High Yield La expresión de proteínas recombinantes humanos con la transfección transitoria de células HEK293 en Suspensión

El objetivo general de este procedimiento es expresar glicoproteínas de mamífero con glicosilación adecuada de mamífero dirigiendo las proteínas recombinantes hacia la vía secretora del RE y el complejo de Golgi. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en inmunología, como cuál es el papel de una especificación, los patrones en la estructura y el potencial de activación inmune de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza células humanas para expresar proteínas humanas, lo que proporciona el entorno celular adecuado para plegar y modificar correctamente las proteínas diana.

La incubadora agitadora para el establecimiento celular debe operarse a 135 RPM, 80% de humedad, 8% de dióxido de carbono y 37 grados Celsius, al menos una hora antes de la inoculación del cultivo. Encienda la lámpara UV de la cabina de seguridad biológica, caliente previamente los frascos sellados del medio A y del medio B en un baño de agua a 37 grados Celsius. Apague las luces UV y esterilice la cabina de seguridad biológica con una solución de etanol al 70% y agua.

Esterilice un matraz de cultivo Erlenmeyer de 125 mililitros con tapa ventilada, pipetas, pipetadores y frascos de medio precalentado rociándolos con una solución de 70% de etanol en agua. Coloque estos elementos dentro de la cabina de seguridad biológica durante todo este procedimiento. Todos los elementos deben esterilizarse de esta manera antes de introducirlos en la cabina de seguridad biológica.

Prepare medio de cultivo fresco para un cultivo de 30 mililitros extrayendo 26 mililitros del medio A y tres mililitros del medio B, y transfiera la mezcla al matraz erlenmeyer de 125 mililitros. Mezcle suavemente agitando. Caliente, en un baño de agua a 37 grados Celsius, un vial de células HEK 293F previamente congeladas a menos 80 grados Celsius hasta que comiencen a descongelarse parcialmente. Este proceso tarda aproximadamente un minuto y las células no deben descongelarse por completo.

A continuación, esterilice el exterior del vial con la solución de etanol al 70% en agua y trasládalo a la cabina de seguridad biológica. Utilizando una pipeta de un mililitro, retire la suspensión celular y transfiera al matraz erlenmeyer de 125 mililitros que contiene 29 mililitros de medio de cultivo fresco. Cierre la tapa del frasco de cultivo y coloque el frasco en el agitador de incubación durante 24 horas.

24 horas después de la inoculación del cultivo. Verifique la densidad celular, esterilice el matraz de cultivo con una solución de etanol al 70 % y agua, y colóquelo en la cabina de seguridad biológica. Utilizando una pipeta de un mililitro y un pipeteador, retire lentamente 100 microlitros del cultivo y transfiéralos a un tubo Eppendorf estéril de 0,5 mililitros.

Cierre la tapa del frasco de cultivo y regrese el frasco al agitador de incubación lo más pronto posible. Mezcle 7,5 µL de una solución de azul de tripano con 7,5 µL de células. Agite vigorosamente y luego transfiera 7,5 µL de la mezcla a una lámina de conteo.

Encienda el contador automático de células y coloque la lámina de conteo en la cámara de carga. El lector automático se activa y las células se cuentan automáticamente en unidades de número de células por mililitro y porcentaje de viabilidad. Determine el volumen de la cultura del donador necesario para transferirlo a un medio de cultivo fresco para obtener una densidad celular de 300 000 células viables por mililitro.

Prepare el medio de cultivo fresco como se indicó previamente, transfiriendo 23 mililitros del medio A y tres mililitros del medio B a un matraz de cultivo nuevo de 125 mililitros. A continuación, retire los frascos almacenados del medio A y del medio B de la cabina de seguridad biológica para reducir el riesgo de contaminación. Recupere el matraz de cultivo celular HEK 293F del incubador.

Rocíe con la solución de etanol al 70 % y agua y coloque el material en la cabina de seguridad biológica utilizando una pipeta nueva. Retire la alícuota correcta de células del cultivo y transfiérala al matraz que contiene medio de cultivo fresco. Transfiera ambos cultivos desde la cabina de seguridad biológica hasta el agitador de incubación.

Cultive las células hasta alcanzar una densidad aproximada de dos a tres millones de células viables por mililitro antes de la transfección. Verifique la densidad celular como se demostró anteriormente y determine la cantidad de células necesaria para la transfección. Utilice una pipeta serológica estéril.

Transfiera el volumen adecuado de la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 250 mililitros. Recopile las células mediante centrifugación a 100 ×g durante cinco minutos. Tras la esterilización, transfiera el tubo que contiene las células sedimentadas a la cabina de seguridad biológica.

