Name: NADH fluorescencia de imágenes de biventricular aislada Trabajo corazones de conejo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Aprende a realizar imagen de fluorescencia de NADH en corazones biventriculares aislados de conejo para estudiar el estado redox mitocondrial. Este método permite monitorear cambios metabólicos en tiempo real bajo condiciones fisiológicas.

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Este trabajo fue apoyado por una beca del NIH (R01-HL095828 a MW Kay).

1. Configuración para el Estudio <ol><li> Preparar cuatro litros de modificación de Krebs-Henseleit 16 (en mM: 118 NaCl, KCl 3,30, CaCl2 2,00, 1,20 MgSO 4, 24,0 NaHCO3, 1,20 KH 2 PO 4, 10,0 glucosa, NaPyruvate 2,00 y 20,0 mg / L de albúmina ). La solución debe estar preparado tan cerca del comienzo del experimento como sea posible. El pH debe ser ajustado a 7,4 después de filtrar estériles (tamaño de poro: 22 micras, Corning). Osmolalidad de la solución debe estar entre 275 y 295 mOsm / kg. </li><li> Lavar todos los tubos y las cámaras del sistema de trabajo del corazón con agua purificada. Funcionar las bombas hasta que el agua ha sido retirado del sistema. </li><li> Agregar filtros de membrana de celulosa (de tamaño de poro: 5 micras, Advantec), de acuerdo con cada una de las bombas de perfusión (bomba de perfusión Langendorff, bomba de perfusión del corazón izquierdo y derecho del corazón de la bomba de perfusión). </li><li> Realice una calibración de dos puntos (0 y 60 mm Hg) para cada sensor de presión. </li><li>Encienda los baños de agua. Un baño de agua circulante calentada (Cole Palmer) se utiliza para calentar los tubos con camisa de agua e intercambiadores de calor. Perfundido está pre-calentado en un baño de agua separada (Oakton Instruments). Ambos baños están configurados para mantener una temperatura de la solución de 37 ° C. </li><li> Encienda las bombas para hacer circular el líquido de perfusión en un bucle cerrado. Perfundido pasa a través de oxigenadores de microfibra (hemofiltros) gaseado con un 95% de O 2 y el 5% de CO 2 a 80 kPa. Perfundido oxigenada fluye entonces a través de intercambiadores de calor para mantener a una temperatura de 37 ° C antes de entrar en las cánulas del corazón. </li></ol> 2. La escisión del Corazón <ol><li> Comience por establecer el sistema de trabajo del corazón para funcionar en modo constante la presión de Langendorff. Ajustar la presión del bloque aórtica dentro del rango de 50 a 60 mmHg. </li><li> Se anestesia el conejo con una inyección intramuscular de ketamina (44 mg / kg) y xilazina (10 mg / Kg). Después de que el conejo es sedado, el pentobarbital (50 mg / Kg) y heparina (2000 U) se inyecta por vía intravenosa a través de la vena marginal de la oreja o de la vena safena lateral en el interior de la extremidad posterior. </li><li> Cuando el conejo es completamente no-respuesta, según lo determinado por la falta de dolor reflejo, la cavidad torácica se abrió rápidamente, el pericardio se corta, la aorta se fija, y el corazón y los pulmones extirpados se. En este punto, los pulmones deben ser colocada en el corazón para ayudar a aislar las venas pulmonares. </li><li> Aislar y canular la aorta con una cánula de diámetro 5 mm que se adjunta a una jeringa llena con 60 ml perfundido y 200 unidades de heparina. Fijar la aorta a la cánula con sutura de seda tamaño cero y presione lentamente la jeringa para lavar el corazón de sangre. </li></ol> 3. La canulación biventricular <ol><li> Conectar el corazón al bloque aórtica del corazón del sistema de trabajo. Evitar la entrada de aire de la aorta, que puede causar embolias coronaria. Lo mejor es colocar la cánula a la aorta block al acercarse al conector de la aorta en un ángulo oblicuo y permite perfundido a gotear suavemente desde el conector en la cánula mientras está conectado. </li><li> Mientras que el corazón está en el modo de perfusión constante de Langendorff, retirar la grasa y tejido conectivo y localizar los buques siguientes: inferior y la vena cava superior, la vena ácigos, la arteria pulmonar, las venas pulmonares. </li><li> Ligar la vena cava superior. Cortar la arteria pulmonar justo debajo de donde se bifurca en las arterias pulmonares derecha e izquierda. </li><li> Grupo de todos los vasos restantes, de las venas pulmonares) entre el corazón y los pulmones y ligar todos ellos con una sutura. Retire los pulmones. </li><li> Corte un agujero pequeño en la esquina de la orejuela de la aurícula izquierda. Asegúrese de que la LA se llena de líquido de perfusión. Canular el LA garantizando al mismo tiempo que la cánula se llena completamente con perfundido mientras que se inserta. Suture la cánula al apéndice de Los Angeles. </li><li> Encienda la bomba del lado izquierdo (de la bomba n º 2) para proporcionar un flujo de tque la aurícula izquierda. Ajuste la presión de precarga entre 2 - 6 mmHg y ajustar ± 2 mm Hg, según lo determinado por la dilatación auricular. </li><li> Cambiar el corazón en el modo de trabajo del corazón, apagando la bomba de Langendorff (bomba N º 1). </li><li> Momentáneamente disminuir la presión aórtica a 10 mmHg y luego lentamente a aumentar en el intervalo de 80 a 100 mmHg. Esto permitirá que la válvula aórtica para abrir y funcionar como lo haría durante condiciones fisiológicas normales. La presión de la poscarga final dependerá de la contractilidad del VI. Se debe establecer en un valor que es aproximadamente 20 mmHg