Name: High Yield La expresión de proteínas recombinantes humanos con la transfección transitoria de células HEK293 en Suspensión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Aprende a expresar glicoproteínas mamíferas con glicosilación apropiada utilizando células HEK293 en suspensión. Este método permite estudiar la estructura y activación inmune de anticuerpos con plegamiento correcto.

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Este trabajo fue apoyado financieramente por las subvenciones K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) y P01GM107012 (KWM) de los Institutos Nacionales de Salud, y con fondos del Departamento de Roy J. Carver de Bioquímica, Biofísica y Biología Molecular en la Universidad Estatal de Iowa . El contenido de esta obra es de la exclusiva responsabilidad de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de los NIH.

Este protocolo es suficiente para la expresión utilizando células HEK293F o HEK293s. 1. Establecimiento de la célula <ol><li> Cultura Inoculación Nota: Todos los procedimientos de manipulación de la cultura deben ser realizadas en una instalación BSL-2 y cada artículo llevados a la cabina de bioseguridad deben esterilizarse mediante pulverización con un 70% de etanol en solución acuosa. <ol><li> Haga funcionar el agitador incubadora a 135 rpm, 80% de humedad y al 8,0% de CO 2 y 37 ° C. Girar &quot;en&quot; la lámpara UV de la cabina de bioseguridad al menos 1 hora antes de trabajar. Precalentar las botellas selladas Medio A y Medio B en el baño de agua a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Esterilizar matraces Erlenmeyer de 125 ml de crecimiento con una tapa ventilada, pipetas, pipetas, y botellas de los medios de comunicación precalentadas por pulverización con el 70% de etanol en solución acuosa. Coloque estos artículos en la cabina de bioseguridad. Nota: Esterilizar sólo el exterior de plástico que cubre el frasco de cultivo Erlenmeyer de 125 ml, y luego retire sólo cuando is dentro de la cabina de bioseguridad. </li><li> Por una cultura 30 ml, retirar 26 ml de Medio A y 3 ml de Medio B (10% del cultivo final) y transferir en el matraz de cultivo de Erlenmeyer de 125 ml y mezclar suavemente mediante agitación (en lo sucesivo denominado como medio de cultivo fresco). </li><li> Transferencia de un vial de células que contienen células HEK293F, congelados a -80 ° C, en hielo y pasar a la sala de la cultura. Nota: Las células HEK293F se suministran a una densidad de 1 x 10 7 células / ml. </li><li> Caliente el vial suavemente en baño de agua a 37 ° C para descongelar parcialmente las células (que tarda aproximadamente un minuto y células no debería estar completamente descongelada). Esterilizar el exterior del vial con el etanol al 70% en solución de agua y moverlo a la cabina de bioseguridad. </li><li> El uso de 1 ml pipeta, retirar la suspensión de células (aproximadamente 0,7 ml) y la transferencia en el matraz Erlenmeyer de 125 ml que contiene 29 ml de medio de cultivo fresco. Cierre la tapa del frasco de cultivo y moverlo en la coctelera incubado. </li></ol&gt; </li><li> Mantenimiento Celular: Hora de densidad celular, Viabilidad y pases celulares <ol><li> Comprobar la densidad de células después de 24 h de descongelación de la cultura siguiendo el protocolo a continuación. Nota: Las células se cultivan durante 24 horas después de la descongelación para asegurar el crecimiento de células esenciales y la viabilidad de&gt; 80%. </li><li> Esterilizar el frasco de cultivo con el 70% de etanol en la solución de agua y moverlo a la cabina de bioseguridad. </li><li> Con una pipeta de 1 ml y pipeta, retirar lentamente 100 l de la cultura y la transferencia de la suspensión en un ml tubo Eppendorf estéril 0.5. Cierre y transferir el frasco de cultivo de nuevo en la coctelera tan pronto como sea posible. </li><li> Mezclar 7,5 l de una solución de azul de tripano con 7,5 l de células. Mezclar enérgicamente con 7,5 l de la / mezcla de azul tripán celular y transferirlo a la diapositiva contando. </li><li> Encienda el contador de células automático y colocar la diapositiva de conteo en la cámara de carga. El lector automático se activa y las células se cuentan de forma automática en las unidadesde número de células por ml y el porcentaje de viabilidad </li><li> Determinar el volumen de la cultura donante requerido para la transferencia a un medio de cultivo fresco a la densidad de células de 0,3 x 10 6 células / ml en vivo. Nota: Consulte un ejemplo de cálculo en Materiales suplementarios. </li><li> Repita los pasos 1.1.2 y 1.1.3 del protocolo &quot;1,1 Cultura Inoculación&quot; anterior para preparar los materiales necesarios para el medio de cultivo fresco. </li><li> Transferencia Medio A (23 ml) y Medio B (3 ml) a un matraz de cultivo de 125 ml fresco. Retire las botellas del stock de Medio A y medio B de la cabina de bioseguridad. Nota: