La investigación de la inflamación intestinal inducida por DSS en el modelo de la EII

Los modelos experimentales de enfermedad inflamatoria intestinal, nos han permitido examinar las respuestas del complejo inmune innata y adaptativa asociada con la patogénesis. El uso de puntuación histológico, la cuantificación de citoquinas pro-inflamatorias y la actividad mieloperoxidasa, se puede comenzar a evaluar las respuestas observadas en la enfermedad inflamatoria intestinal.

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la respuesta inmunitaria intestinal inducida por el sulfato de dextrón sódico mediante la determinación de las cantidades de actividad de la mieloperoxidasa y las citocinas proinflamatorias producidas en respuesta a la inflamación. En primer lugar, se induce colitis DSS en ratones mediante la introducción de una solución DSS SALT en el agua potable. A continuación, se evalúa la gravedad de la enfermedad de la colitis mediante una puntuación macroscópica y se extirpa el colon para su posterior análisis.

A continuación, el colon disecado se secciona en tres partes para la histología, la cuantificación de citocinas y la actividad de NPO. Finalmente, se homogeneiza el tejido del colon y se utiliza el sobrenadante para determinar la actividad de MPO. En última instancia, los cambios en la actividad de MPO se pueden determinar a través de los datos de absorbancia recopilados con un espectrofotómetro.

Este método puede proporcionar información crónica de varios modelos de enfermedad inflamatoria intestinal, como la colitis inducida por DSS y TNBS. Además, puedes utilizar este método en otros órganos como el pulmón y el hígado antes de comenzar el procedimiento. Reemplace el agua potable en cada jaula de ratón con una solución DSS para inducir la inflamación.

Dar agua potable a los ratones de control en autoclave sin DSS. Luego, el día del experimento, disecciona el colon como se demostró previamente en el artículo de JoVE de Whitham Williams y Williams. Exprima con cuidado las heces de todo el colon con un par de pinzas dobladas, recogiéndolo en un papel de pesaje enjuagando el tejido con PBS estéril.

Evalúe las heces usando un par de pinzas para presionar las heces para determinar su consistencia y determinar una puntuación de sangre en las heces. Anote el color de las heces y valide aún más la evaluación mediante una prueba de heces hemoocultas, que consiste en untar heces sobre papel hemocultivo, agregar revelador y luego anotar el color azul que denota una prueba de heces positiva para sangre. A continuación, utilice esta tabla para determinar un valor para cada una de las condiciones.

A continuación, manteniendo la orientación proximal a distal del colon, corte el colon en tres secciones iguales. A continuación, tome fragmentos de muestra de las secciones proximal y media del colon y coloque las muestras en tubos individuales de 1,5 mililitros de ef. Para evaluar el daño histológico de la gravedad de la colitis, utilice la sección de tejido más distal del colon y corte un pequeño fragmento de medio a un centímetro de longitud.

Coloque el fragmento en un casete de papel y sumerja el casete en una solución tamponada de formalina al 10%. Luego, después de preparar secciones transversales incrustadas en parafina de los fragmentos de tejido, tiña las secciones con hematina eoína para que un observador ciego las marque. Finalmente, congele las muestras de las secciones proximal y media del colono en nitrógeno líquido y guárdelas hasta su uso a menos 70 grados centígrados.

Después de retirar las muestras de colon del almacenamiento a menos 70 grados centígrados, colóquelas en hielo. Luego, usando pinzas dobladas para eliminar las heces o la grasa visibles, y colóquelas en tubos individuales de dos mililitros adecuados para su uso en un homogeneizador. A continuación, determine y registre el peso de cada muestra.

A continuación, agregue perlas homogeneizadoras a cada tubo de muestra y luego agregue la cantidad adecuada de tampón de lengüeta H al tubo de acuerdo con el peso del tejido que se acaba de determinar, disocie los fragmentos con un homogeneizador de tejido durante cuatro minutos a 30 hercios. Finalmente, centrifugue la solución celular durante seis minutos a 13, 400 veces G y cuatro grados Celsius. Recoja el sobrenadante en un tubo nuevo y luego, asegurándose de mantener la perla de homogeneización, deseche la bolita resultante.

A continuación, el sobrenadante puede almacenarse a menos 70 hasta su uso. Comience este paso agregando siete microlitros del homogeneizado de tejido previamente preparado por triplicado en una placa de 96 pocillos. A continuación, añada 50 microlitros de peróxido de hidrógeno diluido al yodo OD Dion recién preparado.

Con una pipeta multicanal, agregue 200 microlitros de la mezcla de peróxido de hidrógeno a cada uno de los pocillos. Ahora, mida la absorbancia de 550 nanómetros usando un espectrofotómetro, tomando tres lecturas a intervalos 32. Luego, usando los datos de absorbancia, el peso del tejido y el volumen del tampón, calcule la actividad de NPO en los homogeneizados como se muestra en este cálculo de muestra.

Durante la duración del tratamiento con DSS, el índice de actividad de la enfermedad se puede utilizar para evaluar y evaluar la progresión clínica de la enfermedad. Los animales tratados con DSS muestran una pérdida de peso significativa en comparación con su peso inicial, heces blandas y sangrado fecal. Cuanto más sustancial es el sistema macroscópico, mayor es el índice de actividad de la enfermedad.

Tras el sacrificio y el examen de los colones de ratones a los que se les administró un 5% de DSS en agua potable durante cinco días, se determinó que la gravedad de la colitis basada en la puntuación macroscópica del acortamiento de la longitud del colon, el sangrado colónico, el sangrado fecal, el aflojamiento de la consistencia de las heces y los signos de sangrado rectal para este experimento representativo era aproximadamente cinco veces peor que en los controles tratados solo con agua, como lo demuestran estos datos de secciones transversales de DSS tratados Las muestras de tejido colónico, al igual que H y E, tienen puntuaciones histológicas más altas que los controles tratados con agua. Aquí, la arquitectura normal y la falta de infiltrado celular se pueden observar en el área indicada por el asterisco en esta sección transversal teñida con h y e recolectada de un animal de control que solo recibió agua. Ahora compare esta tinción h y e de una muestra de un animal tratado con DSS con la figura anterior.

El colon de este animal exhibe más daño histológico, como lo demuestra una mayor infiltración celular, como lo indica el signo de la libra, y una mayor depleción de las células caliciformes y una mayor distorsión. Daños en la arquitectura de la cripta K como indica el asterisco. Para caracterizar aún más el alcance de la gravedad de la enfermedad en ratones tratados con DSS, se puede evaluar la actividad de NPO, un marcador sustituto de la inflamación, a partir de muestras de tejido de colon homogeneizadas.

Como era de esperar, los colones tratados con DSS tienen una mayor actividad de NPO que los controles. Además, la gravedad de la colitis inducida por el DSS se asocia con un aumento de los niveles de citocinas proinflamatorias, como IL uno beta, IL seis y TNF alfa. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la actividad de MPO puede disminuir con el tiempo.

Por lo tanto, el ensayo MPO debe ser uno de los primeros ensayos realizados para determinar la gravedad de la inflamación intestinal.