NADH fluorescencia de imágenes de biventricular aislada Trabajo corazones de conejo

El objetivo general de este procedimiento es estudiar el metabolismo. Mediante la imagenología de NADH en una preparación de corazón funcionando, esto se logra primero aislando el corazón de conejo. El segundo paso del procedimiento consiste en canular con éxito las cuatro cámaras del corazón para obtener un modelo de corazón funcionando.

El paso final consiste en configurar el equipo de adquisición de imágenes y recopilar datos de NADH a diferentes frecuencias de estimulación. En última instancia, los resultados pueden mostrar los cambios metabólicos del corazón mediante la obtención de imágenes del NADH fluorescente. La ventaja principal de esta técnica frente a métodos existentes como la perfusión retrograda de Langendorff es que el corazón funciona en su estado fisiológico, con flujo en la dirección normal y con el propio corazón generando la presión necesaria para la perfusión coronaria.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en electrofisiología y en los mecanismos de las arritmias letales. Esto se logra proporcionando un modelo fisiológico para estudiar la relación entre el metabolismo del flujo coronario y la actividad eléctrica. La demostración visual de este método es fundamental porque los pasos de canulación de los vasos y de las cámaras cardíacas son difíciles de aprender.

Una técnica inadecuada puede dañar el corazón y comprometer el resto del experimento. Antes de realizar un experimento, enjuague todos los tubos en las cámaras del sistema de corazón aislado con agua purificada y luego elimine el agua del sistema haciendo funcionar las bombas. Añada filtros de membrana de celulosa en línea con la bomba de perfusión LOR, la bomba de perfusión del corazón izquierdo y la bomba de perfusión del corazón derecho.

Después de agregar PERFUSE ocho al sistema, realice una calibración de dos puntos para cada sensor de presión. Encienda el baño de agua circulante con calefacción que calienta los tubos con camisa de agua y los intercambiadores de calor. Encienda el baño de agua utilizado para calentar el PERFUSE ocho.

Encienda las bombas que hacen circular el PERFUSE ocho en un circuito cerrado, encienda el tanque de circulación para oxigenar el Perfuse. Ocho, asegúrese de que el oxigenador de microfibra o los filtros hemáticos estén suministrando un 95 % de oxígeno al Perfuse ocho a 80 kilopascales. Por último, asegúrese de que los intercambiadores de calor mantengan la temperatura del Perfuse en circulación.

A los ocho a 37 grados Celsius, comience la disección del corazón ajustando primero el sistema de corazón trabajando para que funcione a presión constante. Modo LRF. Establezca la presión del bloque aórtico entre 50 y 60 tras sedar un conejo.

Inyecte pentobarbital y heparina en la vena marginal de la oreja o en la vena safena lateral en la cara interna de la extremidad trasera. Una vez que el conejo carezca de reflejo doloroso, abra rápidamente la cavidad torácica. Corte el pericardio, pinze la aorta y extirpe el corazón y los pulmones.

Los pulmones se mantienen adheridos para facilitar el aislamiento de las venas pulmonares. A continuación, llene una jeringa con 60 mililitros por F ocho y 200 unidades de heparina. Coloque una cánula de cinco milímetros y canule la aorta.

Sujete la aorta a la cánula con suturas de seda número cero. Luego, presione lentamente la jeringa para lavar la sangre a través del corazón. Configure el sistema de corazón en funcionamiento conectando primero el corazón al bloque aórtico.

Acérquese al conector en un ángulo oblicuo y permita que Perfuse eight gotee suavemente desde el conector hacia la cánula mientras está conectada. Esto evita que el aire entre en la aorta, previniendo así embolias coronarias mientras el corazón se perfunde a presión constante. Modo L endorf.

Elimine la grasa y el tejido conectivo y localice los siguientes vasos. Vena cava inferior y superior, vena ácigos, arteria pulmonar y venas pulmonares. A continuación, ligue la vena cava superior.

Corte la arteria pulmonar justo debajo del punto donde se divide en las arterias pulmonares derecha e izquierda. Los vasos restantes son las venas pulmonares. Agrúpelos entre el corazón y los pulmones y ligue todos ellos utilizando un solo punto de sutura.

Esto es crítico por dos razones. Primero, ligar los vasos conectados a los pulmones garantizará que no haya fugas una vez completada la canulación. Y segundo, es importante aislar ambas cavas venosas para la canulación posterior.

Ahora retire los pulmones. Corte un orificio de tamaño adecuado en la esquina del apéndice auricular izquierdo y asegúrese de que esté lleno de perfusato ocho. A continuación, canule el apéndice mientras la cánula esté completamente llena de perfusato ocho.

Luego, mientras sostiene el tejido, sutúre la cánula a la apéndice. El tejido del apéndice auricular izquierdo es extremadamente delicado y puede desgarrarse fácilmente. Por lo tanto, es importante canular la aurícula izquierda en el primer intento, ya que de lo contrario podría no ser posible.

Encienda la bomba número dos para proporcionar flujo hacia la aurícula izquierda. Ajuste la precarga entre dos y seis tor durante todo el experimento. Es posible que sea necesario ajustar la presión.

