Análisis cuantitativo de la autofagia mediante microscopía de fluorescencia avanzada 3D

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes cuantitativas de las células tumorales de próstata tratadas para medir el grado y la extensión de la autofagia en diferentes momentos. Esto se logra tratando primero las células con arginina, dase u otros reactivos experimentales para inducir la autofagia o la muerte celular. El segundo paso es decidir si se van a obtener imágenes de células vivas o células fijas y preparar las muestras en consecuencia.

A continuación, obtenga imágenes de fluorescencia en 3D de células vivas o fijas mediante microscopía de fluorescencia de campo amplio, deconvolución o iluminación estructurada. El paso final es recopilar datos estadísticos sobre la distribución del tamaño de los autofagosomas y la colocalización con otras estructuras intracelulares. Utilizando software de análisis de imágenes digitales en 3D, este enfoque puede obtener resultados que muestran no solo que la inducción automática de fagos por arginina dase puede causar la muerte de las células tumorales de próstata, sino también que estas células exhiben cambios estructurales que son morfológicamente distintos de los cambios asociados con la apoptosis y la necrosis.

La principal ventaja de esta técnica sobre otros métodos existentes actualmente es que las imágenes cuantitativas en 3D pueden mostrar cuándo y dónde ocurre un evento molecular específico dentro de una célula viva y luego presentarlo en un formato tridimensional Para comenzar a cultivar células de cáncer de próstata humano que expresan proteína fluorescente verde, se deben colocar células de tres cadenas ligeras acopladas en placas de cultivo con fondo de vidrio recubiertas de poli de licina de 35 milímetros, como se describe en el protocolo de texto. a una densidad suficiente para facilitar una rápida proliferación, pero no tanto como para que las células crezcan demasiado y se agrupen en el momento de la toma de imágenes. Trate las muestras de células seleccionadas con arginina dase o un DI en PBS para agotar las células de arginina libre e inducir estrés metabólico en las células cancerosas aproximadamente una hora antes de la obtención de imágenes: diluya 1,5 microlitros de Lyo tracker rojo con 20 mililitros de RPMI que contenga 10% de FPS y 1% de antibióticos. Prepare soluciones con un DI para las muestras seleccionadas que se trataron después de calentar todos los medios a 37 grados Celsius.

Agregue el medio apropiado a cada placa de cultivo e incube las células con RPMI que contengan LYO Tracker rojo durante 15 a 45 minutos a 37 grados Celsius, aproximadamente 30 minutos antes de la toma de imágenes. Encienda el recinto ambiental de la estación meteorológica y permita el equilibrio a 37 grados centígrados y 5% de celdas de lavado de dióxido de carbono con PBS y reemplace los medios con RPMI estándar que contengan solo 10% de FBS y 1% de antibióticos. Agregue un DI a las muestras como se indica.

Monta placas de cultivo con fondo de vidrio de 35 milímetros en un adaptador personalizado. Utilice aceite de inmersión en la lente del objetivo de apertura numérica de 1,42 aumentos de seis DX y coloque la placa de cultivo montada en la platina del microscopio. En este vídeo, se muestra la microscopía 3D utilizando el microscopio de posición aplicada IDV personal de Delta Vision, el microscopio de deconvolución y el conjunto de aplicaciones Associated Soft Works.

Para comenzar, encienda el sistema de microscopio, incluida la estación de trabajo de adquisición y el controlador del instrumento. Abra la aplicación de control de computadora resolve 3D para inicializar la etapa del microscopio y encender la fuente de luz de xenón. Espere 10 minutos para que la fuente de luz se caliente y alcance condiciones estables.

Agregue una gota de aceite de inmersión en la lente del objetivo de apertura numérica de 1.42 y seis aumentos DX y centre la muestra de diapositiva con la cubierta hacia abajo sobre la lente del objetivo utilizando iluminación externa o de campo claro, así como el enfoque grueso. La perilla de ajuste levanta lentamente la lente del objetivo hasta que el golpe del aceite de inmersión haga contacto con el vidrio invertido. A partir de este punto, la capa de celda debería enfocarse a las pocas vueltas de la perilla de ajuste de enfoque fino.

Cuando se trabaja con muestras fijas en los portaobjetos, se recomienda evitar las celdas dentro o cerca de cualquier área con burbujas. Cuando vea con muestras vivas en el plato con fondo de vidrio, evite mover la lente del objetivo fuera del límite del cubreobjetos de vidrio. Seleccione el campo de visión deseado.

Idealmente, las células deben exhibir una buena señal fluorescente en todos los canales apropiados y estar lo suficientemente adheridas y dispersas en la superficie del cubreobjetos para que el contenido intracelular sea fácil de visualizar. Los pequeños ajustes en el enfoque lateral X, Y y Z pueden ser controlados por la computadora utilizando la interfaz 3D de adquisición. Configure el benning de uno en uno o de dos en dos según el campo de visión deseado para una imagen dada a través de la sección media de una celda, configure los parámetros de exposición de modo que la intensidad máxima de píxeles no exceda las 3000 cuentas.

