Análisis cuantitativo de la autofagia mediante microscopía de fluorescencia avanzada 3D

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes cuantitativas de células tumorales de próstata tratadas para medir el grado y alcance de la autofagia en diferentes puntos de tiempo. Esto se logra primero tratando las células con arginina, dase u otros reactivos experimentales para inducir la autofagia y/o la muerte celular. El segundo paso consiste en decidir si se van a imaginar células vivas o células fijadas y preparar las muestras en consecuencia.

A continuación, obtenga imágenes de fluorescencia 3D de células vivas o fijadas utilizando microscopía de fluorescencia de campo amplio, deconvolución o iluminación estructurada. El paso final consiste en recopilar datos estadísticos sobre la distribución del tamaño de los autofagosomas y su colocalización con otras estructuras intracelulares. Mediante el uso de software de análisis digital de imágenes 3D, este enfoque puede obtener resultados que demuestran no solo que la inducción de autofagia por arginasa puede provocar la muerte de células tumorales prostáticas, sino también que estas células presentan cambios estructurales morfológicamente distintos de los asociados con apoptosis y necrosis.

La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos actualmente existentes es que la imagen cuantitativa en 3D puede mostrar cuándo y dónde ocurre un evento molecular específico dentro de una célula viva, y luego presentarlo en un formato tridimensional. Para comenzar, cultive células de cáncer de próstata humano que expresan la proteína verde fluorescente, acoplada a la cadena ligera tres, en placas de cultivo de fondo de vidrio recubierto con poli-L-lisina de 35 milímetros, según se describe en el protocolo del texto. Las células deben sembrarse con una densidad suficiente para facilitar una proliferación rápida, pero no tanta que las células estén sobrepobladas y agrupadas al momento de la adquisición de imágenes. Trate muestras seleccionadas de células con arginasa o un DI en PBS para agotar las células de arginina libre e inducir estrés metabólico en las células cancerosas aproximadamente una hora antes de la adquisición de imágenes. Diluya 1,5 microlitros de Lyo tracker red con 20 mililitros de RPMI que contenga 10% FPS y 1% de antibióticos. Prepare soluciones con un DI para las muestras seleccionadas que fueron tratadas tras calentar todos los medios a 37 grados Celsius.

Añada el medio adecuado a cada placa de cultivo e incube las células con RPMI que contiene LYO Tracker rojo durante 15 a 45 minutos a 37 grados Celsius, aproximadamente 30 minutos antes de la adquisición de imágenes. Encienda el recinto ambiental de la estación meteorológica y permita que se equilibre a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono, lave las células con PBS y sustituya el medio por RPMI estándar que contenga únicamente 10% de suero bovino fetal y 1% de antibióticos. Añada un DI a las muestras según se indique.

Monte placas de cultivo con fondo de cubreobjetos de 35 mm en un adaptador personalizado. Utilice aceite de inmersión en el objetivo de aumento 60X y apertura numérica 1.42, y coloque la placa de cultivo montada sobre la platina del microscopio. En este video, se demuestra la microscopía 3D utilizando el microscopio de desconvolución Delta Vision Personal DV y la suite de aplicaciones Associated Soft Works.

Para comenzar, encienda el sistema del microscopio, incluyendo la estación de trabajo de adquisición y el controlador del instrumento. Abra la aplicación informática de control resolve 3D para inicializar la platina del microscopio y encender la fuente de luz de xenón. Espere 10 minutos para que la fuente de luz alcance su temperatura de funcionamiento y condiciones estables.

Agregue una gota de aceite de inmersión sobre el objetivo de aumento DX seis, con apertura numérica de 1,42, y centre la muestra del portaobjetos con la cubierta hacia abajo sobre el objetivo utilizando iluminación de campo claro o iluminación externa, así como el enfoque grueso. Gire lentamente el botón de ajuste para elevar el objetivo hasta que la gota de aceite de inmersión haga contacto con la cubierta invertida. A partir de este punto, la capa celular debería enfocarse dentro de unas pocas vueltas del botón de ajuste de enfoque fino.

Al trabajar con muestras fijadas sobre los portaobjetos, se recomienda evitar las células dentro o cerca de cualquier área con burbujas. Al observar muestras vivas en la placa con fondo de vidrio, evite mover la lente del objetivo fuera del límite del cubreobjetos de vidrio. Seleccione el campo de visión deseado.

Idealmente, las células deben exhibir una buena señal fluorescente en todos los canales apropiados y estar suficientemente adheridas y extendidas sobre la superficie del cubreobjetos para que sea fácil visualizar el contenido intracelular. Pequeños ajustes laterales en el enfoque X, Y y Z pueden controlarse mediante la computadora utilizando la interfaz de adquisición 3D. Configure el binning a uno por uno o dos por dos según el campo de visión deseado para una imagen determinada a través de la sección media de una célula, y establezca los parámetros de exposición de modo que la intensidad máxima del píxel no supere los 3000 conteos.

