Usar secuencias de detención SecM como una herramienta para aislar Ribosome polipéptidos enlazados

El objetivo general de este procedimiento es aislar los complejos de cadena naciente o RNC unidos al ribosoma SEC TED 70 s producidos durante la traducción en un sistema libre de células in vitro. Esto se logra introduciendo primero una secuencia de estancamiento SEC M de 17 aminoácidos de largo en el extremo terminal C del gen de interés y clonándola aguas abajo del promotor transcripcional T 7. A continuación, el ARNm se transcribe mediante una reacción de transcripción in vitro y luego se purifica.

A continuación, el ARNm purificado se traduce en un sistema de extracto de E coli S 30 con aminoácidos radiactivos para marcar la proteína sintetizada o el polipéptido naciente. Finalmente, los dos complejos de cadena naciente unidos al ribosoma Mr.Ed se aíslan mediante sacarosa, gradiente, centrifugación y fraccionamiento. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran que las cadenas nacientes se unen de manera estable al ribosoma 70 s mediante análisis de electroforesis en gel de los polipéptidos marcados aislados de las fracciones de gradiente.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el uso de ARNm que carece de codón stock, es que asegura con alta eficiencia la unión de la cadena polipeptídica naciente al ribosoma 70 s durante la traducción y la posterior etapa de centrifugación. Además, a diferencia de la tecnología de cordón sin parada, este método se puede utilizar con casi la misma eficiencia tanto en el sistema in vitro como en el in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del plegamiento traslacional de proteínas, como qué tan temprano durante la traducción podrían formarse varios intermedios de plegamiento traslacional y, además, ayudar a analizar su estructura utilizando la estructura directa o indirecta.

Enfoques de sondeo y determinación Esta técnica puede ayudarnos a descifrar la vía de plegamiento de proteínas en el ribosoma. En este protocolo, hemos descrito el aislamiento de cadenas nacientes cristalinas bine gamma B de longitud completa unidas a ribosomas 70 s. Pero esta técnica se puede utilizar para el aislamiento de la enfermedad variada de prácticamente cualquier proteína de interés.

Esta estrategia también se puede adoptar para aislar las cadenas polipeptídicas de natina truncadas de la dermis Es. En general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades durante el paso de centrifugación en gradiente de sacarosa. Sin embargo, para la primera experiencia, esto no debería ser un problema. Decidimos utilizar la segunda secuencia de estancamiento para aislar polipéptidos nacientes cristalinos gamma B unidos a 70 como ribosoma después de intentos iniciales menos exitosos que involucraron el uso de ARNm sin cordón de parada.

La técnica posterior no pudo garantizar la estabilidad de las RNC durante las etapas posteriores de centrifugación con la misma eficiencia que la técnica que implica el uso de la secuencia de detención SECM. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos que involucran la preparación del gradiente y la separación de RNC pueden ser difíciles de aprender y requieren cierto nivel de experiencia para garantizar resultados reproducibles. La demostración de la postura estará a cargo de un estudiante graduado de mi laboratorio para llevar a cabo la transcripción y traducción in vitro. Comience con un gen de interés que se clona en cualquier plásmido basado en T seven o SP six para generar complejos de cadena naciente de ribosomas o RNC.

Extienda el extremo C del polipéptido objetivo agregando la secuencia inductora de detención de M para garantizar que el fragmento de polipéptido salga del túnel ribosómico. Agregue un enlazador rico en glicina siria flexible entre la proteína y la secuencia de detención SEC M para prepararse para la transcripción in vitro, enzima de restricción del usuario que cortará aguas abajo del marco de lectura abierto para linealizar el ADN molde ejecute la electroforesis en gel AROS para verificar la digestión completa de la muestra. Después de verificar la concentración óptima de ADN, utilice un kit de transcripción de alto rendimiento de acuerdo con las instrucciones del fabricante para sintetizar ARN mensajero.

Utilice la precipitación de cloruro de litio para purificar el ARNm. A continuación, pase una muestra en un gel de acrilamida o aros para verificar su pureza. Para traducción in vitro.