Las existencias de botellas de los medios de comunicación no deben guardarse en la cabina de bioseguridad, al mismo tiempo que las células HEK 293F. Esto limita la posibilidad de contaminación de las botellas medianas valores. </li><li> Retire el cultivo de células HEK293 de la incubadora y rociar con el 70% de etanol en solución acuosa. Utilizando una nueva pipeta, retirar la parte alícuota de células (4 ml, este volumen se determinó de acuerdo to paso 1.2.6) a partir del cultivo y la transfiere al matraz que contiene medio de cultivo fresco. </li><li> Traslado tanto las culturas desde la cabina de bioseguridad al agitador incubadora de acuerdo con 1.1.1. Cultivan las células a una densidad aproximada de 2-3 x 10 6 células / ml en vivo. Nota: El tiempo de duplicación aproximada de las células es de 32 h. Se llevará a 3-4 días para llegar a esta densidad. Se incuban las células durante 3-4 pasajes tener patrón de crecimiento estable de las células antes de la primera transfección. </li></ol></li></ol> 2. Preparar materiales para transfección <ol><li> Preparación de células HEK293 (Día 1) <ol><li> Células subcultivo en una densidad de 1 x 10 6 células / ml en medio fresco B 24 hr antes de la transfección acuerdo con la Etapa 1.2. Nota: el volumen del cultivo de transfección será dependiente del número de células. Volúmenes de transfección más grandes (&gt; 20 ml) requerirán un mayor volumen de la cultura en esta etapa. </li></ol></li><li> Preparación Stocks de Materiales <ol><li> Preparar solución madre de polietilenimina lineal (PEI) a una concentración de 1 mg / ml en un tampón que contiene 25 mM 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico ácido (HEPES) y NaCl 150 mM (pH 7,5). Disolver PEI por completo; esto puede tardar 30-60 minutos a temperatura ambiente. Esterilizar a través de filtro de jeringa de 0,22 M y se almacena a -20 ° C para su uso a largo plazo. </li><li> Preparar ADN plásmido estéril (de acuerdo a los pasos 2.2.2.1-2.2.2.4). El procedimiento de construcción del plásmido se describe en otra parte 42. Una breve procedimiento para la preparación de ADN se explica aquí: <ol><li> Crecer un cultivo de células de Escherichia coli químicamente competentes-transformadas con el vector pGEN2 en 1 L de medio LB (10 g Tryptone- / L, Extracto de levadura 5 g / L y cloruros de sodio 10 g / L) suplementado con 100 mg / ml de ampicilina. E. coli se cultiva a 37 ° C en un no humidificado, incubadora de agitación. </li><li> Purificar el ADN pGEN2 vector que codifica plásmido diana de acuerdo con el manuprotocolo de purificación de ADN de fabri-. </li><li> Para asegurar la esterilidad completa del ADN de plásmido, realice los precipitación con isopropanol y resuspensión pasos finales de los procedimientos de extracción de ADN dentro de la cabina de bioseguridad. </li><li> Añadir el volumen de isopropanol (especificado en el kit de preparación de plásmido) a la ADN eluido y se centrifuga a 10.000 x g durante 10 min. Esterilizar el exterior del recipiente de ADN con etanol al 70% en solución de agua y transferirlo dentro de la cabina de bioseguridad. Descartar el sobrenadante usando una pipeta de isopropanol y aire secar el sedimento de ADN. Una vez seco, resuspender el precipitado en tampón estéril Tris 10 mM, pH 8,0. </li></ol></li><li> Preparar solución madre de 220 mM de ácido valproico (VPA) en agua y esterilizar por paso a través de un filtro estéril de 0,22 micras. Guarde la solución a -20 ° C hasta su uso posterior. </li></ol></li></ol> 3. El establecimiento de una transfección transitoria <ol><li> La transfección (Día 0) <ol><li> Compruebe la densidad celular siguiendo los pasos 1.2.2 a través de 1.2.5 de &quot;1.2. Mantenimiento Móvil&quot; arriba. Determinar la cantidad de células para la transfección (2,5-3,0 x 10 6 células / ml en vivo con la viabilidad&gt; 95%). Ver un ejemplo de cálculo en Materiales suplementarios. </li><li> Transferir el volumen de las células de cultivo en suspensión calculados en el paso anterior (aquí 67 ml) a un tubo de centrífuga de 250 ml utilizando una pipeta serológica estéril. Recoger las células por centrifugación durante 5 min a 100 x g. </li><li> Mientras tanto, preparar un medio de cultivo fresco transfección siguiente paso 1.1.3 de acuerdo con &quot;1.1. Cultivo de inoculación&quot; anterior. Ver los Materiales complementarios para el cálculo de la muestra. Además, la transferencia de 5 ml de medio de cultivo fresco a un tubo de 15 ml estéril y dejar de lado. </li><li> Tubos de transferencia que contiene las células sedimentadas en la cabina de bioseguridad después de esterilizar el exterior de los tubos con el etanol al 70% en solución de agua y utilizar una pipeta estéril para decantar THe sobrenadante que consta de medio de cultivo gastado. </li><li> Vigorosamente resuspender las células sedimentadas pipeteando arriba y abajo con 10 ml de medio de