menos de pico de presión del ventrículo izquierdo. </li><li> LV gasto cardíaco se puede determinar midiendo la velocidad de flujo de salida del bloque perfundido aórtico (ml / min). Gasto cardíaco normal está entre 14,77 y 16,43 ml / min por 100 g de peso corporal 17 y promedios 340 ml / min para un conejo kg 2,2. Presión aórtica debe parecerse a la señal de presión se muestra en la Figura 1. </li><li> Canular la RA a través de la inferior la vena cava. Asegurarse de que tanto la RA y la cánula se llena completamente con perfundido e insertar la cánula al tiempo que evita la formación de burbujas de aire. Suturar la cánula en la vena. </li><li> Encienda la bomba del lado derecho (de la bomba n º 3) para proporcionar un flujo a la aurícula derecha. Ajustar la presión a aproximadamente 3 mm de Hg. </li><li> Asegúrese de que la RV está lleno de líquido de perfusión y canular la arteria pulmonar. Asegurarse de que la cánula se llena completamente con perfundido mientras se inserta para evitar burbujas de aire. Suture la cánula en la arteria pulmonar. </li></ol> 4. Adquisición de la señal: Presiones, potenciales de acción monofásicos y fNADH <ol><li> Una vez que la canulación biventricular es completa, cuidadosamente insertar el catéter transductor de presión (Millar) en la aorta a través de la cánula aórtica. Suavemente vaya más allá de la válvula aórtica hacia el VI. Vigilar la señal de presión del VI para asegurar el posicionamiento adecuado de la punta del catéter. Un ejemplo de la presión del VI se muestraen la Figura 1. </li><li> Presione suavemente el electrodo de potencial de acción monofásico contra el epicardio ventricular. Monitorizar la señal para lograr adecuadas medidas de potencial de acción. Artefacto ligero movimiento en la señal es normal. </li><li> Coloque un electrodo de estímulo bipolar en la aurícula derecha a pasear por el corazón. En nuestro protocolo, los corazones estaban ritmo en la duración de los ciclos entre 300 y 150 ms, correspondientes a 200 y 400 latidos por minuto, respectivamente. </li><li> Mida la temperatura de la superficie epicárdica del VI. Si el estudio requiere que la temperatura se mantuvo a 37 ° C y luego colocar el corazón en el interior de una cámara de corazón con camisa de agua o sumergir el corazón en un baño de superperfundido calentado para mantener una temperatura constante durante todo el corazón. </li><li> Coloque la cámara CCD (Andor ixon DV860, 128x128 píxeles) y enfocar la lente de tal manera que un campo apropiado de vista que se observa. La cámara está conectada a una estación de trabajo y las imágenes se adquieren a 2 fps con Andor SOLIS softwavolver. </li><li> Encienda la luz de la lámpara de mercurio antes del inicio de la imagen. La luz es dirigida a través de un filtro de excitación (350 ± 25 nm, Tecnología de croma) y en una guía de luz de fibra óptica (Horiba Jobin Yvon modelo 1950-1M) para iluminar la superficie del corazón. La atenuación de la luz UV a través de la guía de luz es pequeño. Iluminación UV también pueden ser prestados utilizando un sistema de LED de alta potencia que consta de focos LED (Mightex PLS-0365-030-S) y una unidad de control (Mightex SLC-SA04-US). </li><li> Apague la luz de la habitación y minimizar cualquier tipo de iluminación ambiente. Apunte los casquillos de la guía de luz (o proyectores LED) en el corazón para alcanzar la iluminación epicárdica uniforme. Emisión de NADH fluorescencia (fNADH) pasa a través de un filtro de emisión (460 ± 20 nm tecnología Chroma) y es fotografiada por la cámara CCD. </li><li> Monitorear los cambios fNADH lo largo del tiempo mediante la selección de una región de interés con el software de imágenes. Seleccione el modo de vivir-update para controlar la intensidad de los píxeles dentro de la media o la regiónf interés. </li><li> El corazón debe estar funcionando en modo biventricular trabajando para generar las presiones adecuadas. niveles fNADH debe ser baja y estable sobre la superficie epicárdica para confirmar la adecuada perfusión coronaria. En este punto en el estudio un protocolo experimental específico debe ser implementado para probar una hipótesis. </li><li> Cuando el estudio se haya completado, quite el corazón del sistema y drene todo perfundido. Enjuague la tubería del sistema y las cámaras con agua purificada. Para el mantenimiento de rutina, el sistema debe ser periódicamente enjuaga con solución Mucasol o una solución de peróxido de hidrógeno diluido, según sea necesario. </li></ol> 5. Off-line de procesamiento de imágenes fNADH <ol><li> Una forma de comparar conjuntos de datos NADH (fNADH (i, j, t)) entre los experimentos es normalizar cada imagen de fluorescencia utilizando una imagen de referencia (fNADH (i, j, t 0)) del conjunto de datos 9, como se muestra en la siguiente ecuación . Otra forma de normalizar el NADH fluorescencia es plas una pequeña pieza de vidrio de uranilo en el campo de visión antes de que el experimento 9, 18, ​​19. Vidrio de uranilo voluntad fluorescencia (450 - 550 nm) cuando se ilumina con luz UV para proporcionar una señal que puede ser utilizado como una referencia estable. </li></ol><img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/4115/4115eq1.jpg" /> 6. Los resultados representativos Vistas anterior y basal de una preparación de trabajo biventricular corazón de conejo se muestran en la Figura 1. La presión del ventrículo izquierdo se midió mediante la navegación de un catéter