Usando un sistema de E. coli en agua libre de nucleasas, agregue una mezcla de aminoácidos de un milimolar menos metionina, 10 unidades de inhibidor de la ribonucleasa, 20, microcuries de 35 s de metionina, 20 microlitros de mezcla de reacción, 24 microlitros de tampón de reconstitución y 24 microlitros de E. coli. Lisado. Precalienta la reacción incubándola a 30 grados centígrados durante cinco minutos. Luego agregue uno o dos microgramos de ARNm e incube durante 10 a 15 minutos adicionales a 30 grados centígrados.

Detenga la reacción colocándolo en hielo para aislar los complejos de cadena naciente unidos a ribosomas o ncs de 70 s. Coloque la reacción de traslación sobre 4,5 mililitros de un gradiente de sacarosa de cinco a 30% en montones de 20 milimolares. Hidróxido de potasio pH 7.5 15 milimolar de magnesio, 100 milimolares de acetato de potasio y un milimolar centrífuga DTT a 41, 000 RPM durante dos horas a cuatro grados Celsius después de la centrifugación, fraccionar el gradiente de sacarosa utilizando un sistema de gradiente de densidad programable y un detector de absorbancia establecido en 254 nanómetros.

Recoja las fracciones que contienen ribosomas 70 s para un análisis posterior para determinar si la proteína extendida SEC M permanece unida al ribosoma 70 s. Precipitar la proteína en cada fracción de gradiente mediante la adición de ácido tricloroacético. Incubar las muestras durante la noche a cuatro grados centígrados al día siguiente, centrifugar las muestras a 14.000 veces G durante 15 minutos para granular la proteína, lavar los gránulos en una proporción de cuatro a uno de acetona por un tris milimolar, HCL pH 7,6.

Seque los gránulos al aire y, a continuación, vuelva a suspenderlos en el búfer de carga de páginas SDS. Resuelva las muestras con la página Tris Trice SDS, luego fije y seque los geles y sométalos a autorradiografía e imágenes de fosfograma como se muestra aquí. Después de la traducción in vitro, los ribosomas 70 S se aislaron mediante sacarosa, gradiente, centrifugación y fraccionamiento para garantizar que la proteína cristalina gamma B permanezca unida de manera estable al ribosoma.

Las fracciones contenedoras de los 70 s se agruparon, se intercambiaron tampones desalados y se sometieron a una ronda adicional de centrifugación en gradiente de sacarosa. Los resultados presentados aquí sugieren que SEC M puede inducir eficientemente la detención traduccional de las RNC cristalinas gamma B. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en un día hábil con la excepción del análisis de electroforesis en gel de la cadena naciente, que generalmente implica un paso de precipitación de TCA durante la noche.

Al intentar este procedimiento, es obviamente fundamental evitar la contaminación de ARN en cualquier paso. La contaminación por RNS puede afectar la eficiencia traduccional del extracto y conducir a la liberación de polipéptido naciente del ribosoma 70. Siguiendo este procedimiento, se puede obtener NAST y polipéptidos de lanxess predeterminados unidos de manera estable al ribosoma 70 dependiendo del objetivo final.

Estos complejos se pueden utilizar para diversos fines, como la determinación de la confirmación de las cadenas nacientes unidas a los ribosomas, utilizando enfoques directos e indirectos como RMN o fre, o la unión del factor de prueba y el ligando después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología estructural y el plegamiento de proteínas exploraran la confirmación de proteínas de longitud completa unidas a un ribosoma, así como de intermediarios de plegamiento traslacional. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar y aislar el polipéptido naciente, unido de manera estable al ribosoma 70 s, que se puede usar más para responder a varias preguntas en el campo del plegamiento de proteínas traslacionales.

No olvide que trabajar con isótopos radiactivos y ácidos amina marcados, como, por ejemplo, la metionina A 35 requiere precauciones especiales y siempre debe tenerse en cuenta al realizar este procedimiento.