cultivo fresco y traslado al frasco con medio de cultivo fresco transfección (preparado en el paso 3.1.3 anterior). Tornillo de la tapa en el frasco de cultivo celular ventilado y mover el frasco a la incubadora (tal como se establece en 1.1.1) durante 15 minutos-1 hora con agitación. </li><li> Durante este tiempo, diluir el ADN plásmido y las existencias de PEI utilizando medio de cultivo fresco (utilizando el volumen 5 ml retirado de paso 3.1.3 anterior) a una concentración final de 0,5 mg / l. Ver cálculos de ejemplo en materiales complementarios para determinar la cantidad de ADN y PEI. Transferir el matraz de cultivo con las células dispersa en la cabina de bioseguridad. </li><li> Añadir ADN plásmido (300 l de 0,5 mg / l) al cultivo utilizando micro-pipeta y mezclar por agitación manual suave. Añadir PEI (900 l de 0,5 mg / l) a la cultura, se mezcla agitando suavemente. Añadir 3,8 ml de cul frescamedio ture, desde el paso 3.1.3, arriba y matraz de transferencia al agitador incubador durante 24 hr. </li><li> Limpie el gabinete de bioseguridad de acuerdo con el Paso 1.1. </li></ol></li><li> Dilución (Día 1) (Para un volumen de 50 ml transfección) <ol><li> Incubar el cultivo transfectadas durante 24 horas. </li><li> Retirar 1 ml de ácido valproico mM precalentado 220 (VPA; preparado de acuerdo con el paso 2.2.3.) Utilizando un estéril de 1 ml pipeta serológica y la transfiere a un tubo de 50 ml estéril. </li><li> Retirar 5,0 ml de precalentado Medio B y 44 ml de Medio A precalentado y añadir esto a la solución VPA utilizando una pipeta serológica estéril para preparar 50 ml de medio de cultivo fresco con una concentración final de 4,4 mM de VPA. </li><li> Mueva el cultivo transfectado en la cabina de bioseguridad después de esterilizar el exterior del matraz con un 70% de etanol en solución acuosa, añadir el medio de dilución preparada y transferir el matraz de nuevo a la coctelera se incubaron. </li></ol></li><li> Expresión y cosecha (días 2-6) <ol><li> Se incuban las células durante otros 4-5 días (5-6 días en total desde la transfección). </li><li> Retirar alícuotas de medio de cultivo siguientes paso 1.2.2. a 1.2.5. se describe en &quot;1.2. Mantenimiento de la célula&quot;, anteriormente usando una pipeta serológica de 1 ml estéril, para monitorizar la viabilidad células y guardar alícuotas para analizar la expresión de proteína en cada día por SDS-PAGE (véase la Sección 5, más abajo). </li><li> Células de la cosecha después de 5-6 días por centrifugación de las células más medio a 1000 g durante 5 min. Además, cosechar el sobrenadante si el viabilidad celular cae por debajo de 50% (consulte los pasos 1.2.2-1.2.5). </li><li> Retirar el sobrenadante que contendrá proteína secretada. Añadir 5 ml de un blanqueador 10% al sedimento celular HEK y desechar como un riesgo biológico. </li></ol></li></ol> Purificación 4. Proteína <ol><li> Preparar una columna con 5 ml de proteína A-Sepharose. Equilibrar la columna con 5 volúmenes de columna de tampón A (20 mM de ácido 3- (N-morfolino) propanosulfónico (MOPS), pH 7,4, NaCl 100 mMl). </li><li> Centrifugar el sobrenadante recogido con proteína expresada a alta velocidad (14.000 g durante 10 min) para eliminar cualquier residuo celular restante. Recoger por decantación en un tubo nuevo. Deseche la pastilla como un peligro biológico. </li><li> Recoger una alícuota de 10 l del sobrenadante y, además, una pequeña muestra en cada etapa de purificación de proteínas para analizar la muestra por SDS-PAGE (descrito en la Sección 5). Cargue el sobrenadante clarificado y recoger el flujo a través. </li><li> Lavar la columna con 3 volúmenes de columna de tampón-A y eluir la proteína con volúmenes de 5 columnas de glicina 100 mM, pH 3,0. Recoger el eluido en tubos que contienen un medio volumen de tampón Tris 1 M, pH de 8,0 para neutralizar rápidamente el pH. </li><li> Lavar la columna con 10 volúmenes de columna de tampón A y almacenar para su uso futuro. </li><li> Intercambio de tampón se eluyó la proteína con al menos un exceso de 10 veces de tampón A utilizando 10 kDa de peso molecular filtros centrífugos de corte. Nota: No concentrar la muestra eluida aun volumen muy bajo (&lt;2 ml) en el tampón de eluido. Usa los filtros centrífugos para intercambiar el tampón con tampón A. </li><li> Tienda purificado proteínas a 4 ° C hasta su próximo uso. Nota: proteína expresada en el sobrenadante puede purificarse mediante columnas de afinidad seleccionados sobre la base de las propiedades de la proteína o el uso de etiquetas de afinidad. Para un procedimiento típico de purificación, columna de proteína A se puede utilizar para IgG o fragmentos Fc o columna de níquel se puede utilizar para proteínas expresadas con una etiqueta de poli-histidina. Aquí, es una descripción de las etapas de purificación para IgG1-Fc utilizando una columna de Proteína A. </li></ol> 5. Análisis de proteínas