transductor de presión (Millar SPR-407) más allá de la válvula aórtica y en el ventrículo izquierdo. Presiones de la aorta, la arteria pulmonar y del ventrículo izquierdo (LVP) se muestran en la Figura 1C. Diastólica LVP es normalmente entre 0 y 10 mmHg. La presión mínima diastólica aórtica es de aproximadamente 60 mmHg. Sistólica máxima LVP depende de la presión de llenado (la precarga o la presión de LA) y la contractilidady, óptimamente, debe estar entre 80 y 100 mmHg. La presión aórtica máxima y LVP máximo debe ser igual, como se muestra en la Figura 1C. Potenciales de acción monofásicos (MAP) con una fase de despolarización rápida y una fase de repolarización que son típicas de los corazones de conejo se muestran en la Figura 1D. Los mapas se pueden registran con relativa facilidad a partir de un corazón de contratación pero normalmente tendrá un artefacto de movimiento pequeño durante la diástole, como se muestra en la Figura 1D. Los mapas son útiles para confirmar el arrastre con éxito del corazón (captura) durante la estimulación y también se puede utilizar para medir cambios locales electrofisiológicos debido a la isquemia u otras perturbaciones agudas. Un ECG también podría ser medido sumergiendo el corazón en un baño de superperfundido caliente y colocando un electrodo en el baño en los lados izquierdo y derecho del corazón. Un electrodo indiferente tercero o bien se coloca en el baño, lejos del corazón, o está unido a la aorta.Un ECG proporcionará información con respecto a la excitación mundial y el proceso de repolarización, que es útil para evaluar la función eléctrica en general y para revelar la presencia de isquemia. fNADH imagen revela cambios en el estado redox mitocondrial del corazón, que pueden ser utilizados para medir la progresión espacio-temporal de las regiones isquémicas o hipóxicas. Para este estudio, se midió epicárdica fNADH para monitorear los cambios en el estado redox durante tres frecuencias de estimulación en longitudes de ciclo (CLS) de 300, 200 y 150 ms. Los valores medios de fNADH de una región de interés (cuadro rojo, Figura 2) muestran que los niveles basales de fNADH aumentar a medida que la longitud del ciclo se acorta. Cuando la frecuencia de estimulación se acerca a ritmo sinusal (CL = 300 ms) de referencia de nivel fNADH es relativamente constante. Como la duración del ciclo se reduce por debajo de 300 ms, línea de base fNADH aumento de los niveles, con el mayor incremento en el menor CL (150 ms). Alta resolución fNADH imágenes de la superficie anterior completoen 200 y 400 ppm se muestra en la Figura 3. niveles fNADH a 200 lpm eran constantes y homogéneas espacialmente. A 400 ppm, los niveles de fNADH aumentado considerablemente en todo el epicardio. Heterogeneidad espacial significativa se observó que los mayores aumentos se producen dentro de las regiones septal del VD y el VI. La señal fNADH oscila con la contracción (artefactos de movimiento) y la frecuencia de oscilación corresponde a la frecuencia cardíaca (Figura 2). En la canulación biventricular, la base del corazón se lleva a cabo por 4 cánulas, que ayuda a impedir que el corazón de balanceo durante la contracción. Por lo tanto, la amplitud de oscilación es siempre menor que cualquier escala de tiempo más largo (5-10 segundos) tendencias en fNADH que son causadas por isquemia o hipoxia. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig1.jpg" /> Figura 1. Las presiones típicas y los potenciales de acción monofásicos de un trabajo aislado biventricular raBBIT corazón. A. vista basal del corazón que muestra la cánula cuatro: 1, la aorta, 2, arteria pulmonar, y 3, de la aurícula izquierda, y 4, de la aurícula derecha la vista B. anterior del corazón mostrando el ventrículo izquierdo (VI) y el ventrículo derecho. (RV). C. presiones representativas. Arriba: la presión ventricular izquierda (línea continua) y la presión aórtica (línea punteada). Conclusión: la presión pulmonar. D. Representante potenciales de acción monofásicos. La señal está en consonancia con las presiones que se muestran en el panel C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4115/4115fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig2.jpg" /> Figura 2. fNADH imagen de un biventricular aislado de trabajo del corazón de conejo. Arriba: Una caricatura del campo de visión (izquierda) y tres imágenes fNADH se muestran. La longitud de estimulación ciclo correspondiente (CL) está indicado en cada imagen.La región de interés para la señal fNADH en el panel inferior está indicado por el cuadro rojo. La punta del electrodo del potencial de acción monofásico se ve a la derecha de la región de interés. El epicardio se iluminó con la lámpara de mercurio y guía de luz, como se muestra en la Figura 5. Sólo la superficie del epicardio que rodea a la región de interés se iluminó Abajo:. FNADH promedio para la región de interés indicado por el cuadro rojo en el panel superior. Promedio aumenta con la duración del ciclo fNADH reducida. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig3.jpg" /> Figura 3. fNADH imágenes de toda la superficie anterior de un trabajo aislado biventricular corazón de conejo. El corazón era de ritmo de la AR a 200 bpm y 400 bpm. fNADH fue fotografiada (2 fps, 128x128 píxeles con una resolución de 0,4 mm), mientras que el epicardio iluminando toda la anterior con dos LEDs de alta potencia (Mightex PLS-0.365-030-S, 365 nm, el 4% intensity, 50 mW máx).

