Name: El aislamiento de miocitos auriculares humanos para la medición simultánea de Ca 2 + Transitorios y corrientes de membrana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Aprende a aislar miocitos auriculares humanos para medir transitorios de calcio y corrientes de membrana simultáneamente. Este método permite estudiar la fisiología cardíaca y enfermedades como la fibrilación auricular.

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Además, agradecemos a los cirujanos cardiacos en la Universidad de Heidelberg para la prestación de tejido auricular humano y Claudia Liebetrau, Katrin Kupser y Ramona Nagel por su excelente apoyo técnico. Un agradecimiento especial también a Andy W. Trafford por sus útiles sugerencias y consejos durante el establecimiento de las medidas transitorias 2 + Ca. Los autores desean expresar su más profundo agradecimiento a los miembros del Departamento de Farmacología y Toxicología (cabeza: Ursula Ravens) de la Universidad Técnica de Dresde por la oportunidad que nos ofrecen para aprender las técnicas básicas y habilidades en electrofisiología celular y el aislamiento de cardiomiocitos. Investigación de los autores con el apoyo de la Fundación Alemana para la Investigación (Do769/1-1-3), el Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación a través de la red de competencia Fibrilación Atrial (01Gi0204) y el Centro Alemán de Investigación Cardiovascular, la Unión Europea a través de la ueRed ropeo de Investigación Traslacional en la fibrilación auricular (EUTRAF, FP7-HEALTH-2010, el proyecto de integración a gran escala, la Propuesta N º 261057) y la Alianza para la Investigación Fibrilación Atrial Europa-América del Norte (ENAFRA) concesión de Fondation Leducq (07CVD03). La visión esquemática se muestra en el archivo de vídeo se produjo usando técnica médica Servier.

Los protocolos experimentales deben ser aprobados por el comité de ética local y todos los pacientes deben dar su consentimiento informado por escrito. Nuestra investigación fue aprobado por el comité de ética de la Facultad de Medicina de Mannheim, Universidad de Heidelberg (# 2011-216N-MA) y se llevó a cabo de acuerdo con todas las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito. 0. Obtención de tejido auricular humano Durante los procedimientos de canulación de rutina en pacientes sometidos a cirugía a corazón abierto para injerto de bypass cardiopulmonar, la punta del apéndice auricular derecho generalmente se extirpa y se puede utilizar para el aislamiento de miocitos auriculares. Después de la escisión de la muestra de tejido se transfiere inmediatamente a un tubo de 50 ml Falcon estéril con Ca 2 + sin solución de transporte que contiene 2,3-butanodiona monoxima (Tabla I; BDM, inhibidor de la contracción, la prevención de los miocitos contracture). Con tiempos de transporte entre los 30 y 45 min, no reconocimos una clara ventaja de refrigeración u oxigenación con respecto al número y calidad de los miocitos auriculares aislados. En general de transporte al laboratorio debe ser lo más rápido posible. Sin embargo, si es más largo el tiempo de transporte no se puede evitar, de transporte a 4 ° C en solución oxigenada podría ser ventajoso. 1. Prearrangements <ol><li> Encender el thermocirculator, que controla la temperatura del vaso de precipitados con camisa (Tabla II). Asegúrese de que la temperatura dentro del recipiente es igual a 37 ° C. Cubrir el vaso con una tapa de vidrio para mantener una temperatura constante dentro del vaso de precipitados a lo largo de todo el proceso de aislamiento. </li><li> Pese la colagenasa I y XXIV proteasa en tres vasos de vidrio y guárdelo a temperatura ambiente. Las enzimas se diluyeron justo antes de su uso. </li><li> Tienda 20 ml de Ca 2 + solución libre en una placa de Petri a 4 ° C. </li><li>Tienda 250 ml de Ca 2 + solución libre