por SDS-PAGE <ol><li> Diluir las alícuotas (7,5 mu l) de cada muestra con un volumen igual de tampón de carga 2x (0,125 M Tris, pH 8.0, 4% SDS, 10% β-mercaptoetanol, 20% glicerol, y 0,01% azul de bromofenol). </li><li> Hervir la mezcla a 90 ° C durante 5 min usando un bloque de calor o baño de agua. Centrifugar las muestras a 10.000 g for 1 min. Cargue el gel preparado con 5 l de proteína marcadora y 14 l de las muestras para el análisis utilizando una pipeta de 20 l con una punta desechable. </li><li> Ejecute uno de gel a 25 miliamperios durante 60 minutos. Una vez que el paso de electroforesis es completa, transferir el gel a un recipiente con 1 L de agua y microondas durante 5 min. </li><li> Tinción del gel con solución de tinción (etanol 40%, ácido acético al 10% y 0,1% Azul Brillante de Coomassie) durante 2 horas y destain en agua. </li></ol> 6. Los glicanos Análisis por Espectrometría de Masas <ol><li> Analizar glicanos como se ha descrito previamente 44. Brevemente, 75 g de IgG1-Fc se tripsinizó, luego se trató por PNGasaF para la liberación de glicanos 45. Glicanos liberados fueron permetilada y se analizaron por espectrometría de uso de láser asistida por matriz-desorción ionización tiempo de vuelo de masas (MALDI-TOFMS). </li></ol> 7. Protocolo Ajustes por Escenarios especiales <ol><li> Etiquetado de proteínas con 15 N-etiquetados aminoácidos (para un volumen de 50 ml transfección) <ol><li> Dispensar 5 mg de cada aminoácido en un único vial de vidrio estéril. Resuspender con 4 ml de agua en autoclave (nota Tyr no solubilizar por completo, a diferencia de Lys y Phe). Esterilizar la solución en autoclave a 121 ° C durante 15 min. Deje que la solución se enfríe, aproximadamente a 50-60 ° C. </li><li> Para un volumen de transfección 50 ml, siga el paso 3.1.3 de acuerdo con &quot;3.1 Establecer una transfección transitoria&quot;. Vea la sección de Materiales suplementarios para un ejemplo con volúmenes adecuados. </li><li> Para la transfección, siga los pasos de &quot;3. El establecimiento de una transfección transitoria&quot; utilizando medio de cultivo fresco sustituida con residuos de aminoácido marcado como se preparó anteriormente. </li><li> Después de 24 h de transfección, en el día de la dilución de la cultura, retirar 5,0 ml de precalentado Medio B, 40 ml de Medio A precalentado y un recién autoclave 4 ml alícuota de la mezcla de aminoácidos (preparado como en el paso 7.1.1. Supra) y añadir 1ml precalentado solución madre de solución de VPA para preparar 50 ml de medio de cultivo de dilución fresca con una concentración final de 4,4 mM de VPA. Añadir este medio a la cultura de la transfección usando una pipeta serológica estéril. </li><li> Transferir el cultivo transfectado en la cabina de bioseguridad después de esterilizar el exterior del matraz con un 70% de etanol en solución acuosa, añadir el medio de dilución preparada y transferir el matraz de nuevo a la coctelera se incubaron. Nota: Semi-A es un medio libre de suero químicamente definido. Por lo tanto, es posible preparar una formulación diferente. Póngase en contacto con el proveedor para obtener una preparación personalizada Medio A que carece de ciertos aminoácidos. Es posible tener todos los aminoácidos dejados de lado, sin embargo, se prefiere usar medio que carece de pocos residuos seleccionados porque un medio de deserción escolar completa requeriría un ajuste de la osmolaridad después de la suplementación. Elegimos un medio de deserción Lys-Tyr-Phe que puede ser complementada y no requiere ajuste de la osmolaridad. Furthermore, el Medio Un proveedor no comparte libremente las concentraciones de los componentes del medio; hemos utilizado 100 mg / L de cada uno para Lys, Tyr y Phe con éxito. Los volúmenes del medio de transfección y expresión deben ajustarse para dar cuenta de los aminoácidos añadidos. Aquí están los ajustes en el protocolo anterior para el etiquetado de isótopos </li></ol></li><li> Complementar la transfección con una pequeña molécula <ol><li> Preparar solución de 100 mM de stock de 2-desoxi-2-fluoro-L-fucosa utilizando agua tratada en autoclave y esterilizar esta solución usando un filtro de 0,22 mM. </li><li> Para un cultivo de 50 ml, añadir 125 l (a 250 m) de la solución de análogo de fucosa a los medios de transfección y de dilución. Nota: descuidado para realizar cualquier ajuste de volumen aún más debido a la adición de la sustituyente en esta cuentas de concentración por sólo 0,25% del total de volumen de cultivo .Es es posible modificar la expresión utilizando inhibidores de molécula pequeña de procesamiento de glicano. Aquí se describen las condiciones para la inclusión de 2-desoxi2-fluoro-L-fucosa, un inhibidor de la fucosilación glicano. Encontramos&gt; 90% de reducción en fucosilación añadiendo el análogo de fucosa a una concentración de 250 mM en el medio de transfección y dilución. </li></ol></li></ol>

