Creación de un denso Transposon inserción biblioteca usando Conjugación bacteriana en cepas enterobacterianas tales como Escherichia Coli o Shigella flexneri

El objetivo general de este procedimiento experimental es crear una biblioteca de inserción de transposones de alta densidad en Escherichia coli o Shigella flexneri utilizando la conjugación bacteriana. Esta técnica permite la creación de cientos de miles de mutantes bacterianos únicos mediante la inserción genómica aleatoria de un transposón Tn10. La principal ventaja de esta técnica es que la transferencia del plasma al albergar el transposón se realiza mediante conjugación bacteriana en lugar de otros métodos menos eficientes, como la electroporación.

Además, el propio transposón Tn10 se inserta en el genoma con menos sesgo que otros transposones. Utilizando una técnica estéril, agregue un mililitro de cultivo nocturno de la cepa donante en un tubo eppendorf estéril. El tubo debe estar etiquetado, por ejemplo, con una D, para donante.

Haga lo mismo con la cepa receptora, retirando un mililitro de cultivo nocturno de la cepa receptora en un tubo eppendorf estéril. De nuevo, por ejemplo, etiquetado con R, para destinatario. Centrifugar ambos tubos durante un minuto a 14.000 veces G a temperatura ambiente.

Esto se puede hacer en una centrífuga de sobremesa. Mientras la centrífuga está funcionando, prepare los filtros para la conjugación. Use pinzas estériles para colocar un filtro de nitrocelulosa en una placa de agar LB etiquetada que no contenga antibióticos.

Alternativamente, en lugar de un filtro de nitrocelulosa, se puede utilizar papel secante estéril. Coloque cada filtro en una placa de agar LB separada para minimizar la contaminación. Asegúrese de que cada filtro esté colocado en una placa de agar LB que esté debidamente etiquetada.

Haz tres platos, cada uno con un filtro. Uno para la cepa donante, otro para la cepa receptora y otro para la biblioteca. Una vez finalizada la centrífuga, retire los cultivos durante la noche.

Retire todos los medios de crecimiento que contengan antibióticos del tubo de Eppendorf y deséchelos. Tenga cuidado de no interrumpir o perturbar la paleta de células bacterianas, pero trate de eliminar todos los medios de crecimiento. Asegúrese de trabajar asépticamente y cambie las puntas entre cada muestra.

A cada tubo eppendorf, agregue 110 microlitros de medios LB frescos sin antibióticos y pipetee hacia arriba y hacia abajo para volver a suspender el cultivo. Asegúrate de trabajar de forma aséptica. Pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces para asegurarse de que no queden grumos de células.

Este paso se realiza para concentrar el cultivo bacteriano y eliminar los antibióticos que queden del cultivo durante la noche. Con una pipeta, coloque 50 microlitros del cultivo concentrado de donante en el filtro etiquetado como Donante. Agregue lentamente los 50 microlitros al filtro gota a gota.

Haga lo mismo con la cepa receptora añadiendo 50 microlitros del cultivo resuspendido, el cultivo resuspendido concentrado en el filtro receptor gota a gota. Para que se produzca la conjugación, tanto la cepa receptora como la cepa donante se añaden al mismo papel de filtro para que estén en estrecho contacto físico. Para hacer esto, agregue 50 microlitros de la cepa donante y la cepa receptora al mismo filtro en la biblioteca etiquetada con la placa.

Coloque estas placas de agar que contienen los filtros a 37 grados durante seis horas. El proceso de conjugación ocurre durante seis horas a 37 grados centígrados. Durante la conjugación, la plasmina pJA1 pasa a la cepa receptora.

Después de la conjugación, las bacterias se disocian del filtro por vórtice y se inducen con un milimolar de IPTG. IPTG induce la transposasa y el transposón que contiene el gen de la resistencia a la kanamicina se inserta aleatoriamente en el genoma de la cepa receptora. Las bacterias se colocan en placas de agar LB que contienen kanamicina y otro antibiótico para seleccionar la cepa receptora que contiene el transposón.

La cepa receptora es Lambda pir negativa, por lo que la plasmina pJA1 se pierde. Después de seis horas de crecimiento a 37 grados centígrados, la conjugación es completa. Retire las placas que contienen los filtros de la incubadora.

Utilice pinzas estériles para extraer el filtro que contiene el control de donante negativo de la placa de agar LB. Golpee el tubo para llevar el papel de filtro al fondo del vial cónico y asegúrese de que el filtro esté completamente sumergido en el medio LB. Este tubo contiene dos mililitros de medio LB con IPTG y una concentración final de un milimolar.

Agite el tubo durante un minuto para disociar las bacterias del filtro de nitrocelulosa. El medio LB debe volverse turbio con células bacterianas. Repita esto para el control de destinatario y también para la biblioteca.

Después de que los filtros que contienen las células bacterianas se hayan vertiginado completamente para disociar las bacterias del filtro, las células bacterianas se colocan en medios seleccionados. En este paso, las bacterias se colocan en placas de agar LB que contienen kanamicina y otro antibiótico como el ácido nalidíxico. La kanamicina se utiliza para seleccionar células receptoras que tienen el transposón que contiene el marcador de resistencia a la kanamicina integrado con éxito en el genoma.

Se seleccionan las células receptoras que no han tenido el marcador integrado en el genoma. Se utiliza otro antibiótico, como el ácido nalidíxico, para seleccionar contra la cepa donante. La cepa donante utilizada aquí es sensible al ácido nalidíxico, mientras que la cepa receptora es resistente al ácido nalidíxico.

Con este segundo antibiótico es posible eliminar la cepa donante. En este paso, se deben sembrar varias diluciones para determinar una dilución de la biblioteca que produzca muchas colonias que estén adecuadamente espaciadas. Después de contar y registrar el número de colonias en todas las placas que contienen la biblioteca de transposones, algunos usuarios pueden querer agrupar o combinar la biblioteca en un solo tubo.

Esto se puede hacer usando un esparcidor estéril. Agregue un mililitro de medio LB a la placa de agar LB que contiene la biblioteca de transposones. Una vez que se haya agregado el medio a la placa, use el esparcidor estéril para raspar y disociar las bacterias de la placa.

A menudo no es posible eliminar todas las bacterias del plato. Retire la suspensión bacteriana y colóquela en un recipiente cónico de 50 mil o 15 milésimas de pulgada. Repita esto para todos los platos.

Una vez que se hayan raspado todas las placas, agite la suspensión bacteriana acumulada durante un minuto completo para romper los grupos de células. Esto constituye ahora la biblioteca agrupada. Después de un crecimiento a 37 grados durante 18 horas, no debe haber crecimiento en las placas de control del donante o del receptor.

Las placas que contienen la biblioteca mutante idealmente contienen muchas colonias con una variedad de tamaños. Los diferentes tamaños de colonias indicaron clones de diferente aptitud y son una buena señal de que el protocolo ha funcionado. La creación de una densa biblioteca de mutagénesis de transposones en bacterias es potencialmente ventajosa para muchas aplicaciones posteriores, que van desde el descubrimiento de genes de virulencia y patógenos de bacterias hasta el estudio de genes esenciales y la identificación de redes de interacción genética.

Todas estas aplicaciones posteriores se basan en la construcción de una biblioteca de inserción de transposones densa. El método presentado aquí proporciona un procedimiento simple, rápido y económico para hacer una biblioteca de transposones muy densa en cepas de enterobacterias como E. coli o Shigella flexneri.