en un baño de agua a 37 ° C. </li></ol> 2. Limpieza del tejido <ol><li> Transferir la muestra de tejido, junto con la solución de transporte en una placa de Petri (~ 10 cm de diámetro) y eliminar el tejido graso utilizando más o menos unas tijeras. </li><li> Pesar la muestra de tejido. Entre 200 y 600 mg se utilizan para el aislamiento de células. El tejido restante se puede congelar en nitrógeno líquido para su posterior análisis bioquímico. </li><li> Transferir la muestra de tejido en la placa de Petri que contiene 20 ml de solución de Ca 2 + libre a 4 º C (véase el paso 1.3) y cortar la muestra de tejido en trozos pequeños de aproximadamente 1 mm de tamaño 3. </li><li> Los siguientes pasos deben ser ejecutados a 37 ° C y bajo gasificación continua con O2 al 100%. Una punta de la pipeta se puede colocar sobre el tubo de oxígeno para evitar la fuerte burbujeo y generar un flujo de aire continuo. </li><li> La transferencia de los trozos de tejido junto con la solución 2 + libre de Ca enal vaso de precipitados con camisa y se agita cuidadosamente durante aproximadamente 3 minutos con una barra de agitación magnética. </li><li> Detener la agitación y permitir que los trozos de tejido para establecerse durante unos segundos. Colar con cuidado el sobrenadante a través de una malla de nylon (200 micras, Tabla II). Volver a los trozos de tejido restringidas de la malla en el vaso con unas pinzas. </li><li> Vuelva a llenar el vaso con Ca 2 + solución gratuita y repetir la etapa de lavado 2,4 y 2,5 dos veces. </li></ol> 3. En primer lugar la digestión enzimática <ol><li> Vuelva a suspender los trozos de tejido con 20 ml de solución de enzima E1 (Tabla I) que contiene colagenasa y proteasa y se agita cuidadosamente durante 10 min. </li><li> Añadir 40 l de 10 mM CaCl 2-solución para obtener una concentración final de 20 mM Ca 2 +. </li><li> Después de 35 min la cepa cuidadosamente el sobrenadante a través de una malla de nylon (200 micras, Tabla II) de una manera que la mayor parte de los trozos de tejido permanecen en el vaso de precipitados. Volver restollovió trozos de tejido de la malla en el vaso de precipitados. </li></ol> 4. En segundo lugar digestión enzimática <ol><li> Resuspender los trozos de tejido de nuevo con 20 ml de solución de enzima E2 que contiene colagenasa I sólo (Tabla I). Añadir 40 l de 10 mM CaCl 2-solución inmediatamente para obtener una concentración final de 20 mM Ca 2 +. </li><li> Durante el segundo tijeras para cortar el uso de digestión más coágulos tejido ocasionalmente. </li><li> Después de 5 minutos tomar una muestra con una pipeta Pasteur para comprobar la disociación de las células. Repita esto cada 2-3 minutos hasta que aparezcan en forma de barra, cardiomiocitos estriados. </li><li> Detener la agitación y permitir que los trozos de tejido que se establecen por unos 20 a 30 segundos. </li><li> Colar el líquido sobrenadante con cuidado a través de una malla de nylon (200 m, Tabla II) en un tubo de 50 ml Falcon (Tubo A). Volver a los trozos de tejido restringidas de la malla en el vaso. </li><li> Vuelva a suspender los trozos de tejido en el vaso con 20 ml Storasolución de GE (Tabla I) 10 y disociar aún más las células por trituración mecánica suave con una pipeta serológica de 20 ml con dispensador. Trate de evitar la formación de burbujas ya que las burbujas son perjudiciales para la supervivencia celular y la calidad. </li><li> Colar el líquido sobrenadante con cuidado a través de una malla de nylon (200 m, Tabla II) en un tubo de 50 ml Falcon (Tubo B). </li></ol> 5. Preparación final y ajuste final de Ca 2 + de concentración <ol><li> Centrifugar tanto en tubos Falcon de A y B (véase el paso 4.5 y 4.7) a 95 xg durante 10 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante de ambos tubos cuidadosamente por aspiración. Asegúrese de no perturbar el sedimento. Descartar