Usar secuencias de detención SecM como una herramienta para aislar Ribosome polipéptidos enlazados

El objetivo general de este procedimiento es aislar los complejos de cadena naciente o RNC unidos al ribosoma SEC TED 70 s producidos durante la traducción en un sistema libre de células in vitro. Esto se logra introduciendo primero una secuencia de estancamiento SEC M de 17 aminoácidos de largo en el extremo terminal C del gen de interés y clonándola aguas abajo del promotor transcripcional T 7. A continuación, el ARNm se transcribe mediante una reacción de transcripción in vitro y luego se purifica.

A continuación, el ARNm purificado se traduce en un sistema de extracto de E coli S 30 con aminoácidos radiactivos para marcar la proteína sintetizada o el polipéptido naciente. Finalmente, los dos complejos de cadena naciente unidos al ribosoma Mr.Ed se aíslan mediante sacarosa, gradiente, centrifugación y fraccionamiento. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran que las cadenas nacientes se unen de manera estable al ribosoma 70 s mediante análisis de electroforesis en gel de los polipéptidos marcados aislados de las fracciones de gradiente.