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El corazón aislado perfundido Langendorff sigue siendo una herramienta importante para el estudio de la fisiología cardiaca 2. Es especialmente útil en los estudios de arritmias cardíacas, en particular los que utilizan imágenes de fluorescencia del potencial de membrana 20. Una ventaja es que el epicardio completa del corazón aislado se puede observar 21, 22. Otra ventaja es que, en contraste con la sangre, la perfusión con una solución tampón cristaloides claro no interfiere con las señales de fluorescencia. Una limitación es que la técnica de Langendorff no está bien adaptado para estudios del metabolismo cardíaco, que a menudo requieren el corazón para realizar un trabajo en el contexto de la precarga fisiológica y presiones poscarga. Para elevar la relevancia de preparaciones de corazón aislado de los estudios metabólicos, Neely introdujeron modificaciones a la técnica de Langendorff para establecer su caso del ventrículo izquierdo (VI) la precarga y la poscarga 3 presiones.El modelo se conoce como el modelo de corazón aislado VI de trabajo y se ha utilizado ampliamente para estudiar la función del VI y el metabolismo 4-6. El modelo LV de trabajo del corazón es superior al modelo de Langendorff para las evaluaciones funcionales, sin embargo, no proporciona un ventrículo cargado correctamente derecho (VD). Demmy et al. informó por primera vez un modelo biventricular (LV y RV) como una modificación del modelo de trabajo del corazón LV 7, 8. Ellos encontraron que el desarrollo del volumen sistólico, el gasto cardíaco y la presión de mejorar en los corazones convertidos desde el modo de trabajo del VI al modo biventricular de trabajo 8. Un RV cargado correctamente también mejora la función del tabique por la disminución de los gradientes de presión anormales a través del tabique. Biventriculares corazones de trabajo se ha demostrado que mantener la producción de la aorta, flujo pulmonar, la presión media de la aorta, la presión pulmonar, la frecuencia cardíaca y el ATP de miocardio, y los niveles de creatina fosfato para un máximo de 3 horas 8. Biventriculares de trabajo los estudios cardíacos suelen utilizar los corazones from pequeños animales, tales como ratas y conejos, ya que el gasto cardíaco y el volumen requerido de perfundido son mucho menor que el de corazones de animales más grandes. Sin embargo, los estudios biventriculares de trabajo del corazón se han llevado a cabo utilizando los corazones de los cerdos, caninos, e incluso los seres humanos 23, 24. La demanda metabólica de los corazones aislados en el modo de funcionamiento biventricular es considerablemente mayor que el de la perfusión de Langendorff. Es importante que la solución de perfusión proporcionar suficiente oxígeno y sustratos metabólicos para apoyar la función cardíaca biventricular. Soluciones tampón estándar cristaloides, tales como de Krebs-Henseleit 16, 17, 25 o Tyrodes 26, 27, tienen solubilidades de oxígeno tan alto como 5,6 mg / l Cuando estas soluciones se gaseó con carbógeno (una mezcla de gas de 95% de O 2 y 5% de CO 2) y contienen sustrato adecuado metabólico (glucosa, dextrosa, y / o piruvato de sodio), que son apropiados para biventriculares corazones de trabajo batiendo en normaal seno tasas (aproximadamente 180 latidos por minuto para un conejo). Metabólica aumenta la demanda de ritmos rápidos y la cantidad de oxígeno disuelto en perfusates estándar podría no ser suficiente para mantener un corazón totalmente biventricular de trabajo que se está contrayendo a tasas elevadas. Las soluciones cristaloides tampón conteniendo eritrocitos o mixtos con la sangre entera se han utilizado en preparaciones de corazón de trabajo para garantizar la disponibilidad de oxígeno adecuado. Estudios anteriores han demostrado que la adición de eritrocitos a una solución de Krebs-Henseleit mejora de la función de trabajo del corazón durante los protocolos de estimulación rigurosos y también redujo la incidencia de fibrilación ventricular 16. Una limitación del uso de los eritrocitos o mezclas de sangre entera es que la hemoglobina interfiere con longitudes de onda de luz que se utilizan para fluorescencia de imágenes 13. Otros sustratos, tales como albúmina, se pueden añadir también a perfundido soluciones para prolongar la viabilidad del corazón y reducir el edema 28. En imágenes de fluorescencia la intensidad de la luz de excitación debe ser alto y la distribución de la luz debe ser uniforme. El logro de una iluminación uniforme no siempre es fácil debido a la curvatura de la superficie epicárdica. En nuestros estudios, la imagen fNADH al filtrar la luz (350 ± 25 nm) de una lámpara de mercurio. Una guía de fibra óptica bifurcada la luz se utiliza para dirigir la luz ultravioleta sobre la superficie epicárdica. Iluminación uniforme se puede lograr mediante la colocación apropiada de los dos casquillos de salida. UV LED fuentes de luz también se podría utilizar, como hemos demostrado en la Figura 3. Fuentes LED son relativamente baratos para fuentes múltiples podrían ser incorporados en un sistema de imagen. Los LEDs también pueden ser ciclos de encendido y apagado en las altas tasas de sincronizar la luz de excitación con la adquisición de la imagen. Photobleaching de NADH debe minimizarse 29 al reducir el tiempo de iluminación del tejido. Esto puede hacerse mediante ciclos de la iluminación y desactivarse mediante un electrónIC del obturador y una lámpara o con un sistema de iluminación LED y un controlador. Si la iluminación está sincronizada con el ciclo cardíaco, a continuación, la adquisición de imágenes fNADH que puede limitarse a la diástole, lo que reduciría los artefactos de movimiento en las señales de fluorescencia. Iluminación Trigging y adquisición de imágenes mediante una señal de presión, como la presión del VI, sería una manera de hacer esto. En nuestros estudios hemos observado que los cambios en fNADH por unidad de tiempo puede ser más de 5 veces superior a 400 ppm que a 200 ppm. Esto indica que los ritmos rápidos elevar el estado redox del corazón. Sea o no esto es causado por la hipoxia o la incapacidad de los miocitos para oxidar NADH a NAD + con la suficiente rapidez para evitar la acumulación de NADH es todavía una pregunta sin respuesta. El rendimiento de una preparación cardiaca biventricular de trabajo depende de múltiples factores. Uno de los más importantes es establecer las presiones adecuadas de precarga y la poscarga para imitar los efectos fisiológicoscondiciones que están bajo investigación. En particular, la poscarga del VI (presión aórtica) debe ser ajustada para representar la presión sistémica. Si es demasiado alta, el LV no será capaz de superar la presión, lo que resulta en la regurgitación. La presión que es demasiado baja afectará adversamente a la perfusión coronaria. La presión de precarga del ventrículo izquierdo (presión de la aurícula izquierda) debe también ser ajustado para proporcionar un volumen de fin de diástole que es apropiado para el protocolo experimental. fNADH imágenes de los tejidos vivos es una vía reconocida de la fluorescencia de imagen 13. Su aplicación al tejido cardíaco se puso de manifiesto por Barlow y Chance, cuando se reportaron incrementos notables de fNADH dentro del tejido regional isquémico después de la ligadura de un vaso coronario 14. Sus imágenes fNADH se registraron en el cine con una cámara osciloscopio Fairchild y la fotografía con flash UV. Coremans et al. amplió este concepto utilizando la fluorescencia de NADH / UV ratio de reflexión para medire el estado metabólico del epicardio de corazones de rata perfundidos Langendorff de sangre 30. Un videofluorimeter se utilizó para la imagen y los datos ha sido grabado con un grabador de vídeo. Más tarde, Scholz et al. utiliza una amplia espectrógrafo y un fotodiodo para medir fNADH promedio en un área amplia de la LV. Este enfoque reduce los efectos de las heterogeneidades de fluorescencia epicárdicas y las variaciones locales en la circulación al tiempo que revela macroscópicas relacionadas con el trabajo de las variaciones fNADH 31. Este enfoque es similar a los niveles de computación fNADH promedio para una región de interés en todos los marcos de un conjunto de datos fNADH de imagen, como se ilustra en la Figura 2. Como ya hemos presentado en este artículo, la tecnología de hoy ofrece cámaras de alta velocidad CCD y control digital de alta potencia focos UV. Estas tecnologías permiten la dinámica espacio-temporales de fNADH y el metabolismo cardiaco para ser estudiado desde muchas perspectivas nuevas. El costo relativamente bajo de la óptica y la fuente de luz hace que fNADH imágenes de un accesorio muy útil para los sistemas convencionales de mapeo óptico cardíacos. 9, 32