el sobrenadante. </li><li> Vuelva a suspender las dos pastillas de 1,5 ml solución de almacenamiento (Tabla I) cada uno (temperatura ambiente). </li><li> Agregue dos veces 7,5 l de solución de 10 mM CaCl 2 a cada Falcon y remover con cuidado. Incubar durante 10 min después de cada paso. </li><li>Añadir 15 l de solución 10 mM de CaCl2 para obtener una final concentración de Ca2 + de 0,2 mM. </li></ol> 6. Carga de los miocitos con el Ca 2 +-fluorescente indicador Fluo-3 AM (Figura 1) <ol><li> Transferir 1,5 ml de suspensión celular (tubo A y / o el tubo B) en un tubo de microcentrífuga de 2 ml (tubo Eppendorf). </li><li> Los siguientes pasos deben ser ejecutados bajo la consideración de la sensibilidad a la luz del fluorescente de Ca 2 + Indicador Fluo-3. </li><li> Disolver 50 g de la membrana permeable derivado de éster de acetoximetilo de Fluo-3 (Fluo-3 AM, Tabla III) en 44 l de Pluronic F-127 (Tabla III) solución madre (20% w / v en DMSO anhidro) para conseguir un 1 mM de Fluo-3 a.m. solución madre, que puede ser almacenado a -20 ° C durante un máximo de 1 semana. </li><li> Añadir 15 l de la Fluo-3 a.m. solución madre al tubo de microcentrífuga que contiene 1,5 ml de suspensión de células (véase el paso 6.1) y agitarcuidadosamente. </li><li> Incubar la suspensión de células durante 10 min en una caja ópticamente opaca. </li><li> Centrifugar brevemente a aproximadamente 6.000 rpm. </li><li> Descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1,5 ml de solución de baño (Tabla IV). </li><li> Agregar la suspensión de células durante aproximadamente 30 min para la de-esterificación antes de comenzar con los experimentos. </li></ol> 7. Patch-clamp y epifluorescencia Ca 2 + mediciones simultáneas Dado que las mediciones de patch-clamp no son el tema principal de esta revisión, remitimos al lector interesado a otras publicaciones que proporcionan una descripción más profunda de esta técnica. 11-14 En aras de la exhaustividad, se proporciona un breve resumen de un protocolo para medir potenciales de acción o L-tipo Ca 2 + corrientes, ambos junto con grabaciones simultáneas Ca 2 +-transitorios. Durante los experimentos miocitos se superfundieron a 37 ° C con bañera solutien (Tabla IV) usando un sistema de perfusión rápida (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY). Para los experimentos de fijación de voltaje, corrientes de K + se bloquean mediante la adición de 4-aminopiridina (5 mmol / L) y BaCl 2 (0,1 mmol / L) a la solución del baño. Microelectrodos de vidrio de borosilicato se utilizan y deben inclinar han resistencias de 2-5 mW cuando se llena con la solución de la pipeta (Tabla V). Además de la Fluo-3 a.m. carga de los miocitos (vea el paso 6), Fluo-3 también se incluye en la solución de la pipeta (Tabla V). Fluorescencia se excita a 488 nm y la luz emitida (&lt;520 nm) convierte en [Ca 2 +] i suponiendo <img alt="Ecuación 1" fo:content-width="1.540in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1.jpg" /> donde k d = constante de disociación de Fluo-3 (864 nM), F = Fluo-3 fluorescencia;. F max = Ca 2 +-saturada de fluorescencia obtenido al final de cada experimento 12 Ambas señales eléctricas y señales de Ca 2 + epifluorescencia se registran simultáneamente. Los potenciales de acción son estimulados a 0,5 Hz en modo de corriente-clamp con 1 ms pulsos de corriente de fuerza umbral de 1,2 x. De tipo L Ca 2 +-corrientes se miden en el modo de fijación de voltaje con un potencial de mantenimiento de -80 mV y una rampa de 100 mseg-pulso a -40 mV para inactivar el ayuno de Na +-corriente, seguido de un 100-mseg prueba de pulso a 10 mV a 0,5 Hz.

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</ol>

Worthington Biochemical Corp. apoyó esta publicación cubriendo los costos de producción del archivo de vídeo. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.

