Name: Usar secuencias de detención SecM como una herramienta para aislar Ribosome polipéptidos enlazados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Aprende a aislar complejos ribosoma-cadena naciente usando la secuencia SecM en E. coli. Este método permite estudiar la elongación de la traducción y el plegamiento de proteínas in vitro.

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Este trabajo fue financiado por el Programa de Ciencias Humanas de subvención RGP0024 Frontera.

1. Preparación del ADN de plantilla y la transcripción in vitro <ol><li> El gen de interés se clona en cualquier T7 y / o, por ejemplo promotor SP6 basado plásmido. Para obtener RNC de interés, C-terminal de la meta de polipéptido se extiende mediante la adición de secuencia detención inductor de SecM FXXXXWIXXXXGIRAGP 7. Con el fin de asegurar que el fragmento de polipéptido de interés fluirá hacia fuera del túnel ribosómico, la parte C-terminal de la proteína diana tiene que extenderse por lo menos 30 aminoácidos 12-14. Un flexible glicina-serina enlazador rica puede introducirse entre la proteína y la secuencia de detención SecM para evitar cualquier restricciones conformacionales posibles. </li><li> Para la transcripción in vitro, el ADN plantilla debería ser linealizado con la enzima de restricción de corte aguas abajo de la ORF. Uno tiene que verificar linealización completa del ADN de plásmido mediante la ejecución del producto de digestión de restricción en la electroforesis en gel de agarosa. </li><li> El plasma linealizadoIdentificación se utiliza además para reacción de transcripción in vitro. Diferentes concentraciones de ADN molde se puede analizar para determinar las concentraciones de ADN óptima requerida para la transcripción in vitro. Por lo general, con Megascript Kit de alta Ambion de transcripción rendimiento (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY), 1 mg de ADN linearizado produce ARNm 40-60 g. En la transcripción in vitro se realiza siguiendo las instrucciones del fabricante (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY) . </li><li> Tras la transcripción in vitro, el ARNm se purifica por precipitación de cloruro de litio de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Megascript Kit de alta Ambion de transcripción rendimiento, Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY). </li><li> integridad ARNm se ve verificada por electroforesis utilizando acrilamida o geles de agarosa. </li></ol> 2. Traducción in vitro Para la traducción in vitro utilizando la estrategia en tiempo real de E. coli 100 HY Kit (5 Prime, Gaithersburg, MD), siga los siguientes pasos: <ol><li> Preparar 100 l de instrucción de la traducción in vitro fabricante de la reacción siguiente. En pocas palabras, en agua libre de nucleasa añadir 24 l mezcla de aminoácidos menos metionina (1 mM), 10 unidades de inhibidor de la ribonucleasa (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), 20 Ci de los desechos radiactivos [35 S] MP Biomedicals-metionina (, Solon, OH), 20 l mezcla de reacción, 24 tampón Reconstitución l y 24 l de E. E. lisado. </li><li> Incubar la reacción a 30 ° C durante 5 min para pre tibia la reacción de traducción. Añadir 1-2 g de ARNm para la reacción de traducción y se incuba a 30 ° C durante 10-15 minutos. </li><li> Se detiene la reacción mediante la colocación de la reacción de traducción en hielo. </li></ol> 3. Aislamiento de polipéptido naciente de reacción de traducción in vitro <ol><li> Para aislar RNC, la reacción de traducción se coloca sobre la parte superior de 4,5 ml de gradiente 5-30% de sacarosa en 20 mM de HEPES-KOH pH 70,5, 15 mM de MgCl 2, 100 mM de acetato de potasio, DTT 1 mM y se centrifugó utilizando Beckman Coulter SW55-Ti rotor a 41.000 rpm, 4 ° C durante 2 horas. </li><li> Tras la centrifugación, el gradiente de sacarosa se fracciona para aislar diferentes poblaciones ribosomal y asociados cadenas nacientes. La separación se controla mediante el sistema de la CIUO programable, con gradiente de densidad de grabación continua a 254 nm utilizando un detector de la CIUO UA-6 absorbancia. </li><li> La fracción (s) que contiene 70 ribosomas se recogen y analizan más dependiendo de la finalidad del experimento. </li></ol> 4. La observación de proteína unida a ribosoma con Tris-tricina SDS-PAGE Para comprobar, si la proteína extendida SecM permanece unida al ribosoma 70S, las fracciones del gradiente se recogieron y se trataron como sigue: <ol><li> La proteína en cada fracción se precipita por adición de ácido tricloroacético (TCA) a una concentración final de 10% y se incubaron a 4 ° C overniGHT. </li><li> Después de la incubación durante la noche, las muestras se centrifugaron a 14.000 X g durante 15 minutos para sedimentar la proteína. Después de la