NADH fluorescencia de imágenes de biventricular aislada Trabajo corazones de conejo

El objetivo general de este procedimiento es estudiar el metabolismo. El uso de imágenes de NADH en una preparación cardíaca funcional, esto se logra aislando primero el corazón de conejo. El segundo paso del procedimiento es canular con éxito las cuatro cámaras del corazón para lograr un modelo de corazón que funcione.

El paso final es configurar el equipo de imágenes y recopilar datos de NADH a diferentes velocidades de ritmo. En última instancia, los resultados pueden mostrar cambios metabólicos del corazón a través de imágenes de NADH fluorescente. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como la retrofusión de Lanor, es que el corazón está funcionando en su estado fisiológico con flujo en la dirección normal y con el corazón proporcionando su propia presión para la perfusión coronaria.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en electrofisiología y los mecanismos de las arritmias letales. Esto se hace proporcionando un modelo fisiológico para estudiar la relación entre el metabolismo del flujo coronario y la actividad eléctrica. La demostración visual de este método es fundamental porque los pasos de la canulación de vasos y cámaras cardíacas son difíciles de aprender.

Una técnica inadecuada puede dañar el corazón y poner en peligro el resto del experimento. Antes de realizar un experimento, enjuague todos los tubos en las cámaras del sistema cardíaco en funcionamiento con agua purificada y luego purgue el agua del sistema haciendo funcionar las bombas. Agregue filtros de membrana de celulosa en línea con la bomba de perfusión LOR, la bomba de perfusión cardíaca izquierda y la bomba de perfusión cardíaca derecha.

Después de agregar perfuse eight al sistema, realice una calibración de dos puntos para cada sensor de presión. Encienda el baño de agua circulante caliente que calienta los tubos encamisados de agua y los intercambiadores de calor Encienda el baño de agua. Se utiliza para calentar el PERFUSE ocho.

Encienda las bombas que hacen circular el PERFUSE eight en un circuito cerrado, encienda el tanque de circulación para oxigenar el Perfuse. Ocho, asegúrese de que el oxigenador de microfibra o los filtros hemo estén suministrando un 95% de oxígeno a la perfusión de ocho a 80 kilopascales. Por último, asegúrese de que los intercambiadores de calor mantengan la temperatura de la perfusión circulante.

A partir de los 8 grados centígrados, a 37 grados centígrados, comienza la escisión del corazón configurando primero el sistema cardíaco en funcionamiento para que funcione a presión constante. Modo LRF. Ajuste la presión del bloqueo aórtico entre 50 y 60 para después de sedar a un conejo.

Inyecte pentobarbital y heparina en la vena marginal del oído o en la vena safena lateral en el interior de la extremidad posterior. Una vez que el conejo carezca de un reflejo de dolor, abra rápidamente la cavidad torácica. Cortar el pericardio, pinzar la aorta y extirpar el corazón y los pulmones.

Los pulmones se mantienen unidos para facilitar el aislamiento de las venas pulmonares. A continuación, llene una jeringa con 60 mililitros por F 8 y 200 unidades de heparina. Coloque una cánula de cinco milímetros y cánula la aorta.

Asegure la aorta a la cánula con suturas de seda de tamaño cero. Luego, presione lentamente la jeringa para expulsar la sangre a través del corazón. Configure el sistema cardíaco que funciona conectando primero el corazón al bloqueo aórtico.

Acérquese al conector en un ángulo oblicuo y permita que Perfuse eight gotee suavemente del conector a la cánula mientras está conectada. Esto evita que el aire entre en la aorta, evitando así los émbolos coronarios mientras el corazón se perfunde a presión constante. Modo L endorf.

Retire la grasa y el tejido conectivo y localice los siguientes vasos. Vena CVA inferior y superior, una vena aose, una arteria pulmonar y venas pulmonares. A continuación, ligar la vena superior cva.

Corta la arteria pulmonar justo debajo de donde se ramifica hacia las arterias pulmonares derecha e izquierda. Los vasos restantes son las venas pulmonares. Agrúpalos entre el corazón y los pulmones y látalos todos con una sutura.

Esto es fundamental por dos razones. En primer lugar, la unión de los vasos conectados a los pulmones asegurará que no haya fugas una vez que se complete la canulación. Y en segundo lugar, es importante aislar ambos cavas VNA para su posterior canulación.

Ahora retira los pulmones. Corta un agujero de tamaño adecuado en la esquina del apéndice auricular izquierdo y asegúrate de que esté lleno de ocho profusos. A continuación, canula el apéndice mientras la cánula está completamente llena de perfusión ocho.

Luego, mientras sostiene el tejido, sutura la cánula al apéndice. El tejido de la orejuela auricular izquierda es extremadamente delicado y puede desgarrarse con facilidad. Por lo tanto, es importante canular la aurícula izquierda en el primer intento, o de lo contrario podría no ser posible.

Encienda la bomba número dos para proporcionar flujo a la aurícula izquierda. Establezca la precarga entre dos y seis tor durante todo el experimento. Es posible que sea necesario ajustar la presión.