Aquí se describe un método para el aislamiento de miocitos auriculares humanos de apéndices auriculares adecuados obtenidos a partir de pacientes sometidos a cirugía de corazón abierto. Para utilizar estos miocitos para las mediciones de citosólica de Ca 2 + se adaptó un método descrito previamente 4-11 omitiendo EGTA de la solución de almacenamiento. Ya en 1970 se observó que a pesar de los miocitos se disocian en presencia de Ca 2 + durante la digestión, todos ellos estaban en la contractura y no viables. 16,17 Por lo tanto, el aislamiento de células se realiza en solución de Ca 2 + libre. Sin embargo, la re-introducción de concentraciones fisiológicas de Ca 2 + se tradujo en un rápido Ca 2 + afluencia y la muerte celular. Esto ha sido descrito como el fenómeno de Ca 2 + paradoja que se observó originalmente en corazones perfundidos por Zimmerman y Hulsman. 18 Las modificaciones de los medios de aislamiento, incluyendo la reducción del pH a 7,0, &lt;sup&gt; 19 adición de taurina 20 o de pequeñas cantidades de Ca 2 + (véase el paso 3.2 y 4.1), 21 así como almacenamiento de miocitos aislados en almacenamiento que contienen EGTA-solución 22 se han sugerido para evitar que el Ca 2 + paradoja. 17 Sin embargo, es bien sabido que el Ca 2 + tampón a través de EGTA reduce la amplitud de la L-tipo Ca 2 + Ca 2 + inducida por la corriente amplitudes de transitorios y los resultados en un decaimiento bifásica de los transitorios de Ca 2 +. 23 Por lo tanto, hemos omitido EGTA lo largo de todo el proceso de aislamiento con el fin de obtener Ca 2 + transitorios con las propiedades típicas y decae monofásicos. Para proteger las células de la Ca 2 + paradoja aumentamos el final de concentración de Ca2 + de la solución de almacenamiento de una manera escalonada hasta 0,2 mM. La elección de la colagenasa es probablemente el paso más crítico para el aislamiento de miocitos éxito. Coll convencionalagenases son preparaciones crudas obtenidas a partir de Clostridium histolyticum y contienen colagenasa, además de un número de otras proteinasas, polisacaridasas y lipasas. Con base en sus colagenasas generales de composición se subdividen en distintos tipos. 24 Worthington colagenasa tipo I y II se han utilizado con éxito para el aislamiento de los miocitos auriculares humanos. 4-10,15,25-30 En el protocolo descrito actualmente se recomienda el uso de colagenasa Tipo I, aunque también hemos sido capaces de obtener cantidades aceptables de células viables utilizando colagenasa tipo II. Sin embargo, incluso dentro de un solo tipo colagenasa hay una variación de lote a lote significativa con respecto a las actividades enzimáticas. Estas variaciones requieren la selección de lote y comprobar cuidadosamente los diversos lotes para optimizar el procedimiento de aislamiento. La herramienta dispone de lotes de selección en línea de Worthington Biochemical Corp. ( <a href="http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php" target="_blank">http://www.worthington-bio</a>chem.com / cls / match.php) puede ser usado para encontrar los lotes disponibles con una composición que ha demostrado ser adecuado para el aislamiento de miocitos auriculares humanos. Actualmente utilizamos colagenasa tipo I con 250 U / mg de actividad de la colagenasa, U / mg de actividad caseinase 345 U / mg de actividad clostripaína 2,16 y 0,48 U / mg de actividad tríptico (lote # 49H11338). Las células obtenidas usando el procedimiento descrito en este manuscrito se pueden utilizar dentro de 8 horas para los estudios de patch-clamp, Ca 2 + mediciones de transitorios y una combinación de ambos. 15 Además, estas células permiten mediciones de la contracción celular en respuesta a la estimulación de campo eléctrico o la estimulación eléctrica utilizando la pipeta de patch-clamp (observaciones no publicadas).