<table border="1"><tbody><tr><td> Químico </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> S-3014 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> P3911-500G </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, Nueva Jersey </td><td> C77-500 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> M-7506 </td></tr><tr><td> NaHCO $ 3 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, Nueva Jersey </td><td> S-233 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, Nueva Jersey </td><td> 423-316 </td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 158968-500G </td></tr><tr><td> NaPyruvate </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> P2256-25G </td></tr><tr><td> Albúmina </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> A9418-100G </td></tr></tbody></table>

nadh fluorescencia de imágenes de biventricular aislada trabajo corazones de conejo

NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts

Desde su creación por Langendorff 1, el corazón aislado y perfundido sigue siendo una herramienta importante para el estudio de la fisiología cardiaca 2. Sin embargo, no está bien adaptado para los estudios de metabolismo cardíaco, que requieren el corazón para realizar un trabajo en el contexto de la precarga fisiológica y presiones poscarga. Modificaciones introducidas Neely a la técnica de Langendorff para establecer su caso del ventrículo izquierdo (VI) la precarga y la poscarga. 3 presiones El modelo se conoce como el modelo de corazón aislado VI de trabajo y se ha utilizado ampliamente para estudiar la función del VI y el metabolismo 4-6. Este modelo, sin embargo, no proporciona un ventrículo cargado correctamente derecho (VD). Demmy et al. informó por primera vez un modelo biventricular como una modificación del modelo de trabajo del corazón LV 7, 8. Ellos encontraron que el desarrollo del volumen sistólico, el gasto cardíaco y la presión de mejorar en los corazones convertidos desde el modo de trabajo del VI al modo de trabajo biventricular 8 </sup&gt;. Un RV cargado correctamente también disminuye los gradientes de presión anormales a través del tabique para mejorar la función del tabique. Biventriculares corazones de trabajo se ha demostrado que mantener la producción de la aorta, flujo pulmonar, la presión media de la aorta, la frecuencia cardíaca y los niveles de ATP de miocardio durante un máximo de 3 horas 8. Al estudiar los efectos metabólicos de la lesión miocárdica, tales como isquemia, a menudo es necesario para identificar la localización del tejido afectado. Esto puede hacerse mediante imágenes la fluorescencia de NADH (la forma reducida del dinucleótido de nicotinamida adenina) 9-11, una coenzima encuentra en grandes cantidades en las mitocondrias. NADH fluorescencia (fNADH) muestra una relación casi lineal inversa con 12 locales la concentración de oxígeno y proporciona una medida del estado redox mitocondrial 13. imagen fNADH durante condiciones de hipoxia isquémica y se ha utilizado como un método de tinte libre para identificar las regiones hipóxicas 14, 15 y para controlar la progresión decondiciones hipóxicas en el tiempo 10. El objetivo del método es para supervisar el estado redox mitocondrial de biventriculares corazones de trabajo durante protocolos que alteran la tasa de metabolismo de los miocitos o inducir la hipoxia o crear una combinación de los dos. Corazones de conejos blancos New Zealand estaban conectados a un sistema de trabajo cardiaca biventricular (Hugo Sachs Elektronik) y perfundidos con Krebs-Henseleit modificado solución de 16 a 37 ° C. Aórtica, LV, arteria pulmonar, y las presiones de la aurícula izquierda y la derecha se registraron. La actividad eléctrica se midió utilizando un electrodo de potencial de acción monofásico. Para la imagen fNADH, la luz de una lámpara de mercurio se filtró (350 ± 25 nm) y que sirve para iluminar el epicardio. La luz emitida se filtró (460 ± 20 nm) y la imagen mediante una cámara CCD. Los cambios en el fNADH epicárdica del corazón biventricular de trabajo durante diferentes frecuencias de estimulación se presentan. La combinación del modelo de corazón y de imagen fNADHproporciona una herramienta experimental nueva y valiosa para el estudio de patologías cardíacas agudas en el contexto de realistas condiciones fisiológicas.

El objetivo es supervisar el estado redox mitocondrial de los corazones aislados dentro del contexto de la precarga fisiológica y presiones poscarga. Un modelo de trabajo biventricular corazón de conejo se presenta. De alta resolución espacio-temporal de imágenes de fluorescencia de NADH se utiliza para supervisar el estado redox mitocondrial del tejido epicárdico.

NADH fluorescencia de imágenes de biventricular aislada Trabajo corazones de conejo

Desde su creación por Langendorff1, el corazón aislado perfundido sigue siendo una herramienta destacada para estudiar la fisiología cardíaca2. Sin embargo, no es adecuado...