Todos los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos en este manuscrito.

Este protocolo ilustra la expresión de proteínas a través de la transfección transitoria de células HEK293F o S. Las condiciones de transfección óptimas establecidas en los laboratorios de Barb y Moremen emplean una combinación crítica de las concentraciones de densidad celular y reactivos para lograr una alta eficiencia de transfección. Consideraciones críticas en la aplicación de este protocolo son: mantener una cultura estable antes de la transfección (con cultura coherente veces doblando); la transfección de células...

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Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia
to
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam W. Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

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Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

La producción de altos rendimientos de proteínas humanas debidamente plegadas y después de la traducción modificados para el análisis detallado de la estructura y la función sigue siendo un reto importante. Un gran número de sistemas de expresión están disponibles que producen las proteínas recombinantes con la función y el comportamiento similar a la nativa. Sistemas de expresión bacterianos, predominantemente cepas de Escherichia coli, representan las herramientas más accesibles y comúnmente utilizados en el campo de la investigación, debido a la simplicidad de estos sistemas de expresión, aunque la levadura, plantas, insectos y sistemas de mamíferos son también describen a 1-4. Sin embargo, la mayoría de estos sistemas son incapaces de modificación post-traduccional apropiado de las proteínas diana. Un interés fundamental de los laboratorios Barb y Moremen está produciendo proteínas eucariotas con glicosilación apropiada. Muchas proteínas humanas requieren glicosilación apropiada para la función apropiada (ver 5). El eucariotamaquinaria de glicosilación es amplia y capaz de realizar una amplia gama de modificaciones, que incluye tanto la asparagina (N) - y serina / treonina (O) -vinculada glicanos complejos 6. Se estima que&gt; 50% de las proteínas humanas son N-glicosilada 7. Los glicanos son componentes esenciales de muchas proteínas, incluyendo anticuerpos monoclonales terapéuticos, eritropoyetina y factores de coagulación de la sangre como el factor IX, para nombrar unos pocos. Aunque existen varios métodos para preparar proteínas adecuadamente N-glicosilada y van desde puramente sintético 8-10, a quimioenzimática 11-14 o la recuperación de los sistemas recombinantes ingeniería 15-20, como es lógico, los sistemas de expresión humanos hasta ahora han demostrado ser el más robusto métodos para generar proteínas humanas. Muchos glicoproteínas humanas terapéuticas se producen en sistemas recombinantes utilizando células de mamíferos. Sistemas de la nota son el ovario de hámster chino (CHO), mieloma de ratón (NS0), Baby Hamster kidney (BHK), del riñón embrionarias humanas (HEK-293) y líneas de células de la retina humanos que se emplean en la adhesión o suspensión de cultivo para la producción de proteínas 4,21,22. Sin embargo, los sistemas de expresión proteína de mamífero han requerido la generación de líneas celulares estables, medios de crecimiento y el sustrato asistida caros procedimientos de transfección 23. La transfección de células de mamífero se consigue con la ayuda de numerosos agentes, incluyendo fosfatos de calcio 24,25, polímeros catiónicos (DEAE-dextrano, polibreno, polilisina, polietilimina (PEI)) o liposomas catiónicos cargados positivamente 26-29. PEI es un policatiónico, cargada, lineal o polímero ramificado (25 kDa) 26 que forma un complejo estable con el ADN y se endocitosis. Tras la acidificación del endosoma, PEI se piensa a hincharse, lo que lleva a la ruptura de endosomas y la liberación del ADN en el citoplasma 26,30. Hasta hace poco, la transfección transitoria en Suspensiònen la cultura fue llevado por la formación de complejos de ADN / PEI antes seguido de la adición al cultivo celular 29. Sin embargo, Würm y compañeros de trabajo informó de un protocolo altamente eficiente optimizado para la producción de proteínas recombinantes en células HEK293 que formaban un complejo ADN / PEI in situ 31,32. Esto evitó la preparación, la esterilización del complejo, y el intercambio de tampón en un medio de cultivo. Además optimización incluyendo plásmidos de expresión para mejorar llevado a aumentos de rendimiento significativa 33. Aquí un método que se basa en estos avances y es ampliamente aplicable. Condiciones de expresión también pueden alterarse para afectar a la composición de N-glicano. La línea de células HEK293s, con una deleción del gen que detiene el procesamiento de N-glicano en una etapa intermedia, conduce a la expresión de proteínas con uniformes N-glicanos que consta de 2 residuos de N-acetilglucosamina más cinco residuos de manosa (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Estas célulascarecer de la N-acetilglucosaminil transferasa I (GnTI) de genes que se requiere para N-glicano de procesamiento aguas abajo 36,37. El uso de inhibidores de glicosiltransferasa incluyendo kifunensine, análogos del ácido siálico y el análogo de fucosa y 2-desoxi-2-fluoro-fucosa tiene efectos y los límites de procesamiento de N-glicano 38 a 41 similares. El protocolo informó aquí utiliza el vector pGEN2 como se muestra en la Figura 1 42,43, PEI transfección asistida transitoria en líneas de células de mamíferos (HEK293F o células HEK293s), y la recuperación de altos rendimientos de proteína apropiadamente glicosilada. Este sistema es robusto y puede acomodar varios factores, incluyendo el etiquetado de isótopos y la ingeniería glicano para la producción de grandes títulos de proteínas recombinantes.