El estudio de las propiedades electrofisiológicas de los canales iónicos cardíacos con la técnica de patch-clamp y la exploración de Ca2 + celular anomalías de manejo requieren cardiomiocitos aislados. Estos se obtienen normalmente después de la exposición in vitro de muestras de tejidos cardiacos a las enzimas digestivas (colagenasa, hialuronidasa, peptidasa, etc). Desde el primer informe de aislamiento de los miocitos cardíacos viables en 1955 2 una gran cantidad de protocolos ha sido desarrollado con el fin de cosechar individuales cardiomiocitos auriculares y ventriculares a partir de diferentes especies, incluyendo ratón, rata, conejo, perro, conejillo de indias y humanos. En esta revisión, nos centramos en el aislamiento de los miocitos auriculares humanos. En cuanto a los procedimientos para el aislamiento de los miocitos de otras especies nos referimos a la &quot;Worthington Tissue disociación guía&quot; proporcionada por Worthington Biochemical Corp., EE.UU. ( <a href="http://www.tissuedissociation.com" target="_blank">www.tissuedissociation.com</a> ). et al. 3 A continuación presentamos una descripción paso a paso de una técnica, la cual está adaptada a partir de un método publicado previamente, con el fin de obtener miocitos auriculares adecuados no sólo para los experimentos de patch-clamp, sino también por Ca 2 + intracelular mediciones simultáneas. 4-11

<table><tbody><tr><td> </td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Solución de transporte&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Albúmina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td>&lt;em&gt;Solución de almacenamiento&lt;/em&gt;: 1%</td></tr><tr><td>BDM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31550</td><td>&lt;em&gt;Solución de transporte&lt;/em&gt;: 30</td></tr><tr><td>DL-b-Hidroxibutírico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6501</td><td>&lt;em&gt;Solución de almacenamiento&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;Solución de transporte&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solución libre de Ca2+&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solución enzimática E1 y E2&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solución de almacenamiento&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>Ácido L-glutámico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1251</td><td>&lt;em&gt;Solución de almacenamiento&lt;/em&gt;: 70</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Solución de transporte&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solución libre de Ca2+&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solución enzimática E1 y E2&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solución de almacenamiento&lt;/em&gt;: 20</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>&lt;em&gt;Solución de transporte&lt;/em&gt;: 1,2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solución libre de Ca2+&lt;/em&gt;: 1,2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solución enzimática E1 y E2&lt;/em&gt;: 1,2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solución de almacenamiento&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9397</td><td>&lt;em&gt;Solución de transporte&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solución libre de Ca2+&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solución enzimática E1 y E2&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td>&lt;em&gt;Solución de transporte&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solución libre de Ca2+&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solución enzimática E1 y E2&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;Solución de transporte&lt;/em&gt;: 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solución libre de Ca2+&lt;/em&gt;: 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solución enzimática E1 y E2&lt;/em&gt;: 100</td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86330</td><td>&lt;em&gt;Solución de transporte&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solución libre de Ca2+&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solución enzimática E1 y E2&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solución de almacenamiento&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>Colagenasa I</td><td><a href="http://www.worthington-biochem.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Worthington</a></td><td>4196</td><td>&lt;em&gt;Solución enzimática E1 y E2&lt;/em&gt;: 286 U/ml</td></tr><tr><td>Proteasa XXIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8038</td><td>&lt;em&gt;Solución enzimática E1 y E2&lt;/em&gt;: 5 U/ml*</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Solución de transporte&lt;/em&gt;: 7,00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solución libre de Ca2+&lt;/em&gt;: 7,00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solución enzimática E1 y E2&lt;/em&gt;: 7,00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solución de almacenamiento&lt;/em&gt;: 7,40</td></tr><tr><td>Ajustado con</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Solución de transporte&lt;/em&gt;: NaOH 1 M&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solución libre de Ca2+&lt;/em&gt;: NaOH 1 M&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solución enzimática E1 y E2&lt;/em&gt;: NaOH 1 M&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solución de almacenamiento&lt;/em&gt;: KOH 1 M</td></tr><tr><td colspan="4">Las concentraciones están en mM salvo que se indique lo contrario. BDM, monoxima de 2,3-butanodiona. *La proteasa XXIV se incluye solo en la solución enzimática E1.