El objetivo general de este procedimiento es estudiar el metabolismo. Mediante la imagenología de NADH en una preparación de corazón funcionando, esto se logra primero aislando el corazón de conejo. El segundo paso del procedimiento consiste en canular con éxito las cuatro cámaras del corazón para obtener un modelo de corazón funcionando.El paso final consiste en configurar el equipo de adquisición de imágenes y recopilar datos de NADH a diferentes frecuencias de estimulación. En última instancia, los resultados pueden mostrar los cambios metabólicos del corazón mediante la obtención de imágenes del NADH fluorescente. La ventaja principal de esta técnica frente a métodos existentes como la perfusión retrograda de Langendorff es que el corazón funciona en su estado fisiológico, con flujo en la dirección normal y con el propio corazón generando la presión necesaria para la perfusión coronaria.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en electrofisiología y en los mecanismos de las arritmias letales. Esto se logra mediante la provisión de un modelo fisiológico para estudiar la relación entre el metabolismo del flujo coronario y la actividad eléctrica. La demostración visual de este método es fundamental porque los pasos de canulación de los vasos y de las cámaras cardíacas son difíciles de aprender.Una técnica inadecuada puede dañar el corazón y comprometer el resto del experimento. Antes de realizar un experimento, enjuague todos los tubos en las cámaras del sistema de corazón aislado con agua purificada y luego elimine el agua del sistema haciendo funcionar las bombas. Añada filtros de membrana de celulosa en línea con la bomba de perfusión LOR, la bomba de perfusión del corazón izquierdo y la bomba de perfusión del corazón derecho.Después de agregar el PERFUSE ocho al sistema, realice una calibración de dos puntos para cada sensor de presión. Encienda el baño de agua circulante con calefacción que calienta los tubos con camisa de agua y los intercambiadores de calor. Encienda el baño de agua utilizado para calentar el PERFUSE ocho.Encienda las bombas que hacen circular el PERFUSE ocho en un circuito cerrado, encienda el tanque de circulación para oxigenar el Perfuse. Ocho, asegúrese de que el oxigenador de microfibra o los filtros hemáticos estén suministrando un 95 % de oxígeno al Perfuse ocho a 80 kilopascales. Por último, asegúrese de que los intercambiadores de calor mantengan la temperatura del Perfuse en circulación.A los ocho a 37 grados Celsius, comience la disección del corazón ajustando primero el sistema de corazón trabajando para que funcione a presión constante. Modo LRF. Establezca la presión del bloque aórtico entre 50 y 60 después de sedar un conejo.Inyecte pentobarbital y heparina en la vena marginal de la oreja o en la vena safena lateral del interior de la extremidad trasera. Una vez que el conejo carezca de reflejo doloroso, abra rápidamente la cavidad torácica. Corte el pericardio, pinze la aorta y extirpe el corazón y los pulmones.Los pulmones se mantienen adheridos para facilitar el aislamiento de las venas pulmonares. A continuación, llene una jeringa con 60 mililitros por F ocho y 200 unidades de heparina. Coloque una cánula de cinco milímetros y cánule la aorta.Sujete la aorta a la cánula con suturas de seda número cero. Luego, presione lentamente la jeringa para lavar la sangre a través del corazón. Configure el sistema de corazón en funcionamiento conectando primero el corazón al bloque aórtico.Acerque el conector en un ángulo oblicuo y permita que Perfuse ocho gotee suavemente desde el conector hacia la cánula mientras está conectado. Esto evita que el aire entre en la aorta, previniendo así embolias coronarias mientras el corazón se perfunde a presión constante. Modo L endorf.Elimine la grasa y el tejido conectivo y localice los siguientes vasos: vena cava inferior y superior, vena ácigos, arteria pulmonar y venas pulmonares. A continuación, ligue la vena cava superior.Corte la arteria pulmonar justo debajo del punto donde se divide en las arterias pulmonares derecha e izquierda. Los vasos restantes son las venas pulmonares. Agrúpelos entre el corazón y los pulmones y ligue todos ellos utilizando una sola sutura.Esto es crítico por dos razones. Primero, atar los vasos conectados a los pulmones garantizará que no haya fugas una vez completada la canulación. Y segundo, es importante aislar ambas cavas venosas para la canulación posterior.Ahora retire los pulmones. Corte un orificio de tamaño adecuado en la esquina de la orejuela auricular izquierda y asegúrese de que esté lleno de perfusato ocho. A continuación, canule la orejuela mientras la cánula esté completamente llena de perfusato ocho.Luego, mientras sostiene el tejido, sutúre la cánula a la apéndice. El tejido del apéndice auricular izquierdo es extremadamente delicado y puede desgarrarse fácilmente. Por lo tanto, es importante canular la aurícula izquierda en el primer intento, ya que de lo contrario podría no ser posible.Encienda la bomba número dos para proporcionar flujo a la aurícula izquierda. Ajuste la precarga entre dos y seis tor durante todo el experimento. Es posible que sea necesario ajustar la presión.Manténgalo dentro de dos milímetros del valor de presión objetivo. Ahora cambie el corazón al modo de corazón