Generalmente, el porcentaje de transmisión debe ajustarse lo más bajo posible sin aumentar el tiempo de exposición correspondiente. Tiempo superior a un segundo. Repita este procedimiento para cada color de fluorescencia que se vaya a imaginar y para cada campo de visión por separado.

Para obtener imágenes de la máxima calidad, ajuste los límites superior e inferior del Zack modificando ligeramente el enfoque justo por encima y por debajo de la muestra celular, respectivamente. El número total de imágenes en una pila Z determinada estará así definido por estos límites y por el espaciado entre capas. Para minimizar los artefactos de movimiento durante la adquisición de imágenes, el modo de adquisición de imágenes puede configurarse por longitud de onda.

Luego, pila ZS para muestras fijadas y pila ZS seguida de longitud de onda para muestras vivas. Una vez establecidos todos los parámetros, se pueden adquirir las imágenes de fluorescencia. Las imágenes de fluorescencia luego se procesan usando SoftWorX y posteriormente se analizan usando Velocity.

La secuencia de imágenes mostrada aquí muestra los cambios físicos que ocurren en las células cwr 22 durante los primeros 80 minutos de inducción de la autofagia. En estas imágenes, la línea punteada blanca representa el contorno de la célula y la región sombreada más clara representa la posición del núcleo. A lo largo de 80 minutos, las imágenes revelan el desplazamiento del núcleo desde el centro de la célula, la reducción de los puntos de adhesión focal y la translocación general de los autosomas y los lisosomas hacia el centro de la célula, mostrados aquí en verde y rojo respectivamente en puntos temporales posteriores.

Se observó también un pequeño aumento en la colocalización entre autosomas y lisosomas, indicado por el color amarillo. Luego, se utilizó el conjunto de aplicaciones de imagen digital Velocity para identificar, contar y recopilar datos estadísticos sobre los autosomas y lisosomas marcados en las imágenes de las células CWR 22. Aquí se muestra que el número y tamaño de los autosomas después de su formación inicial y aparición varían con el tiempo.

Después de 80 minutos de inducción de la autofagia, se observó una disminución gradual y progresiva en el número de autofagosomas, con un aumento correspondiente en el tamaño promedio de los mismos. Además, hubo un aumento medible en la colocalización de los autofagosomas y los lisosomas, según el análisis del coeficiente de correlación de Pearson. En conjunto, estos hallazgos sugieren que, tras la estimulación de la autofagia, numerosos autofagosomas pequeños se fusionan para formar autofagosomas más grandes con el tiempo.

Se muestra aquí una comparación lado a lado de imágenes adquiridas y reconstruidas en modo DV, deconvolución de campo amplio simulada frente a modo de iluminación estructurada. Mediante el microscopio OMX, la resolución lateral se mejoró hasta 120 nanómetros, el doble de la resolución de la microscopía convencional limitada por difracción. La colocalización a pequeña escala de autosomas y lisosomas fue claramente evidente con microscopía de superresolución, mientras que apenas era perceptible con imágenes de fluorescencia convencionales.

Una de las ventajas de utilizar microscopía de desconvolución es reconstruir todas las imágenes en un modelo 3D que revelará información espacial más precisa entre diferentes moléculas. Aquí se muestra una imagen general de una célula Cwr 22 RV1 en proceso de autofagia en un punto temporal posterior, donde comienza a ocurrir una cantidad significativa de colocalización entre autofagosomas y lisosomas. La tinción coherente indicada en color blanco revela el contorno de la célula diana en esta película.

El modelo reconstruido en 3D proporciona más detalles espaciales sobre la fusión entre autosomas y lisosomas. Como se indica en color amarillo, la interacción entre las señales verdes de la cadena ligera tres y las señales rojas de los lisosomas es evidente por la presencia de señales fusionadas que producen color amarillo. Por lo tanto, este enfoque abordará dos desafíos principales para los investigadores que estudian la autofagia.

En primer lugar, deseamos mantener un entorno libre de estrés utilizando un fluido microbiano y la cámara de perfusión para conservar su condición fisiológica original sobre la platina del microscopio. El segundo desafío consiste en recopilar datos cuantitativos de imágenes estadísticamente relevantes; para las células fijas, normalmente tomamos muchas imágenes de diferentes células y las compilamos en información útil. Sin embargo, con células vivas, simplemente seguimos una sola célula a lo largo del tiempo para obtener información equivalente.

Por lo tanto, creemos que esta técnica permitirá a otros investigadores estudiar la función y el papel de la autofagia en diferentes órganos y distintas enfermedades.