centrifugación el sobrenadante se eliminó y el sedimento se lavó dos veces con acetona solución que contiene: 1 mM Tris-HCl pH 7,6 (04:01). Pellet era aire más seca y se disuelve en tampón de carga de SDS-PAGE. </li><li> La muestra tratada se resolvió y se analizaron por Tris-tricina SDS-PAGE. </li><li> Después de la electroforesis, los geles se fijaron, se secó al vacío utilizando gel de tintorero y se sometió a autorradiografía. La distribución de los polipéptidos nacientes se observaron utilizando phosphoimaging. </li></ol> 5. Los resultados representativos Aquí presentamos un experimento que describe el aislamiento de la longitud completa de bovino gamma-B Cristalina establemente unido a ribosoma 70S. La Figura 1 muestra los pasos implicados en el aislamiento de las especies bovina B gamma-RNC cristalinas. El C-terminal de la Cristalina gamma-B se extiende en general por 32 aminoácidos to asegurar que las extrusiones proteína de longitud completa fuera del túnel ribosomal, lo que también incluye la secuencia SecM estancamiento colocado en la misma C-terminal del polipéptido de fusión. Después de la traducción in vitro, los ribosomas 70S se aislaron por centrifugación en gradiente de sacarosa (Figura 2.1). Con el fin de asegurar que la proteína se mantiene establemente unido al ribosoma, 70S que contienen fracciones se agruparon, tampón desalado, intercambio y se sometió a una ronda adicional de centrifugación en gradiente de sacarosa (Figura 2.2). El resultado presentado en la figura 2 indica claramente que SecM de manera eficiente puede inducir la detención de traslación de las RNC B Gamma-cristalina. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4027/4027fig1.jpg" /> Figura 1. Explicación esquemática de los pasos implicados en el aislamiento de RNC. C-terminal de bovino gamma-B Cristalina se extendió por 32 secuencia de aminoácidos. Esto se extendíaC-terminal de las regiones también incluye la secuencia de detención SecM. Gamma-B Cristalina con la secuencia se clonó en SecM Pivex 2,3 (T7 basado) plásmido. Para la transcripción in vitro del ADN molde se linealizó por digestión con XbaI. Plantilla linealizado fue utilizado además para la transcripción in vitro. El T7 en la plantilla de ADN es reconocida por la RNA polimerasa T7 que transcribe las aguas abajo gamma-B de genes localizados Cristalina del promotor T7. ARNm se purificó utilizando cloruro de litio método de precipitación. El mRNA purificado se utiliza entonces para la traducción in vitro. Después de la incubación, la reacción de traducción se estratificó en la parte superior del gradiente de 5-30% de sacarosa y se centrifuga en Beckman Coulter SW55-Ti rotor a 41.000 rpm, 4 ° C durante 2 horas. <spuna clase = &quot;pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4027/4027fig2.jpg" /> Figura 2. El aislamiento de las especies bovina Gamma-B Cristalina RNC establemente unido al ribosoma 70S. 1 mRNA g se mezcló en la reacción de 100 l E. E. Sistema de extracto S30 tal como se menciona en la sección de protocolo con 20 Ci [35 S]-metionina y se incubaron a 30 ° C durante 15 min. Después de la incubación, la reacción de traducción se estratificó en la parte superior del gradiente de 5-30% de sacarosa en 20 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, 15 mM de MgCl 2, 100 mM de acetato de potasio, DTT 1 mM y se centrifugó en Beckman Coulter SW55-Ti rotor a 41.000 rpm, 4 ° C durante 2 horas. Tras la sedimentación velocidad, el gradiente se descargó y el ribosoma Le Pro se obtuvo. Los datos fueron registrados por el programa PeakTrak (gradiente CIUO gradiente de densidad sistema de fraccionamiento). Se recogieron las fracciones, la proteína fue TCA precipitó y se resolvieron en T 16,5%, 6% de C Tris-Tricina PAGE gel 15. El gel se seca y se expone a autorradiografía. Tras la exposición del gel fue escaneada con Typhoon 9410 escáner de imágenes. La figura 2.1 muestra que la longitud completa de Gamma-B Cristalina está presente en las fracciones 70S del ribosoma. Por lo tanto, la secuencia SecM estancamiento permite el aislamiento de las especies bovina estables B Gamma-RNC cristalinas. Los datos de la Figura 2.2 indican claramente que los RNC aislados son de hecho estable. En el presente experimento las fracciones 70S después de la primera ronda de centrifugación en gradiente de sacarosa se agruparon y la sacarosa se eliminó utilizando Amicon Ultra-4 Unidad centrífuga filtro (Millipore), seguido por tampón de cambio en solución que contenía 20 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, 15 mM MgCl 2, 100 mM de acetato de potasio, 1 mM DTT. Esta muestra fue sometida además a una ronda adicional de centrifugación a través de gradiente 5-30% de sacarosa y se fraccionó. Cada fracción fue tratada y analizada como en la Figura 2.1.