funcionando apagando momentáneamente la bomba número uno, la bomba de Langendorff. Disminuya la presión aórtica hasta 10 torr y luego aumente lentamente hasta alcanzar el rango de 80 a 100 torr.Esto permite que la válvula aórtica se abra y funcione como lo haría durante condiciones fisiológicas normales. Ajuste la presión final de poscarga a un valor que sea aproximadamente 20. Tore inferior a la presión pico del ventrículo izquierdo utilizando una cánula directamente conectada al sistema.Realice la canulación del atrio derecho a través de la vena cava inferior y sutúre la cánula a la vena. Evite introducir burbujas de aire. Encienda la bomba número tres, la bomba del lado derecho, para proporcionar flujo al atrio derecho.Establezca la presión en aproximadamente tres tor. Por último, canule el ventrículo derecho sin permitir que entre aire y sutúre la cánula a la arteria pulmonar ery. Esto completa la canulación biventricular.Ahora continúe con la adquisición de la señal. Inserte cuidadosamente el catéter del transductor de presión en la aorta a través de la cánula aórtica. Navegue suavemente más allá de la válvula aórtica y hacia el VI.La señal de presión del VI aparecerá como se espera cuando la punta del catéter esté correctamente posicionada. A continuación, presione suavemente el electrodo del potencial de acción monofásico contra el epicardio ventricular. Es normal un ligero artefacto de movimiento en la señal del electrodo.A continuación, coloque un electrodo estimulador bipolar sobre la aurícula derecha para estimular el corazón según la posición del diseño experimental. Y enfoque la cámara CCD en la región de interés del corazón. Debe haber un filtro de emisión acoplado a la cámara.Para registrar la fluorescencia de NADH, apague las luces ambientales para iluminar uniformemente el epicardio con una fuente de luz ultravioleta en la estación de trabajo, a la cual está conectada la cámara. Configure el software para adquirir imágenes a dos cuadros por segundo. Luego, seleccione el modo de actualización en vivo para monitorear la intensidad media de los píxeles dentro de la región de interés.Si la perfusión fue adecuada, los niveles de NADH representados por la fluorescencia deberían ser bajos y estables sobre la superficie epicárdica. Ahora, realice el experimento cuando esté completo. Retire el corazón.Drene el PERFUSE ocho y los tubos y cámaras del sistema con agua purificada. Enjuague periódicamente el sistema con solución TM mucosal o una solución diluida de peróxido de hidrógeno siguiendo el protocolo descrito. Los corazones se estimularon a longitudes de ciclo entre 200 y 400 latidos por minuto.La presión ventricular izquierda diastólica (LVP) solía estar entre 0 y 10 tor; la presión aórtica diastólica mínima era aproximadamente 60 tor. La presión ventricular izquierda sistólica máxima depende de la presión de llenado y la contractilidad, y óptimamente debería estar entre 60 y 80 tor. La presión aórtica máxima y la presión ventricular izquierda máxima deben coincidir estrechamente. Los potenciales de acción monofásicos típicos del corazón de conejo presentan una fase de despolarización rápida y una fase de repolarización característica. Los potenciales de acción se registraron fácilmente a partir de los preparados, pero generalmente presentaban un pequeño artefacto de movimiento durante la diástole.Se midieron los valores promedio de NADH fluorescente de una región de interés en el cuadro rojo para monitorear los cambios en el estado redox mitocondrial durante tres ciclos de estimulación con longitudes de estímulo de 300, 200 y 150 milisegundos cuando la frecuencia de estimulación estaba cercana al ritmo sinusal. El nivel basal de NADH fue relativamente constante mientras se acortaba la longitud del ciclo. Por debajo de 300 milisegundos, los niveles basales de NADH aumentaron, siendo el incremento mayor a 150 milisegundos; la señal oscila con la contracción y la frecuencia de la oscilación corresponde a la frecuencia cardíaca.La amplitud de estas oscilaciones fue siempre menor que cualquier tendencia a mayor escala temporal causada por isquemia o hipoxia. La imagen fluorescente de alta resolución de NADH de toda la superficie anterior a 200 latidos por minuto fue constante y espacialmente homogénea a 400 latidos por minuto. Los niveles de NADH aumentaron sustancialmente en todo el epicardio.Se observó una heterogeneidad espacial significativa, con los mayores aumentos ocurriendo dentro de las regiones septales del VD y VI una vez dominada la técnica. Esta técnica puede realizarse en menos de 45 minutos si se lleva a cabo correctamente. Al intentar realizar este procedimiento, es importante recordar prevenir que burbujas de aire entren en la aorta o en la aurícula izquierda tras seguir este procedimiento.Métodos adicionales, como cargar el corazón con un colorante sensible al voltaje, pueden utilizarse para responder preguntas adicionales, como vincular la actividad eléctrica y metabólica en la superficie del corazón durante escenarios patológicos tales como isquemia local tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en fisiología cardíaca estudiaran el metabolismo del corazón y las alteraciones de la conducción durante condiciones patológicas, utilizando un modelo más fisiológicamente relevante.