<table><tbody><tr><td>Gabinete de bioseguridad&nbsp;</td><td>NuAire, Inc.</td><td>CellGard ES NU-S475-400</td><td>Clase II, Tipo A2 Cabina de Seguridad Biológica</td></tr><tr><td>Agitador de incubación</td><td>INFORS HT</td><td></td><td>Multitron Cell&nbsp;</td></tr><tr><td>Medio A: FreeStyle Expression Medium&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td></td></tr><tr><td>Medio B: ExCell 293 Medio sin suero&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>14571C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>125 Matraz Erlenmeyer con tapón ventilado</td><td>Corning Incorporated/Ciencias de la Vida</td><td>431143</td><td></td></tr><tr><td>250 Matraz Erlenmeyer con tapón ventilado</td><td>Corning Incorporated/Ciencias de la Vida</td><td>431144</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle HEK 293F Celdas Life</td><td>Technologies</td><td>R790-07</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Pipeta serológica desechable</td><td>Fisher Scietific</td><td>13-676-10B</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipeta serológica desechable</td><td>Fisher Scietific</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Pipeta serológica desechable</td><td>Fisher Scietific</td><td>13-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>(Pipet-Aid XP)</td><td>Drummond Scientific</td><td>161263</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de conteo&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Contador Celular Automatizado&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimina (PEI)</td><td>Polysciences Inc.</td><td>23966</td><td>Preparar solución madre a una concentración de 1 mg/ml en un tampón que contenga 25 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinenetanosulfónico (HEPES) y 150 mM de NaCl (pH 7,5). Disolver el PEI por completo; esterilizar a través de 0.22 &mu; M filtre la jeringa y guárdela a -20 °C.</td></tr><tr><td>Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico (HEPES)</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa de 25 mm, 0,22 &mu; M</td><td>Fisher Scietific</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>Trisaminometano (Tris base)</td><td>Fisher Scietific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue</td><td>Stratagene</td><td>222249</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Fisher Scietific</td><td>BP1421-2</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Fluka Analytical&nbsp;</td><td>92144</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>BDH productos químicos BDH8014</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificación de plásmidos</td><td>QIAGEN</td><td>12145</td><td></td></tr><tr><td>Valproic (VPA)</td><td>SIGMA</td><td>P4543</td><td>Prepare la solución madre de 220 mM&nbsp; en agua, esterilice pasando a través de un filtro estéril de 0,22 mm y almacene a -20 &ng; </td></tr><tr><td>Centrífuga</td> C <td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>EW-17707-65</td><td></td></tr><tr><td>Columna de proteína A-Sepharose</td><td>SIGMA</td><td>P9424</td><td></td></tr><tr><td>Superflujo de Ni-NTA</td><td>QIAGEN</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS)</td><td>Fisher Scietific</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scietific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>10 kDa corte de peso molecular Amicon&reg; Filtros ultra centrífugos&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio</td><td>ALDRICH</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercaptoetanol</td><td>ALDRICH</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>SIGMA</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein All Blue Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0373</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Acético, Glacial&nbsp;</td><td>Fisher Scietific</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>coomassie azul brillante&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>161-0406</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15N marcado con L-Tirosina</td><td>ALDRICH</td><td>332151</td><td></td></tr><tr><td>15N etiquetado con L-Lisina</td><td>ALDRICH</td><td>592900</td><td></td></tr><tr><td>L-fenilalanina sin marcar</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>13C6-Glucosa</td><td>ALDRICH</td><td>389374</td><td></td></tr><tr><td>2- desoxi-2-fluoro-l-fucosa&nbsp;</td><td>SANTA CRUZ Biotecnología</td><td>sc-283123</td><td></td></tr></tbody></table>

high yield la expresión de proteínas recombinantes humanos con la transfección transitoria de células hek293 en suspensión

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

El arte de la producción de proteínas recombinantes con complejas modificaciones post-traduccionales representa un desafío importante para los estudios de estructura y función. El rápido establecimiento y alta recuperación de las líneas de células de mamíferos transfectadas transitoriamente-aborda esta barrera y es un medio eficaz para la expresión de proteínas que se canalizan a través de la forma natural ER y Golgi vía secretora mediada. Aquí es un protocolo para la expresión de proteínas utilizando el HEK293F humana y líneas de células HEK293s transfectadas con un vector de expresión de mamífero diseñado para altos rendimientos de proteínas. La aplicabilidad de este sistema se demuestra mediante tres glicoproteínas representativos que expresaban con rendimientos entre 95 a 120 mg de proteína purificada recuperada por litro de cultivo. Estas proteínas son la FcRIIIa humana y la sialiltransferasa α2-6 rata, ST6GalI, ambos expresados ​​con una fusión GFP N-terminal, así como la inmunoglobulina humana no modificada G1 Fc. Este robusto sistema utilizes un medio libre de suero que es adaptable para la expresión de proteínas e hidratos de carbono para estudios estructurales utilizando espectrometría de masas y espectroscopia de resonancia magnética nuclear isotópicamente enriquecidos. Además, la composición de la N-glicano se puede ajustar mediante la adición de una molécula pequeña para evitar que ciertas modificaciones de glicano de una manera que no reduce el rendimiento.

La expresión de proteínas de alto nivel y la pureza Este sistema de expresión optimizado genera un alto rendimiento de proteínas glicosiladas. Un patrón típico se muestra en la expresión de IgG1-Fc (Figura 1). En este caso, Día 0 es el día de la transfección seguido por Día 1 (dilución) y días de cultivo subsiguientes hasta el día 5. La expresión de proteínas se analiza utilizando la fracción expresión soluble...

La producción a escala de laboratorio de proteínas eucariotas con la modificación postraduccional adecuada representa una barrera significativa. Este es un protocolo robusto con un rápido establecimiento y respuesta para la expresión de proteínas utilizando un sistema de expresión de mamíferos. Este sistema admite aminoácidos selectivos, marcaje selectivo de proteínas y moduladores de moléculas pequeñas de la composición de glicanos.