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabla I. Soluciones.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Malla de nailon (200 &amp;#956;m)</td><td>VWR-Alemania</td><td>510-9527</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de reacción con camisa</td><td>VWR</td><td>KT317000-0050</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabla II. Equipos específicos.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM (envase especial)</td><td>Invitrogen</td><td>F-1242</td><td></td></tr><tr><td>Plurónico F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabla III. Sustancias para la carga de miocitos con Fluo-3 AM.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-aminopiridina*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A78403</td><td>&lt;em&gt;Solución de baño&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>BaCl2*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342920</td><td>&lt;em&gt;Solución de baño&lt;/em&gt;: 0,1</td></tr><tr><td>CaCl2 &amp;#215; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td>&lt;em&gt;Solución de baño&lt;/em&gt;: 2</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;Solución de baño&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;Solución de baño&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Solución de baño&lt;/em&gt;: 4</td></tr><tr><td>MgCl &amp;#215; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td>&lt;em&gt;Solución de baño&lt;/em&gt;: 1</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;Solución de baño&lt;/em&gt;: 140</td></tr><tr><td>Probenecida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761</td><td>&lt;em&gt;Solución de baño&lt;/em&gt;: 2</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Solución de baño&lt;/em&gt;: 7,35</td></tr><tr><td>Ajustado con</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Solución de baño&lt;/em&gt;: HCl 1 M</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabla IV. Solución de baño para el registro de parche.&lt;/strong&gt; *La 4-aminopiridina y el BaCl2 se incluyeron solo para experimentos de fijación de voltaje.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sal potásica del DL-aspartato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2025</td><td>&lt;em&gt;Solución de pipeta&lt;/em&gt;: 92</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>&lt;em&gt;Solución de pipeta&lt;/em&gt;: 0,02</td></tr><tr><td>GTP-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9002</td><td>&lt;em&gt;Solución de pipeta&lt;/em&gt;: 0,1</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;Solución de pipeta&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Solución de pipeta&lt;/em&gt;: 48</td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>&lt;em&gt;Solución de pipeta&lt;/em&gt;: 1</td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td>&lt;em&gt;Solución de pipeta&lt;/em&gt;: 4</td></tr><tr><td>Fluo-3**</td><td>Invitrogen</td><td>F3715</td><td>&lt;em&gt;Solución de pipeta&lt;/em&gt;: 0,1</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>7,20</td></tr><tr><td>Ajustado con</td><td></td><td></td><td>KOH 1 M</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabla V. Solución de pipeta para el registro de parche*. &lt;/strong&gt;*En los días experimentales, la solución de pipeta se mantiene en hielo hasta su uso. **El Fluo-3 se añade a partir de una solución madre de 1 mM en los días experimentales.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

el aislamiento de miocitos auriculares humanos para la medición simultánea de ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; transitorios y corrientes de membrana

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

El estudio de las propiedades electrofisiológicas de los canales iónicos cardíacos con la técnica de patch-clamp y la exploración de celular cardiaca Ca 2 + anomalías manejo requiere cardiomiocitos aislados. Además, la posibilidad de investigar los miocitos de los pacientes que utilizan estas técnicas es un requisito muy valiosa para dilucidar la base molecular de las enfermedades cardiacas tales como la fibrilación auricular (FA). 1 Aquí se describe un método para el aislamiento de miocitos auriculares humanos que son adecuados para ambos estudios de patch-clamp y mediciones simultáneas de 2 concentraciones de Ca + intracelular. En primer lugar, apéndices auriculares adecuados obtenidos de pacientes sometidos a cirugía a corazón abierto se cortan en trozos pequeños de tejido (&quot;método trozo&quot;) y se lavaron en solución de Ca 2 + libre. A continuación, los trozos de tejidos se digieren en colagenasa y proteasa que contiene soluciones con 20 mM de Ca 2 +. A partir de entonces, los miocitos aislados son harvested por filtración y la centrifugación de la suspensión de tejido. Por último, la concentración de Ca2 + en la solución de almacenamiento celular se ajusta paso a paso a 0,2 mM. Se discute brevemente el significado de Ca 2 + y Ca 2 + amortiguación durante el proceso de aislamiento y también proporcionar grabaciones representativas de los potenciales de acción y las corrientes de membrana, tanto con simultánea Ca 2 + transitorios mediciones, realizadas en estos miocitos aislados.