<ol><li>Fedorov, A. N., Baldwin, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cotranslational protein folding.</a> J. Biol. Chem. 272, 32715-32718 (1997).</li>
<li>Hardesty, B., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+a+nascent+peptide+on+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Nucleic+Acid+Res.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Folding of a nascent peptide on the ribosome.</a> Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).</li>
<li>Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+as+a+platform+for+co-translational+processing%2C+folding+and+targeting+of+newly+synthesized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 589-597 (2009).</li>
<li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li>
<li>Cabrita, L. D., Dobson, C. M., Christodoulou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+on+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein folding on the ribosome.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 33-45 (2010).</li>
<li>Oliver, D., Norman, J., Sarker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Escherichia+coli+secA+by+cellular+protein+secretion+proficiency+requires+an+intact+gene+X+signal+sequence+and+an+active+translocon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Regulation of Escherichia coli secA by cellular protein secretion proficiency requires an intact gene X signal sequence and an active translocon.</a> J. Bacteriol. 180, 5240-5242 (1998).</li>
<li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosomal+exit+tunnel+functions+as+a+discriminating+gate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate.</a> Cell. 108, 629-636 (2002).</li>
<li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+monitor%2C+SecM%2C+undergoes+self-translation+arrest+in+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Secretion monitor, SecM, undergoes self-translation arrest in the cytosol.</a> Mol. Cell. 7, 185-192 Forthcoming.</li>
<li>Muto, H., Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+but+non+polypeptide+prolyl-tRNA+functions+in+the+A+site+for+SecM-mediated+ribosomal+stall%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded but non polypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall.</a> Mol. Cell. 22, 545-552 (2006).</li>
<li>Cabrita, L. D., Hsu, S. T., Launay, H., Dobson, C. M., Christodoulou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+ribosome-nascent+chain+complexes+produced+in+vivo+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22239-22244 (2009).</li>
<li>Eichmann, C., Preissler, S., Riek, R., Deuerling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+structure+acquisition+of+nascent+polypeptides+monitored+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Cotranslational structure acquisition of nascent polypeptides monitored by NMR spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 9111-9116 (2010).</li>
<li>Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+activity+of+the+ribosome-bound+nascent+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide.</a> FEBS Lett. 378, 166-170 (1996).</li>
<li>Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+atomic+structure+of+the+large+ribosomal+subunit+at+2.4+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution.</a> Science. 289, 905-920 (2000).</li>
<li>Voss, N. R., Gerstein, M., Steitz, T. A., Moore, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+geometry+of+the+ribosomal+polypeptide+exit+tunnel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel.</a> J. Mol. Biol. 360, 893-906 (2006).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li>
<li>Komar, A. A., Kommer, A., Krasheninnikov, I. A., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+folding+of+globin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cotranslational folding of globin.</a> J. Biol. Chem. 272, 10646-10651 (1997).</li>
<li>Keiler, K. C., Waller, P. R., Sauer, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+a+peptide+tagging+system+in+degradation+of+proteins+synthesized+from+damaged+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA.</a> Science. 271, 990-993 (1996).</li>
<li>Evans, M. S., Ugrinov, K. G., Frese, M. A., Clark, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+stalled+ribosome+nascent+chain+complexes+produced+in+vivo+or+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro.</a> Nat. Methods. 2, 757-762 (2005).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Para obtener resultados reproducibles, la calidad y la concentración de los componentes utilizados para la transcripción y traducción in vitro son críticos. Hemos utilizado comercialmente disponible la transcripción in vitro y los extractos de traducción y que dan resultados eficaces y reproducibles, si se maneja con cuidado. Calidad de ARNm pueden afectar a la traducción, por lo que es de suma importancia para probar la integridad del ARNm antes de usarla para traducción in ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / Kit </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Megascript T7 Kit de Transcripción de alta rentabilidad </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> RTS 100 Kit de E. coli HY </td><td> 5 Prime </td><td> 2401100 </td></tr><tr><td> Inhibidor de ribonucleasa </td><td> Invitrogen </td><td> 15518012 </td></tr><tr><td> Trans [35 S]-Label </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0151006 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-4 Unidad de filtro centrífugo </td><td> Millipore </td><td> UFC801008 </td></tr><tr><td> De almacenamiento de fósforo autorradiografía </td><td> GE Healthcare </td><td> El tifón 9410 Imager modo variable </td></tr><tr><td> Los sistemas de gradiente de densidad de fraccionamiento </td><td> Teledyne Isco, Inc. </td><td> CIUO Densidad programable sistema de gradiente </td></tr><tr><td> Gradiente de sacarosa Centrifugation </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optima L-90 K Preparativo Ultracentrífuga </td></tr></tbody></table>

