High Yield La expresión de proteínas recombinantes humanos con la transfección transitoria de células HEK293 en Suspensión

La producción a escala de laboratorio de proteínas eucariotas con la modificación postraduccional adecuada representa una barrera significativa. Este es un protocolo robusto con un rápido establecimiento y respuesta para la expresión de proteínas utilizando un sistema de expresión de mamíferos. Este sistema admite aminoácidos selectivos, marcaje selectivo de proteínas y moduladores de moléculas pequeñas de la composición de glicanos.

El objetivo general de este procedimiento es expresar glicoproteínas de mamíferos con una glicosilación adecuada de mamíferos dirigiendo las proteínas recombinantes a la vía de secreción mediada por ER y GOGI. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en inmunología, como cuál es el papel de una especificación, los patrones en la estructura y el potencial de activación inmunitaria de los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpos. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza células humanas para expresar proteínas humanas, lo que proporciona el misionero celular adecuado para plegar y modificar correctamente las proteínas diana.

El agitador de la incubadora para el establecimiento de células debe funcionar a 135 RPM, 80% de humedad, 8% de dióxido de carbono y 37 grados Celsius al menos una hora antes de la inoculación del cultivo. Encienda la lámpara UV de la cabina de bioseguridad, precaliente las botellas selladas de medio A y medio B en un baño de agua a 37 grados centígrados. Apague las luces UV y esterilice la cabina de bioseguridad con una solución de etanol y agua al 70%.

Esterilice un matraz de crecimiento Erlenmeyer de 125 mililitros con pipetas con tapa ventilada, pipetas y botellas de medios precalentados rociando con una solución de etanol al 70% en agua. Coloque estos artículos en el gabinete de bioseguridad durante todo este procedimiento. Todos los artículos deben ser esterilizados de esta manera antes de ser llevados al gabinete de bioseguridad.

Prepare el medio de cultivo fresco para un cultivo de 30 mililitros extrayendo 26 mililitros de medio A y tres mililitros de medio B y transfiriéndolos al matraz Erlenmeyer de 125 mililitros. Mezcle agitando suavemente, tibio, un vial de pilas HEK 2 93 F previamente congeladas a menos 80 grados centígrados en un baño de agua a 37 grados centígrados para descongelar parcialmente las células. Esto tarda aproximadamente un minuto y las células no deben descongelarse por completo.

A continuación, esterilice el exterior del vial con la solución de etanol al 70% en agua y muévalo al gabinete de bioseguridad. Con una pipeta de un mililitro, retire la suspensión celular y transfiérala al matraz Erlenmeyer de 125 mililitros que contiene 29 mililitros de medio de cultivo fresco. Cierre la tapa del matraz de cultivo y colóquelo en el agitador de la incubadora durante 24 horas.

24 horas después de la inoculación del cultivo. Compruebe la densidad de las células, esterilice el matraz de cultivo con la solución de etanol al 70% y agua y muévalo al armario de bioseguridad. Con una pipeta y una pipeta de un mililitro, extraiga lentamente 100 microlitros del cultivo y transfiéralo a un tubo estéril de 0,5 mililitros de einor.

Cierre la tapa del matraz de cultivo y devuelva el matraz de cultivo al agitador de la incubadora lo antes posible. Mezcle 7,5 microlitros de una solución de azul de triano con 7,5 microlitros de células. Mezcle vigorosamente y luego transfiera 7,5 microlitros de la mezcla a un portaobjetos de conteo.

Encienda el contador automático de celdas y coloque la corredera de conteo en la cámara de carga. El lector automático se activa y las celdas se cuentan automáticamente en las unidades de número de celdas por mililitro y porcentaje de viabilidad. Determinar el volumen de cultivo donante necesario para la transferencia a un medio de cultivo fresco para obtener una densidad celular de 300.000 células vivas por mililitro.

Prepare el medio de cultivo fresco como se muestra anteriormente transfiriendo 23 mililitros de medio A y tres mililitros de medio B a un matraz de cultivo fresco de 125 mililitros. Después de eso, retire las botellas de stock de medio A y medio B del gabinete de bioseguridad para reducir el riesgo de su contaminación. Recupere el matraz de cultivo celular HEK 2 93 F de la incubadora.

Rocíelo con la solución de etanol y agua al 70% y colóquelo en la cabina de bioseguridad con una pipeta nueva. Extraiga la alícuota correcta de células del cultivo y transfiérala al matraz que contiene el cultivo fresco. Medio. Transfiera ambos cultivos de la cabina de bioseguridad al agitador de la incubadora.

Haga crecer las células a una densidad aproximada de dos a 3 millones de células vivas por mililitro antes de la transfección. Verifique la densidad de células como se demostró anteriormente y determine la cantidad de células para la transfección. Con una pipeta serológica estéril.

Transfiera el volumen apropiado de suspensión celular a un tubo de centrífuga de 250 mililitros. Recoja las células por centrifugación a 100 veces G durante cinco minutos. Después de la esterilización, transfiera el tubo que contiene las células peletizadas al gabinete de bioseguridad.