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Investigación

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En el corazón, los eventos moleculares coordinan la función eléctrica y contráctil del órgano. Un conjunto de técnicas de microscopía de fluorescencia de campo locales que aquí se presenta permite el registro de las variables celulares en los corazones intactos. La identificación de los mecanismos que definen la función cardíaca es fundamental para entender cómo el corazón trabaja en situaciones patológicas.

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Este protocolo describe la evaluación electrofisiológica de atria murino utilizando un sistema de mapeo óptico con una alta resolución espacial y temporal, incluyendo grabaciones duales de la tensión de la membrana y Ca2 + transitoria bajo programado estimulación a través de un catéter electrodo especializados.

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Nuevas estrategias terapéuticas en medicina regenerativa cardiaca requieren extensos y detallados estudios en modelos animales preclínicos grandes antes que pueden ser considerados para el uso en seres humanos. Aquí, demostramos una técnica de inyección de contraste percutánea guiada por ecocardiografía intramiocárdica en conejos, que es valiosa para la hipótesis que prueba la eficacia de estas nuevas terapias.

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Aquí introducimos un método para utilizar un catéter óptico intra-ventrículo en corazones perfundidos para realizar espectroscopia de absorbancia a través de la pared del corazón. Los datos obtenidos proporcionan información sólida sobre la tensión de oxígeno tisular, así como la utilización del sustrato y el potencial de la membrana simultáneamente con medidas de rendimiento cardíaco en esta preparación omnipresente.

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Presentamos la metodología para el aislamiento de miocitos murinos y cómo obtener trazas de voltaje o calcio simultáneamente con rastros de acortamiento de sarcomere utilizando fotometría de fluorescencia con mediciones simultáneas de geometría celular digital.

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El objetivo de este estudio fue establecer un método para investigar la dinámica cardíaca utilizando un modelo animal traslacional. El enfoque experimental descrito incorpora optocardiografía de doble emisión junto con un estudio electrofisiológico para evaluar la actividad eléctrica en un modelo de corazón porcino aislado e intacto.

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El presente estudio demuestra un modelo animal altamente reproducible de isquemia miocárdica regional aguda y lesión por reperfusión en conejos utilizando una minitoracotomía izquierda para los casos de supervivencia o una esternotomía de línea media para los casos de no supervivencia.

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NADH fluorescencia de imágenes de biventricular aislada Trabajo corazones de conejo

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