestra el tamaño medio de las células, el número de células contadas y la concentración de células.

Además, en la parte inferior de la pantalla se muestran gráficos de histograma que muestran el tamaño de la celda, la fluorescencia verde y la fluorescencia roja. Para establecer la puerta de tamaño de celda, toque la miniatura de tamaño de celda para abrir el histograma de tamaño de celda y excluir cualquier residuo. Mueva las barras deslizantes azules para excluir eventos grandes y pequeños.

Toque aplicar para incluir las celdas dentro de las puertas. Junto a agregar la fluorescencia GFP al análisis, toque la miniatura del histograma GFP. Para abrirlo.

Mueva la barra deslizante azul para establecer el umbral justo a la derecha del pico más tenue. Utilice la muestra de control como guía. Esto permite que el análisis incluya las células GFP positivas, pero excluya las células autofluorescentes.

La autofluorescencia se observa con frecuencia cuando las moléculas biológicas dentro de las células se tocan para confirmar y volver a la pantalla anterior. Los datos que se muestran en la pestaña de muestra ahora deberían reflejar las puertas y el umbral establecidos para ambos canales de fluorescencia. A continuación, para separar las células de tinción PI de la autofluorescencia o de cualquier fondo presente en la muestra, pulse la miniatura del histograma PI para abrirla de nuevo.

El pico de la muestra de control se mostrará como un pico gris en el histograma. El pico rojo es la fluorescencia de la muestra. La fluorescencia de fondo se muestra como un pico más cercano al valor cero de RFU en este instrumento.

Para eliminar la fluorescencia de fondo en el canal PI, mueva la barra deslizante azul para ajustar el umbral. Para excluir este pico, utilice el pico gris de la muestra de control como referencia. Cuando el umbral en el canal PI esté configurado correctamente, toque aplicar para confirmar y volver a la pantalla anterior, el instrumento de recuento volverá a analizar automáticamente los datos y actualizará los resultados en la pestaña de muestra.

A continuación, para confirmar visualmente que cada celda está asignada correctamente, presione la pestaña de zoom y, a continuación, seleccione un campo de visión capturado para revisarlo presionando la miniatura de la imagen. A continuación, pulsa la pestaña de capas. A continuación, presione el botón GFP o PI para mostrar la imagen capturada a través de ese canal.

Presione el mismo botón nuevamente para eliminar la capa de la pantalla o para superponer capas, toque los botones correspondientes a cada canal para identificar cómo se cuentan las celdas a través de un canal en particular. Círculos táctiles: las células que se contaron solo a través del canal de campo claro, que no expresan fluorescencia, se encerrarán en un círculo azul. Esto indica que una célula en particular son células vivas que se expresan en el canal verde.

GFP se encerrará en un círculo en celdas verdes que se expresan en el canal rojo. Las teñidas con pi se marcarán con un círculo rojo y se contarán las células muertas en ambos. El canal rojo y verde aparecerán con un círculo amarillo.

Esto indica que la célula expresa GFP pero también está teñida con pi y, por lo tanto, está muerta. De vez en cuando aparecerá un círculo negro en la pantalla. Se trata de objetos que se han identificado, pero que se han excluido del análisis en función del tamaño de celda.

Continúe ajustando el umbral en el histograma de fluorescencia siguiendo los pasos que se acaban de describir hasta que cada célula que expresa fluorescencia esté encerrada en un círculo con el color apropiado. Todos los parámetros de análisis se guardan automáticamente en el instrumento. Debajo del grifo de datos.

El recuento puede almacenar archivos de datos de 500 ejecuciones de muestra. Cada archivo almacenado en la pestaña de datos está disponible para su reanálisis. Al seleccionar el archivo en la pestaña de datos, se volverá a abrir y todos los histogramas y capas se activarán para archivar datos y generar informes.

Los datos almacenados en el instrumento pueden transferirse a una computadora mediante una unidad USB. Se transducieron cuatro tipos de células representativas con una luz de célula nuclear dirigida, una construcción viral GFP teñida con un kit de viabilidad de recuento utilizando reactivo de rojo de células muertas y se analizaron mediante el recuento en un citómetro de flujo como se muestra aquí. Ambos métodos informaron aproximadamente el mismo porcentaje de la población para cada tipo de célula que expresaba GFP, junto con el porcentaje de la población total que eran viables y expresaban GFP.

Estos datos demuestran que el citómetro de Tali es capaz de discriminar entre la expresión total de GFP en una población y la expresión de GFP en la población viva. Acabamos de demostrar cómo utilizar el citómetro basado en imágenes Tally para evaluar la expresión de fluorescencia y la viabilidad en su muestra de célula. Esta tecnología cierra la brecha entre los estudios de células individuales y poblacionales.

Con el citómetro basado en imágenes de tallo, puede recopilar información visual cuantitativa y cualitativa sobre células individuales, así como sobre poblaciones de células más grandes. Utilizando el mismo procedimiento, se pueden realizar varios otros ensayos, como la apoptosis, la expresión de RFP y la viabilidad celular. En el caso de las células no expresivas, las posibles aplicaciones incluyen la evaluación de la expresión génica hasta los estudios de la eficacia de los fármacos.