usar secuencias de detención secm como una herramienta para aislar ribosome polipéptidos enlazados

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Una amplia investigación ha proporcionado evidencias que sugieren que la proteína de amplios plegado en la célula es un proceso de co-traduccional 1-5. Sin embargo, el camino exacto que sigue la cadena polipeptídica durante la co-translacional de plegado para alcanzar su forma funcional es todavía un enigma. A fin de comprender este proceso y para determinar la conformación exacta de los compuestos intermedios plegables co-traduccionales, es esencial para desarrollar técnicas que permiten el aislamiento de RNC que transportan las cadenas nacientes de tamaños predeterminados para permitir su análisis estructural adicional. SecM (monitor de secreción) es una E. 170 aminoácidos E. proteína que regula la expresión de la corriente abajo Seca (secreción de conducción) ATPasa en el operón SECM-seca 6. Nakatogawa e Ito originalmente encontrado que una secuencia de 17 aminoácidos de largo (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166) en la región C-terminal de la proteína SecM es suficiente y necesaria paraoriginar la detención de la elongación en el SecM Gly165, produciendo de esta manera peptidil-tRNA-glicil estable vinculado a la P-ribosomal sitio de 7-9. Más importante aún, se encontró que esta secuencia de 17 amino ácido larga se pueden fusionar a la C-terminal de virtualmente cualquier proteína de longitud completa y / o truncado permitiendo así la producción de RNC llevan cadenas nacientes de tamaños predeterminados 7. Así, cuando se fusiona o se inserta en la proteína diana, la secuencia SecM estancamiento produce detención de la elongación de la cadena polipeptídica y genera RNC estables tanto in vivo en E. células de E. e in vitro en un sistema libre de células. Centrifugación en gradiente de sacarosa se utiliza además para aislar RNC. Los RNC aisladas pueden ser utilizados para analizar las características estructurales y funcionales de los compuestos intermedios plegables co-traduccionales. Recientemente, esta técnica se ha utilizado con éxito para obtener información sobre la estructura de los ribosomas varias cadenas unidas nacientes 10,11. Aquí se describe el aislamiento de las especies bovina Gamma-B Cristalina RNC fusionado a SecM y generada en un sistema de traducción in vitro.

Se describe aquí una técnica que ahora se utilizan habitualmente para aislar de forma estable consolidados complejos ribosoma cadena naciente (RNC). Esta técnica aprovecha el descubrimiento de que un joven de 17 aminoácidos de longitud SecM &quot;secuencia de la detención&quot; puede detener la elongación de la traducción en un procariota (<em&gt; E. E.</em&gt;) Del sistema, cuando se inserta en (o fusionado al extremo C-terminal) de virtualmente cualquier proteína.

Usar secuencias de detención SecM como una herramienta para aislar Ribosome polipéptidos enlazados

Investigaciones exhaustivas han proporcionado amplias evidencias que sugieren que el plegamiento de proteínas en la célula es un proceso cotraduccional1-5. Sin embargo, la vía exacta...