Utilice una pipeta estéril para decantar el sobrenadante, que consiste en medio de cultivo gastado. Resuspenda vigorosamente las células sedimentadas mediante pipeteo ascendente y descendente usando 10 mililitros de medio de cultivo fresco, y transfiera a un frasco preparado que contenga medio de cultivo para transfección fresco. Coloque la tapa del frasco de cultivo celular ventilado y incube el frasco en el agitador de incubación durante 15 minutos hasta una hora mientras las células están incubando.

Diluya el ADN plasmídico y las soluciones stock de POLIETERAMINA o PEI utilizando medio de cultivo fresco hasta una concentración final de 0,5 microgramos por microlitro. Retire el frasco de cultivo con las células dispersas del agitador de incubación y llévelo a la cabina de seguridad biológica; utilice una micropipeta para añadir 300 microlitros de ADN plasmídico al cultivo y mezcle mediante agitación manual suave, luego añada 900 microlitros de PEI al cultivo y vuelva a mezclar. A continuación, añada 3,8 mililitros de medio de cultivo fresco.

Transfiera el matraz al agitador de incubación durante 24 horas. Veinticuatro horas después de la transfección, el cultivo celular debe diluirse. Para preparar primero el medio de dilución, utilice una pipeta serológica estéril de un mililitro para extraer un mililitro de ácido valproico PRECALENTADO de 220 milimolar o VPA y transfiéralo a un tubo estéril de 50 mililitros.

A continuación, utilice una pipeta serológica estéril para agregar cinco mililitros del medio B precalentado y 44 mililitros del medio A precalentado a la solución de VPA. Esto da como resultado 50 mililitros de medio de cultivo fresco con una concentración final de 4,4 milimolar de VPA. Retire el cultivo transfectado del incubador.

Esterilice el exterior del matraz y coloque el matraz en la cabina de seguridad biológica. Añada el medio de dilución preparado al cultivo. Transfiera el matraz de vuelta al agitador de incubación durante cuatro o cinco días adicionales tras la transfección.

Monitore la viabilidad celular diariamente mediante el procedimiento demostrado anteriormente. También se deben guardar alícuotas cada día para el análisis de expresión proteica, cinco o seis días después de la transfección o si la viabilidad celular desciende por debajo del 50 %. Recolecte las células mediante centrifugación de las células junto con el medio a 1000 × g durante cinco minutos. Recojan el sobrenadante que contendrá la proteína secretada y añadan cinco mililitros de una solución de lejía al 10 % al sedimento de células HEK y deséchelo como material biopeligroso.

Posteriormente, la proteína se purifica a partir del sobrenadante recolectado. Este sistema de expresión generó un alto rendimiento de proteínas glicosiladas, ilustrado por este patrón típico de expresión de IgG uno fc tras la transfección transitoria de células HK 2 93 F. La purificación por afinidad utilizando una columna de proteína para IgG uno FC o una columna de níquel para GFP marcado con histidina con el receptor gamma tres A de la IgG dio como resultado proteínas con alta pureza.

Este sistema expresó eficientemente IgG con enriquecimiento isotópico en un FC en este espectro de RMN bidimensional que correlaciona la frecuencia de resonancia de los núcleos de hidrógeno y el nitrógeno amídico directamente enlazado. Se observaron señales bien dispersas en átomos 15. Se produjeron diferentes formas glicósidas con células HEK 293 F y HEK 293 S bajo diferentes condiciones de cultivo, como se muestra mediante análisis de espectrometría de masas por desorción e ionización con láser asistida por matriz.

IgG con un FC expresado a partir de células HEK 293, que albergaban glicanos de una forma con cinco anillos más dos residuos de N-acetilglucosamina, que no contenían glicanos con fucosa; los glicanos expresados a partir del material de células HEK 293F eran formas complejas biantenarias con fucosa en el núcleo y mayoritariamente con N-acetilglucosamina terminal, o una pequeña proporción de formas mono o diantenarias. La adición de un inhibidor de la glicosilación a una expresión llevada a cabo utilizando células HEK 293F mostró una reducción superior al 90 % en la incorporación de fucosa. Una vez dominado, el establecimiento de la transfección transitoria puede completarse en 1,5 horas el día uno y en 15 minutos el día dos. Tras un período de expresión de cuatro a seis días, la solución que contiene la proteína puede recolectarse en 15 minutos.

Finalmente, la purificación de la proteína tomará aproximadamente 1,5 horas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener una cultura estable antes de la transfección, transfectar células en crecimiento activo y añadir el ADN antes de agregar PEI. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la caracterización funcional de proteínas mediante una variedad de técnicas biofísicas, con el fin de estudiar la estructura y función de la glicoproteína expresada tras su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología exploraran la relación entre la estructura y la actividad de la IgG y la glicosilación in vitro e in vivo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar y purificar glicoproteínas utilizando nuestra combinación de células K 2 93 F y el vector PZ N dos.