En general, el porcentaje de transmisión debe establecerse lo más bajo posible sin aumentar la exposición correspondiente. Tiempo superior a un segundo. Repita este procedimiento para cada color de fluorescencia que se vaya a obtener y para cada campo de visión por separado.

Para obtener imágenes de la más alta calidad, establezca los límites superior e inferior del Zack ajustando el enfoque ligeramente sobre la parte superior e inferior de la muestra de celda, respectivamente. Por lo tanto, el número total de imágenes en una pila Z dada estará determinado por estos límites y por el espaciado entre capas. Para minimizar los artefactos de movimiento durante la adquisición de imágenes, el modo de adquisición de imágenes se puede establecer en longitud de onda.

A continuación, la pila ZS para muestras fijas y la pila ZS y luego la longitud de onda para muestras vivas. Una vez configurados todos los parámetros, se pueden adquirir las imágenes de fluorescencia. A continuación, las imágenes de fluorescencia se involucionan utilizando trabajos blandos y luego se analizan utilizando la velocidad.

La secuencia de imágenes que se muestra aquí muestra los cambios físicos que ocurren en las células cwr 22 durante los primeros 80 minutos de inducción de la autofagia. En estas imágenes, la línea punteada blanca representa el contorno de la célula y la región sombreada por la luz representa la posición del núcleo. En el transcurso de 80 minutos, las imágenes revelan el desplazamiento del núcleo lejos del centro de la célula, la reducción de los puntos de adhesión focal y la translocación general de autosomas y lisosomas hacia el centro de la célula, que se muestran aquí en verde y rojo respectivamente en puntos de tiempo posteriores.

También se observó un pequeño aumento en la colocalización entre autosomas y lisosomas, como lo indica el color amarillo. A continuación, se utilizó el conjunto de aplicaciones de imágenes digitales de velocidad para identificar, contar y recopilar datos estadísticos sobre autosomas y lisosomas marcados en las imágenes de las células CWR 22. Como se muestra aquí, el número y el tamaño de los autosomas después de su formación inicial en el momento de su aparición varían con el tiempo.

Después de 80 minutos de inducción de la autofagia, hubo una disminución neta gradual en el número de autosomas con un aumento correspondiente en el tamaño promedio de los autosomas. Además, hubo un aumento medible en la colocalización de los autosomas y lisosomas según el análisis del coeficiente de correlación de Pearson. En conjunto, estos hallazgos sugirieron que, tras la estimulación de la autofagia, numerosos autosomas pequeños se fusionaron para formar autosomas más grandes con el tiempo.

Aquí se muestra una comparación lado a lado de las imágenes adquiridas y reconstruidas en el modo DV, la deconvolución de campo amplio simulada frente al modo de iluminación estructurada. Utilizando el microscopio OMX, la resolución lateral se mejoró hasta 120 nanómetros, el doble de la resolución de la microscopía convencional de difracción limitada. La colocalización a pequeña escala de autosomas y lisosomas fue claramente evidente con la microscopía de súper resolución, mientras que apenas lo fue con las imágenes de fluorescencia convencionales.

Una de las ventajas de utilizar la microscopía de deconvolución es reconstruir todas las imágenes en un modelo 3D que revelará información espacial más precisa entre las diferentes moléculas. Aquí se muestra una imagen general de una célula Cwr 22 RV en autofagia en un momento posterior donde comienza a ocurrir una cantidad significativa de colocalización entre autosomas y lisosomas. La tinción coherente e, como se indica en color blanco, revela el contorno de la célula objetivo en esta película.

El modelo reconstruido en 3D proporciona más detalles espaciales de la fusión entre autosomas y lisosomas. Como se indica en color amarillo, la interacción entre las señales de la cadena de luz verde tres y las señales de lisosoma rojo es evidente en presencia de las señales fusionadas para producir amarillo. Por lo tanto, este enfoque abordará dos grandes desafíos para los investigadores con estudios de autofagia.

En primer lugar, queremos mantener un entorno libre de estrés mediante el uso de microfluido, la cámara de profusión, para mantener su condición fisiológica original en las etapas del microscopio. El segundo desafío es recopilar datos de imágenes cuantitativas estadísticamente relevantes y, para las celdas fijas, generalmente tomamos muchas imágenes de diferentes celdas y las compilamos en información útil. Sin embargo, con la célula de vida, solo seguimos una célula a lo largo del tiempo para adquirir información equivalente.

Por lo tanto, creemos que esta técnica permitirá a otros investigadores estudiar la función y el papel de la autofagia en diferentes órganos y diferentes enfermedades.