Utilice una pipeta estéril para decantar el sobrenadante que consiste en gastado. El medio de cultivo reenvía vigorosamente las células peletizadas pipeteando hacia arriba y hacia abajo con 10 mililitros de medio de cultivo fresco y transfiéralo a un matraz preparado que contiene cultivo de transfección fresco. Medio. Enrosque la tapa del matraz de cultivo celular ventilado e incube el matraz en el agitador de la incubadora durante 15 minutos a una hora mientras se incuban las células.

Diluir el ADN plasmático y las existencias de POLIETERAMINA o PEI utilizando un medio de cultivo fresco hasta una concentración final de 0,5 microgramos por microlitro. Retirar el matraz de cultivo con las células dispersas del agitador de la incubadora y llevarlo a la cabina de bioseguridad utilizando una micropipeta y 300 microlitros de ADN plasmático al cultivo y mezclar mediante una suave agitación manual a 900 microlitros de PEI al cultivo y mezclar de nuevo. Luego a 3,8 mililitros de medio de cultivo fresco.

Transfiera el matraz al agitador de la incubadora durante 24 horas. 24 horas después de la transfección, el cultivo celular debe diluirse. Para preparar primero el medio de dilución, utilice una pipeta serológica estéril de un mililitro para extraer un mililitro de ácido valproico o VPA PREWARM 220 milimolar y transferirlo a un tubo estéril de 50 mililitros.

A continuación, utilice una pipeta serológica estéril para añadir cinco mililitros de medio precalentado B y 44 mililitros de medio precalentado A a la solución de VPA. Esto da como resultado 50 mililitros de medio de cultivo fresco con una concentración final de 4,4 milimolares de VPA. Recupere el cultivo transfectado de la incubadora.

Esterilice el exterior del matraz y colóquelo en el armario de bioseguridad. Agregue el medio de dilución preparado al cultivo. Transfiera el matraz de nuevo al agitador de la incubadora durante cuatro o cinco días adicionales después de la transfección.

Monitoree la viabilidad de la célula diariamente mediante el procedimiento demostrado anteriormente. Las alícuotas también deben guardarse cada día para el análisis de la expresión de proteínas, cinco a seis días después de la transfección o si la viabilidad celular cae por debajo del 50%Coseche las células más el medio centrifugando las células más el medio a 1000 veces G durante cinco minutos. Recoja el sobrenadante que contendrá la proteína secretada a cinco mililitros de una solución de lejía al 10% en el gránulo de células HEK y deséchelo como riesgo biológico.

Posteriormente, la proteína se purifica a partir del sobrenadante recolectado. Este sistema de expresión generó un alto rendimiento de proteínas glicosiladas, ilustrado por este patrón de expresión típico de IgG un fc después de la transfección transitoria de células HK 2 93 F. La purificación por afinidad utilizando una columna de proteínas para IgG un FC o una columna de níquel para GFP marcada con histamina con el receptor gamma FC tres A dio como resultado proteínas de alta pureza.

Este sistema expresó eficientemente IgG enriquecida isotópicamente una FC en este espectro de RMN bidimensional que correlaciona la frecuencia de resonancia de los núcleos de hidrógeno y el nitrógeno amida enlazado directamente. Se observaron señales bien dispersas de 15 átomos. Se produjeron diferentes formas de glicosustancia con células HEK 2 93 F y HEK 2 93 s en diferentes condiciones de cultivo, como se muestra en los análisis de espectrometría de masas de ionización por dessorción láser asistida por matriz.

La IgG una FC expresada a partir de células HEK 2 93 s, albergadas y glicanos que eran de una forma con cinco anos más dos residuos de acetil glucosamina N que no contenían glicanos de glucosa FU del material expreso HEK 2 93 F eran formas complejas de tipo bi itinerario con glucosa FU central y en su mayoría tenían N acetilglucosamina terminal o una pequeña proporción de formas mono o dilatadas. La adición de un inhibidor de la glicanación a una expresión realizada con células HEK 2 93 F mostró una reducción superior al 90% en la incorporación de fuco. Una vez dominado, el establecimiento de la transfección transitoria puede completarse en 1,5 horas el primer día y 15 minutos el segundo día. Después de un período de expresión de cuatro a seis días, la solución que contiene la proteína se puede cosechar en 15 minutos.

Finalmente, la purificación de la proteína tomará aproximadamente 1.5 horas mientras se intenta este procedimiento, es importante recordar mantener un cultivo estable antes de la transfección, transfectar células en crecimiento activo y agregar ADN antes de agregar PEI. Siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la caracterización funcional de proteínas utilizando una variedad de técnicas biofísicas, para probar la estructura y función de la glicoproteína expresada después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología exploraran la relación estructura-actividad de la IgG y la glicosilación in vitro e in vivo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar y purificar glicoproteínas utilizando nuestra combinación de células K 2 93 F y el vector PZ N dos.