El objetivo general de este procedimiento es aislar complejos de ribosomas unidos a cadenas nacientes, o RNCs, asociados al SEC TED 70 s, producidos durante la traducción en un sistema libre de células in vitro. Esto se logra primero introduciendo una secuencia de retención SEC M de 17 aminoácidos de longitud en el extremo C-terminal del gen de interés y clonándolo aguas abajo del promotor transcripcional T siete. A continuación, el ARNm se transcribe mediante una reacción de transcripción in vitro y luego se purifica.Luego, el ARNm purificado se traduce en un sistema de extracto de E. coli S30 con aminoácidos radiactivos para marcar la proteína sintetizada o la cadena polipeptídica en crecimiento. Finalmente, los complejos de cadenas en crecimiento unidos a los segundos ribosomas Mr.Ed se aíslan mediante centrifugación en gradiente de sacarosa y fraccionamiento. En última instancia, se pueden obtener resultados que demuestran que las cadenas en crecimiento están establemente unidas al ribosoma 70S mediante análisis por electroforesis en gel de los polipéptidos marcados aislados de las fracciones del gradiente.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como el uso de ARNm que carece de codón de terminación, es que garantiza con alta eficiencia la unión de la cadena polipeptídica naciente al ribosoma 70 S durante la traducción y el paso subsiguiente de centrifugación. Además, en contraste con la tecnología de no-stop codón, este método puede utilizarse con eficiencia casi igual tanto en sistemas in vitro como in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del plegamiento proteico traduccional, como la formación de diversos intermediarios de plegamiento traduccional en las primeras etapas de la traducción, y además contribuir al análisis de su estructura mediante métodos estructurales directos o indirectos.Enfoques de sondeo y determinación Esta técnica puede ayudarnos a descifrar la vía del plegamiento proteico en el ribosoma. En este protocolo, hemos descrito el aislamiento de cadenas nacientes de cristalina bina gamma B unidas a ribosomas 70 s de longitud completa. Sin embargo, esta técnica puede utilizarse para el aislamiento de diversas enfermedades de prácticamente cualquier proteína de interés.Esta estrategia también puede adoptarse para aislar cadenas polipeptídicas natin truncadas del derm Es. Generalmente, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades durante el paso de centrifugación en gradiente de sacarosa. Sin embargo, para quienes tienen experiencia, esto no debería ser un problema. Decidimos utilizar una segunda secuencia de detención para aislar los polipéptidos nacientes de cristalina gamma B unidos al ribosoma 70S tras intentos iniciales menos exitosos que implicaban el uso de ARNm sin codón de paro.La técnica posterior no pudo garantizar la estabilidad de los RNC durante los pasos subsiguientes de centrifugación con la misma eficiencia que la técnica que implica el uso de la secuencia de arresto SECM. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos que involucran la preparación del gradiente y la separación de los RNC pueden ser difíciles de aprender y requieren un determinado nivel de experiencia para asegurar resultados reproducibles. La demostración del procedimiento la realizará un estudiante de posgrado de mi laboratorio para llevar a cabo la transcripción y traducción in vitro. Comience con un gen de interés clonado en cualquier plásmido basado en T siete y/o SP seis para generar complejos ribosoma-cadena naciente o RNC.Extienda el extremo C del polipéptido diana añadiendo la secuencia inductora de arresto de M para asegurar que el fragmento del polipéptido saldrá al exterior del túnel ribosómico. Añada un enlazador flexible rico en glicina y serina entre la proteína y la secuencia de arresto SEC M para preparar la transcripción in vitro; utilice una enzima de restricción que corte aguas abajo del marco de lectura abierto para linealizar el ADN molde y realice una electroforesis en gel AROS para verificar la digestión completa de la muestra. Tras verificar la concentración óptima de ADN, utilice un kit de transcripción de alto rendimiento según las instrucciones del fabricante para sintetizar el ARN mensajero.Utilice la precipitación con cloruro de litio para purificar el ARNm. Luego, analice una muestra en un gel de acrilamida o aros para verificar su pureza. Para la traducción in vitro.Utilizando un sistema de e coli en agua libre de nucleasas, agregue una mezcla de aminoácidos de un milimolar, menos