High Yield La expresión de proteínas recombinantes humanos con la transfección transitoria de células HEK293 en Suspensión

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

El objetivo general de este procedimiento es expresar glicoproteínas de mamífero con glicosilación adecuada de mamífero dirigiendo las proteínas recombinantes hacia la vía secretora del RE y el complejo de Golgi. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en inmunología, como cuál es el papel de una especificación, los patrones en la estructura y el potencial de activación inmune de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza células humanas para expresar proteínas humanas, lo que proporciona el entorno celular adecuado para plegar y modificar correctamente las proteínas diana.La incubadora agitadora para el establecimiento celular debe operarse a 135 RPM, 80% de humedad, 8% de dióxido de carbono y 37 grados Celsius, al menos una hora antes de la inoculación del cultivo. Encienda la lámpara UV de la cabina de seguridad biológica, caliente previamente los frascos sellados del medio A y del medio B en un baño de agua a 37 grados Celsius. Apague las luces UV y esterilice la cabina de seguridad biológica con una solución de etanol al 70% y agua.Esterilice un matraz de cultivo Erlenmeyer de 125 mililitros con tapa ventilada, pipetas, pipetadores y frascos de medio precalentado rociándolos con una solución de 70% de etanol en agua. Coloque estos elementos dentro de la cabina de seguridad biológica durante todo este procedimiento. Todos los elementos deben esterilizarse de esta manera antes de introducirlos en la cabina de seguridad biológica.Prepare medio de cultivo fresco para un cultivo de 30 mililitros extrayendo 26 mililitros del medio A y tres mililitros del medio B, y transfiera la mezcla al matraz erlenmeyer de 125 mililitros. Mezcle suavemente agitando. Caliente, en un baño de agua a 37 grados Celsius, un vial de células HEK 293F previamente congeladas a menos 80 grados Celsius hasta que comiencen a descongelarse parcialmente. Este proceso tarda aproximadamente un minuto y las células no deben descongelarse por completo.A continuación, esterilice el exterior del vial con la solución de etanol al 70% en agua y trasládalo a la cabina de seguridad biológica. Utilizando una pipeta de un mililitro, retire la suspensión celular y transfiera al matraz erlenmeyer de 125 mililitros que contiene 29 mililitros de medio de cultivo fresco. Cierre la tapa del frasco de cultivo y coloque el frasco en el agitador de incubación durante 24 horas.24 horas después de la inoculación del cultivo. Verifique la densidad celular, esterilice el matraz de cultivo con una solución de etanol al 70 % y agua, y colóquelo en la cabina de seguridad biológica. Utilizando una pipeta de un mililitro y un pipeteador, retire lentamente 100 microlitros del cultivo y transfiéralos a un tubo Eppendorf estéril de 0,5 mililitros.Cierre la tapa del frasco de cultivo y regrese el frasco al agitador de incubación lo más pronto posible. Mezcle 7,5 µL de una solución de azul de tripano con 7,5 µL de células. Agite vigorosamente y luego transfiera 7,5 µL de la mezcla a una lámina de conteo.Encienda el contador automático de células y coloque la lámina de conteo en la cámara de carga. El lector automático se activa y las células se cuentan automáticamente en unidades de número de células por mililitro y porcentaje de viabilidad. Determine el volumen de la cultura del donador necesario para transferirlo a un medio de cultivo fresco para obtener una densidad celular de 300 000 células viables por mililitro.Prepare el medio de cultivo fresco como se indicó previamente, transfiriendo 23 mililitros del medio A y tres mililitros del medio B a un matraz de cultivo nuevo de 125 mililitros. A continuación, retire los frascos almacenados del medio A y del medio B de la cabina de seguridad biológica para reducir el riesgo de contaminación. Recupere el matraz de cultivo celular HEK 293F del incubador.Rocíe con la solución de etanol al 70 % y agua y coloque el material en la cabina de seguridad biológica utilizando una pipeta nueva. Retire la alícuota correcta de células del cultivo y transfiérala al matraz que contiene medio de cultivo fresco. Transfiera ambos cultivos desde la cabina de seguridad biológica hasta el agitador de incubación.Cultive las células hasta alcanzar una densidad aproximada de dos a tres millones de células viables por mililitro antes de la transfección. Verifique la densidad celular como se demostró anteriormente y determine la cantidad de células necesaria para la transfección. Utilice una pipeta serológica estéril.Transfiera el volumen adecuado de la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 250 mililitros. Recopile las células mediante centrifugación a 100 ×g durante cinco minutos. Tras la esterilización, transfiera el tubo que contiene las células sedimentadas a la cabina de seguridad biológica.Utilice una pipeta estéril para decantar el sobrenadante, que consiste en medio de cultivo gastado. Resuspenda vigorosamente las células sedimentadas mediante pipeteo ascendente y descendente usando 10 mililitros de medio de cultivo fresco, y transfiera a un frasco preparado que contenga medio de cultivo para transfección fresco. Coloque la tapa del frasco de cultivo celular ventilado y incube el frasco en el agitador de incubación durante 15 minutos hasta una hora mientras las células están incubando.Diluya el ADN plasmídico y las soluciones stock de POLIETERAMINA o PEI utilizando medio de cultivo fresco hasta una concentración final de 0,5 microgramos por microlitro. Retire el frasco de cultivo con las células dispersas del agitador de incubación y llévelo a la cabina de seguridad biológica; utilice una micropipeta para añadir 300 microlitros de ADN plasmídico al cultivo y mezcle mediante agitación manual suave, luego añada 900 microlitros de PEI al cultivo y vuelva a mezclar. A continuación, añada 3,8 mililitros de medio de cultivo fresco.Transfiera el matraz al agitador de incubación durante 24 horas. Veinticuatro horas después de la transfección, el cultivo celular debe diluirse. Para preparar primero el medio de dilución, utilice una pipeta serológica estéril de un mililitro para extraer un mililitro de ácido valproico PRECALENTADO de 220 milimolar o VPA y transfiéralo a un tubo estéril de 50 mililitros.A continuación, utilice una pipeta serológica estéril para agregar cinco mililitros del medio B precalentado y 44 mililitros del medio A precalentado a la solución de VPA. Esto da como resultado 50 mililitros de medio de cultivo fresco con una concentración final de 4,4 milimolar de VPA. Retire el cultivo transfectado del incubador.Esterilice el exterior del matraz y coloque el matraz en la cabina de seguridad biológica. Añada el medio de dilución preparado al cultivo. Transfiera el matraz de vuelta al agitador de incubación durante cuatro o cinco días adicionales tras la transfección.Monitore la viabilidad celular diariamente mediante el procedimiento demostrado anteriormente. También se deben guardar alícuotas cada día para el análisis de expresión proteica, cinco o seis días después de la transfección o si la viabilidad celular desciende por debajo del 50 %. Recolecte las células mediante centrifugación de las células junto con el medio a 1000 × g durante cinco minutos. Recojan el sobrenadante que contendrá la proteína secretada y añadan cinco mililitros de una solución de lejía al 10 % al sedimento de células HEK y deséchelo como material biopeligroso.Posteriormente, la proteína se purifica a partir del sobrenadante recolectado. Este sistema de expresión generó un alto rendimiento de proteínas glicosiladas, ilustrado por este patrón típico de expresión de IgG uno fc tras la transfección transitoria de células HK 2 93 F. La purificación por afinidad utilizando una columna de proteína para IgG uno FC o una columna de níquel para GFP marcado con histidina con el receptor gamma tres A de la IgG dio como resultado proteínas con alta pureza.Este sistema expresó eficientemente IgG con enriquecimiento isotópico en un FC en este espectro de RMN bidimensional que correlaciona la frecuencia de resonancia de los núcleos de hidrógeno y el nitrógeno amídico directamente enlazado. Se observaron señales bien dispersas en átomos 15. Se produjeron diferentes formas glicósidas con células HEK 293 F y HEK 293 S bajo diferentes condiciones de cultivo, como se muestra mediante análisis de espectrometría de masas por desorción e ionización con láser asistida por matriz.IgG con un FC expresado a partir de células HEK 293, que albergaban glicanos de una forma con cinco anillos más dos residuos de N-acetilglucosamina, que no contenían glicanos con fucosa; los glicanos expresados a partir del material de células HEK 293F eran formas complejas biantenarias con fucosa en el núcleo y mayoritariamente con N-acetilglucosamina terminal, o una pequeña proporción de formas mono o diantenarias. La adición de un inhibidor de la glicosilación a una expresión llevada a cabo utilizando células HEK 293F mostró una reducción superior al 90 % en la incorporación de fucosa. Una vez dominado, el establecimiento de la transfección transitoria puede completarse en 1,5 horas el día uno y en 15 minutos el día dos. Tras un período de expresión de cuatro a seis días, la solución que contiene la proteína puede recolectarse en 15 minutos.Finalmente, la purificación de la proteína tomará aproximadamente 1,5 horas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener una cultura estable antes de la transfección, transfectar células en crecimiento activo y añadir el ADN antes de agregar PEI. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la caracterización funcional de proteínas mediante una variedad de técnicas biofísicas, con el fin de estudiar la estructura y función de la glicoproteína expresada tras su desarrollo.Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología exploraran la relación entre la estructura y la actividad de la IgG y la glicosilación in vitro e in vivo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar y purificar glicoproteínas utilizando nuestra combinación de células K 2 93 F y el vector PZ N dos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Estrategia de transfección optimizados para la expresión y el registro electrofisiológico de los canales iónicos recombinantes del voltaje en las células HEK-293T