Manténgalo dentro de dos milímetros del valor de presión objetivo. Ahora cambie el corazón al modo de corazón en funcionamiento desactivando momentáneamente la bomba número uno, la bomba de Langendorff. Disminuya la presión aórtica hasta 10 torr y luego aumente lentamente hasta alcanzar el rango de 80 a 100 torr.

Esto permite que la válvula aórtica se abra y funcione como lo haría durante condiciones fisiológicas normales. Ajuste la presión final de poscarga a un valor que sea aproximadamente 20. Tore inferior a la presión pico del VI, utilizando una cánula directamente conectada al sistema.

Cánule el atrio derecho a través de la vena cava inferior y sutúre la cánula a la vena. Evite introducir burbujas de aire. Encienda la bomba número tres, la bomba del lado derecho, para proporcionar flujo al atrio derecho.

Establezca la presión en aproximadamente tres tor. Por último, canule el ventrículo derecho sin permitir que entre aire y sutúre la cánula a la arteria pulmonar ery. Esto completa la canulación biventricular.

Ahora continúe con la adquisición de la señal. Inserte cuidadosamente el catéter del transductor de presión en la aorta a través de la cánula aórtica. Navegue suavemente más allá de la válvula aórtica y hacia el VI.

La señal de presión del VI aparecerá como se espera cuando la punta del catéter esté correctamente posicionada. A continuación, presione suavemente el electrodo del potencial de acción monofásico contra el epicardio ventricular. Es normal un ligero artefacto de movimiento en la señal del electrodo.

A continuación, coloque un electrodo estimulador bipolar sobre el atrio derecho para estimular el corazón según la posición del diseño experimental. Y enfoque la cámara CCD en la región de interés del corazón. Debe haber un filtro de emisión acoplado a la cámara.

Para registrar la fluorescencia de NADH, apague las luces ambientales para iluminar uniformemente el epicardio con una fuente de luz UV en la estación de trabajo, a la cual está conectada la cámara. Configure el software para adquirir imágenes a dos cuadros por segundo. Luego, seleccione el modo de actualización en vivo para monitorear la intensidad media de píxeles dentro de la región de interés.

Si la perfusión fue adecuada, los niveles de NADH representados por la fluorescencia deberían ser bajos y estables sobre la superficie epicárdica. Ahora, realice el experimento cuando esté completo. Retire el corazón.

Drene el PERFUSE ocho y los tubos y cámaras del sistema con agua purificada. Enjuague periódicamente el sistema con solución TM mucosal o una solución diluida de peróxido de hidrógeno siguiendo el protocolo descrito. Los corazones se estimularon a longitudes de ciclo entre 200 y 400 latidos por minuto.

La presión ventricular izquierda diastólica solía estar entre cero y 10 tor; la presión aórtica diastólica mínima era aproximadamente 60 tor. La presión ventricular izquierda sistólica máxima depende de la presión de llenado y la contractilidad, y óptimamente debería estar entre 60 y 80 tor; la presión aórtica máxima y la presión ventricular izquierda máxima deben coincidir estrechamente. Los potenciales de acción monofásicos típicos del corazón de conejo presentan una fase de despolarización rápida y una fase de repolarización característica. Los potenciales de acción se registraron fácilmente a partir de los preparados, pero generalmente presentaban un pequeño artefacto de movimiento durante la diástole.

Se midieron los valores promedio de NADH fluorescente de una región de interés en el cuadro rojo para monitorear los cambios en el estado redox mitocondrial durante tres ciclos de estimulación con longitudes de estímulo de 300, 200 y 150 milisegundos cuando la frecuencia de estimulación estaba cercana al ritmo sinusal. El nivel basal de NADH fue relativamente constante a medida que se acortaba la longitud del ciclo. Por debajo de 300 milisegundos, los niveles basales de NADH aumentaron, con el incremento más pronunciado a 150 milisegundos; la señal oscila con la contracción y la frecuencia de la oscilación corresponde a la frecuencia cardíaca.

La amplitud de estas oscilaciones fue siempre menor que cualquier tendencia a mayor escala temporal causada por isquemia o hipoxia. La imagen fluorescente de alta resolución de NADH de toda la superficie anterior a 200 latidos por minuto fue constante y espacialmente homogénea a 400 latidos por minuto. Los niveles de NADH aumentaron sustancialmente en todo el epicardio.

Se observó una heterogeneidad espacial significativa, con los mayores aumentos ocurriendo dentro de las regiones septales del VD y VI una vez dominada. Esta técnica puede realizarse en menos de 45 minutos si se lleva a cabo correctamente. Al intentar realizar este procedimiento, es importante recordar prevenir que burbujas de aire entren en la aorta o en la aurícula izquierda tras seguir este procedimiento.

Métodos adicionales, como cargar el corazón con un colorante sensible al voltaje, pueden utilizarse para responder preguntas adicionales, como vincular la actividad eléctrica y metabólica en la superficie del corazón durante escenarios patológicos tales como isquemia local tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en fisiología cardíaca estudiaran el metabolismo del corazón y las alteraciones de la conducción durante condiciones patológicas, utilizando un modelo más fisiológicamente relevante.