Manténgalo dentro de los dos milímetros de la presión objetivo. Ahora cambie el corazón al modo de corazón de funcionamiento apagando momentáneamente la bomba número uno, la bomba de langor. Disminuya la presión aórtica para tenderla y luego auméntela lentamente hasta dentro del rango de 80 a 100 tor.

Esto permite que la válvula aórtica se abra y funcione como lo haría durante las condiciones fisiológicas normales. Establezca la presión de poscarga final en un valor que sea aproximadamente 20. Desgarró menos que la presión máxima del VI utilizando una cánula conectada directamente al sistema.

Cánula de la aurícula derecha a través de la vena inferior ACV y suturar la cánula a la vena. Evite introducir burbujas de aire. Encienda la bomba número tres, la bomba del lado derecho para proporcionar flujo a la aurícula derecha.

Ajuste la presión a aproximadamente tres tor. Por último, canular el ventrículo derecho sin permitir la entrada de aire y suturar la cánula a la arteria pulmonar. Esto completa la canulación biventricular.

Ahora proceda a la adquisición de señales. Inserte con cuidado el catéter transductor de presión en la aorta a través de la cánula de aorta. Desplácelo suavemente a través de la válvula aórtica y hacia el ventrículo inferior.

La señal de presión del ventrículo izquierdo aparecerá como se esperaba cuando la punta del catéter esté colocada correctamente. A continuación, presione suavemente el electrodo de potencial de acción monofásico contra el epicardio ventricular. Un artefacto de movimiento leve en la señal del electrodo es normal.

A continuación, coloque un electrodo de estímulo bipolar en la aurícula derecha para marcar el ritmo del corazón de acuerdo con la posición del diseño experimental. Y enfoque la cámara CCD en la región de interés del corazón. Debe haber un filtro de emisión conectado a la cámara.

Para pasar la fluorescencia NADH, apague las luces ambientales para iluminar uniformemente el epicardio con una fuente de luz UV en la estación de trabajo, donde está conectada la cámara. Configurar el software para que adquiera imágenes a dos fotogramas por segundo. A continuación, seleccione el modo de actualización en directo para supervisar la intensidad media de píxeles dentro de la región de interés.

Si la profusión fue adecuada, los niveles de NADH representados por la fluorescencia deben ser bajos y estables sobre la superficie epicárdica. Ahora, ejecute el experimento cuando se haya completado. Quita el corazón.

Drene el PERFUSE eight y la tubería y las cámaras del sistema con agua purificada. Enjuague periódicamente el sistema con una solución de mucosa TM o una solución diluida de peróxido de hidrógeno utilizando el protocolo descrito. Los corazones se pegaron en ciclos de entre 200 y 400 latidos por minuto.

La PAI diastólica estuvo usualmente entre cero y 10 tor, la presión aórtica diastólica mínima fue de aproximadamente 60 Tor, la PAI sistólica máxima depende de la presión de llenado y la contractilidad, y óptimamente debería estar entre 60 y 80. La presión aórtica máxima y la LVP máxima deben coincidir estrechamente con la acción monofásica, los potenciales típicos del corazón de un conejo tienen una fase de despolarización rápida y una fase de repolarización característica. Los potenciales de acción se registraban fácilmente a partir de las preparaciones, pero por lo general tenían un pequeño artefacto de movimiento durante la diástole.

Se midieron los valores promedio de NADH fluorescente de una región de interés en la caja roja para monitorear los cambios en el estado redox mitocondrial durante tres ciclos de estimulación a longitudes psico de 300, 200 y 150 milisegundos cuando la frecuencia de estimulación estaba cerca del ritmo sinusal. El nivel basal de NADH se mantuvo relativamente constante a medida que se acortaba la duración del ciclo. Por debajo de los 300 milisegundos, los niveles basales de NADH aumentaron con el mayor aumento a los 150 milisegundos, la señal oscila con la contracción y la frecuencia de oscilación corresponde a la frecuencia cardíaca.

La amplitud de estas oscilaciones fue siempre menor que cualquier tendencia de escala de tiempo más larga causada por isquemia o hipoxia. Las imágenes fluorescentes de NADH de alta resolución de toda la superficie anterior a 200 latidos por minuto fueron constantes y espacialmente homogéneas a 400 latidos por minuto. Los niveles de NADH aumentaron sustancialmente en todo el epicardio.

Se observó una heterogeneidad espacial significativa, con los mayores aumentos ocurriendo dentro de las regiones septales del VD y VI una vez dominados. Esta técnica se puede realizar en menos de 45 minutos si se realiza correctamente. Al intentar realizar este procedimiento, es importante recordar que debe evitar que entren burbujas de aire en la aorta o en la aurícula izquierda después de este procedimiento.

Se pueden utilizar métodos adicionales, como cargar el corazón con un tinte sensible al voltaje, para responder preguntas adicionales, como vincular la actividad eléctrica y metabólica en la superficie del corazón durante escenarios patológicos como la isquemia local después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en fisiología cardíaca estudiaran el metabolismo cardíaco y las alteraciones de la conducción durante condiciones patológicas utilizando un modelo fisiológicamente más relevante.