En la era genómica post-humana, la disponibilidad de proteínas recombinantes en conformaciones nativas es crucial para la investigación estructural, funcional y terapéutico y el desarrollo. Aquí se describe una prueba a gran escala y sistema de expresión de proteínas en células embrionarias humanas de riñón 293T que se pueden utilizar para producir una variedad de proteínas recombinantes.

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Expresión de proteínas recombinantes para la Biología Estructural en HEK 293F Suspensión Células: Un enfoque novedoso y accesible

Describimos aquí un sistema de expresión de granzima rentable utilizando células HEK293T que produce altos rendimientos de proteasa pura, totalmente glicosilada y enzimáticamente activa.

Un alto rendimiento y sistema de expresión de costo-eficiente de granzimas humanos en células de mamífero

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Efficient Expresión células de mamíferos y Single-step La purificación de glicoproteínas extracelular para la cristalización

Este protocolo describe la producción de un anticuerpo terapéutico en un sistema de expresión de mamífero. Los métodos descritos incluyen la preparación del ADN del vector, transfección estable y la adaptación libre de suero de una línea celular de riñón embrionario humano 293, puesta en marcha de cultivos a gran escala y la purificación mediante cromatografía de afinidad.

Laboratorio de producción a gran escala y purificación de un anticuerpo terapéutico

El estudio de los canales iónicos a través de un sistema de expresión de forma heteróloga se ha convertido en una técnica básica en la investigación biomédica. En este manuscrito, se presenta un método eficiente de tiempo para conseguir la expresión del canal iónico fuertemente controlada mediante la realización de la transfección transitoria bajo el control de un promotor inducible.

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Nonlytic sistemas de expresión de células de insectos están infrautilizados para la producción, celular tráfico / localización, y el análisis funcional de proteínas recombinantes. A continuación, describimos métodos para generar vectores de expresión y la expresión de proteína transitoria posterior en líneas celulares de lepidópteros disponibles comercialmente. También se presenta la co-localización de las acuaporinas de Bemisia tabaci con proteínas marcadoras fluorescentes subcelulares.

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