metionina, 10 unidades de inhibidor de ribonucleasa, 20 microcurios de 35 s metionina, 20 microlitros de mezcla de reacción, 24 microlitros de tampón de reconstitución y 24 microlitros de lisado de e coli. Precaliente la reacción incubándola a 30 grados Celsius durante cinco minutos. Luego, agregue uno a dos microgramos de ARNm e incube durante 10 a 15 minutos adicionales a 30 grados Celsius.Detenga la reacción colocándola en hielo para aislar complejos de cadena en crecimiento unidos al ribosoma 70 s o ncs. Coloque la reacción de traducción encima de 4,5 mililitros de un gradiente de sacarosa del 5 al 30 % en 20 milimolar de HEPES, hidróxido de potasio pH 7,5, 15 milimolar de magnesio, 100 milimolar de acetato de potasio y 1 milimolar de DTT. Centrifugue a 41 000 RPM durante dos horas a cuatro grados Celsius. Tras la centrifugación, fraccione el gradiente de sacarosa utilizando un sistema programable de gradientes de densidad y un detector de absorbancia ajustado a 254 nanómetros.Recolecte las fracciones que contienen ribosomas 70 s para su análisis posterior y determinar si la proteína extendida SEC M permanece unida al ribosoma 70 s. Precipite la proteína en cada fracción del gradiente añadiendo ácido tricloroacético. Incube las muestras durante la noche a cuatro grados Celsius; al día siguiente, centrifugue las muestras a 14.000 veces G durante 15 minutos para formar el pellet proteico, y lave los pellets en una proporción de cuatro partes de acetona por una parte de tris milimolar, HCl pH 7,6.Seque las pastillas al aire, luego resuspenda en tampón de carga para electroforesis SDS-PAGE. Separe las muestras mediante electroforesis SDS-PAGE en gel de tris-tricína, a continuación fije y seque los geles y expóngalos a autorradiografía e imagen de fosfo como se muestra aquí. Tras la traducción in vitro, los ribosomas 70 S se aislaron mediante centrifugación en gradiente de sacarosa y fraccionamiento para asegurar que la proteína cristalina gamma B permanezca establemente unida al ribosoma.Las fracciones que contenían part&iacute;culas de 70 s fueron agrupadas, se intercambi&oacute; el tamp&oacute;n mediante desalinizaci&oacute;n y se sometieron a una ronda adicional de centrifugaci&oacute;n en gradiente de sacarosa. Los resultados aqu&iacute; presentados sugieren que SEC M puede inducir eficientemente la parada traduccional de los RNCs de gamma B cristalina. Una vez dominada, esta t&eacute;cnica puede realizarse en un d&iacute;a laborable, con la excepci&oacute;n del an&aacute;lisis mediante electroforesis en gel de la cadena naciente, que normalmente incluye un paso de precipitaci&oacute;n con &aacute;cido tricloroac&eacute;tico que requiere incubaci&oacute;n nocturna.Si bien se intenta este procedimiento, es obviamente crítico evitar la contaminación por ARN en cualquier paso. La contaminación por ARN puede afectar la eficiencia traduccional del extracto y provocar la liberación del polipéptido naciente del ribosoma 70S. Tras seguir este procedimiento, se pueden obtener NAST y polipéptidos de longitud predeterminada unidos de forma estable al ribosoma 70S, dependiendo del objetivo final.Estos complejos pueden utilizarse para diversos fines, como la determinación de la conformación de cadenas nacientes unidas al ribosoma mediante enfoques directos e indirectos, como RMN o FRET, o para probar la unión de factores y ligandos tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología estructural y el plegamiento de proteínas exploraran la conformación de proteínas completas unidas al ribosoma, así como los intermediarios del plegamiento co-translationales. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo preparar y aislar polipéptidos nacientes unidos de forma estable al ribosoma 70S, los cuales pueden utilizarse posteriormente para responder diversas preguntas en el campo del plegamiento proteico traduccional.No olvide que trabajar con isótopos radiactivos y aminoácidos marcados, como, por ejemplo, metionina A 35, requiere precauciones especiales y siempre debe tenerse en cuenta al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este artículo se describe un protocolo para la extracción de la traducción de los ribosomas de las células eucariotas. Una vez extraído, ribosomas están separados en monosomes y polirribosomas por fraccionamiento en gradiente de sacarosa para permitir que las diferentes poblaciones de ribosomas para ser analizados. Por lo tanto, este método es el estándar de oro para el examen de la regulación de la traducción.

Análisis eucariotas perfil Polyribosome

Un obstáculo importante para los análisis bioquímicos de los ribosomas que contienen naciente peptidil-ARNt ha sido la presencia de los ribosomas otros en las mismas muestras, los ribosomas no participan en la traducción de la secuencia del ARNm específico que se analiza. Hemos desarrollado una metodología sencilla para purificar, exclusivamente, los ribosomas que contiene la naciente peptidil-tRNA de interés.

El aislamiento de los ribosomas traducir contienen peptidil-ARNt para el Análisis Funcional y Estructural

Una técnica para identificar sitios traduccionales pausa en ARNm se describe. Este procedimiento se basa en el aislamiento de polipéptidos nacientes acumulan en los ribosomas durante la traducción in vitro de un ARNm diana, seguido por el análisis del tamaño de las cadenas nacientes utilizando una electroforesis en gel de desnaturalización.

El aislamiento de los ribosomas polipéptidos nacientes Bound<em&gt; In vitro</em&gt; Para la identificación de sitios de traslación pausa a lo largo del ARNm

La purificación por afinidad de las proteínas etiquetadas en combinación con espectrometría de masas (APMS) es un potente método para la asignación sistemática de las redes de interacción de proteínas y para la investigación de la base mecánica de los procesos biológicos. A continuación, se describe un péptido secuencial optimizado afinidad (SPA) APMS procedimiento desarrollado por la...

Identificación de los complejos de proteínas en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem

Este protocolo ilustra modificaciones esenciales de fraccionamiento polyribosome con el fin de estudiar la translatome in vivo de muestras del SNC. Permite la evaluación global de la traducción y transcripción de regulación a través del aislamiento y la comparación de ARN total a ribosoma ARN fracciones unidas.

En Interrogatorio vivo del Sistema Nervioso Central Translatome por Polyribosome Fraccionamiento

Los ribosomas desempeñan un papel central en la síntesis de proteínas. Polyribosome (polisomas) fraccionamiento por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa permite la determinación directa de la eficiencia de traducción de los ARNm individuales en un genoma de gran escala. Además, este método se puede utilizar para el análisis bioquímico de ribosoma y factores de polisomas asociados tales como chaperones y moléculas de señalización.

Polisoma Fraccionamiento y análisis de los mamíferos Translatomes en un genoma de gran escala

Se describe un procedimiento de aislamiento de RNA tándem (viaje) para la recuperación de complejos proteicos de ARNm endógeno formado. Específicamente, complejos RNA-proteína son reticulado en vivo, cofia RNAs son aislados de los extractos con los granos oligo(dT) y particular mRNAs son capturados con oligonucleótidos antisentido de RNA modificados. Proteínas a mRNAs son detectadas por el análisis de immunoblot.

Un procedimiento de aislamiento de RNA tándem basada en oligonucleótidos recuperar complejos eucariotas ARNm-proteína

Aquí se describen las etapas de la recolección de muestras y la preparación de RIBO-seq en bacterias. La secuenciación de las bibliotecas preparadas de acuerdo con estas directrices da como resultado datos suficientes para un análisis bioinformático exhaustivo. El protocolo que presentamos es simple, utiliza equipos de laboratorio estándar y tarda siete días desde la lisis hasta la obtención de bibliotecas.

RIBO-seq En Bacterias: Una Colección de Muestras Y Protocolo De Preparación De La Biblioteca Para La Secuenciación NGS

Este protocolo describe cómo generar un perfil de polisoma sin utilizar generadores de gradiente automatizados o sistemas de fraccionamiento de gradiente.

Perfilado de polisomas sin fabricantes de gradiente ni sistemas de fraccionamiento

Las interacciones co-traslacionales juegan un papel crucial en las modificaciones de la cadena naciente, la orientación, el plegado y las vías de ensamblaje. Aquí, describimos el Perfil Selectivo de Ribosomas, un método para el análisis directo in vivo de estas interacciones en el modelo eucariota Saccharomyces cerevisiae.

Identificación global de redes de interacción co-traslacional mediante perfiles selectivos de ribosomas

La Biotinilación Mejorada por Iluminación Restringida por Localización específica (ALIBi) es un método novedoso activado optogenéticamente desarrollado para marcar y purificar afinidad poblaciones subcelulares de ribosomas para secuenciación posterior y análisis proteómico.

Aislamiento de subpoblaciones subcelulares de ribosomas basadas en biotinilación potenciada por iluminación restringida por etiquetas péptidas específicas de péptidos recombinantes

Aprende a aislar complejos ribosoma-cadena naciente usando la secuencia SecM en E. coli. Este método permite estudiar la elongación de la traducción y el plegamiento de proteínas in vitro.

Usar secuencias de detención SecM como una herramienta para aislar Ribosome polipéptidos enlazados

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