Figura 2A muestra tres ejemplos representativos de miocitos aislados de aurícula derecha. Para cuantificar el rendimiento de células que pipeta de 10 l de suspensión celular (paso 5.5) en un portaobjetos CellFinder ( <a href="http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html" target="_blank">http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html</a> ). Rendimientos celulares promediados en la Figura 2B indican claramente que hay una tendencia a la baja en los rendimientos celulares FA crónica (CAF) muestras de pacientes (tubo A: 16,5 ± 3,1 células/10 l (n = 29) vs 5.1 ± 2.3 l células/10 (n = 10) en la SR y la CAF, respectivamente, p &lt;0,05; tubo B: 17,9 ± 3,9 células/10 l (n = 29) frente a 5,9 ± 2,0 células/10 l (n = 9) en SR y la CAF, respectivamente, p = 0,107). Los ejemplos representativos de las mediciones del potencial de acción y grabaciones simultáneas de citosólica de Ca 2 + transitorios se dan en la Figura 3. En aproximadamente el 90% de las células investigadas, tque la acción potencial desencadenado Ca 2 + en libertad hace que las contracciones de células claras y regulares. Como se informó anteriormente, el potencial de membrana en reposo, que es un indicador aceptado de la integridad celular, promedio de alrededor de -73,9 ± 2,7 mV (n = 23/10 / miocitos pacientes) y -77,7 ± 1,8 mV (n = 19/8 / miocitos pacientes ) en la SR y la CAF, respectivamente (p&gt; 0,05). 15 Figura 4 muestra grabaciones simultáneas representativas de voltaje de tipo L de Ca 2 + corrientes y citosólica de Ca 2 + transitorios. Aplicación de la isoprenalina agonista β-adrenérgico no selectivo (1 M) aumenta amplitudes de ambas Ca I, L y citosólica de Ca 2 + transitorios, lo que sugiere intacta β-adrenérgico cascada de transducción de señal. <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama de flujo de los miocitos Fluo-03 a.m. cargando protocolo (véase el paso 6.1 a 6.5). m / v, masa / volumen. <img alt="La figura 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2.jpg" /> Figura 2. A, miocitos aislados de aurícula derecha después de una hora en una solución de almacenamiento. B, Media ± SEM del rendimiento de células contadas en 10 l de células en solución de almacenamiento (véase el paso 5.5). n se refiere al número de preparaciones dentro de cada grupo. * P &lt;0,05. <img alt="Figura 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3.jpg" /> Figura 3. Grabaciones representativas del potencial de acción activada por Ca 2 +-transitorios (CAT) en un miocito auricular de un ritmo sinusal y la Comisión de Derechos Humanoslos pacientes de fibrilación auricular ónico. Top: corriente inyectada membrana (I M) que se utiliza para la estimulación (0,5 Hz). Abajo: Grabación simultánea de potencial de membrana (V M), y el gato activado (abajo). (Dibujado de nuevo con el permiso de Voigt et al. 2012) 15 <img alt="Figura 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4.jpg" /> Figura 4. Grabaciones representativas de la (1 M) efecto de isoprenalina en L-tipo Ca 2 + corriente activada por Ca 2 +-transitorios (CAT) en un miocito auricular de un ritmo sinusal y un paciente de la fibrilación auricular crónica. Top: Voltage-clamp protocolo (0,5 Hz). Abajo: Grabación simultánea de la membrana total neto actual (I M), principalmente como resultado del tipo L Ca 2 + CaT actual (centro) y provocó (abajo). (Dibujado de nuevo con el permiso de Voigt,et al. 2012) 15 <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table1.jpg" alt="Tabla 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table1highres.jpg" /> Tabla I. Solutions. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table2.jpg" alt="Tabla 2" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table2highres.jpg"/> Tabla II. Equipos. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table3.jpg" alt="Tabla 3" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table3highres.jpg"/> Tabla III. Sustancias para la carga de los miocitos con Fluo-3 PM. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table4.jpg" alt="Tabla 4" fo:content-width = &quot;2,5 pulgadas&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50235/50235table4highres.jpg&quot; /&gt; Tabla IV. Solución de baño para patch-clamp. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table5.jpg" alt="Tabla 5" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table5highres.jpg"/> Tabla V. solución de pipeta de patch-clamp *.

Se describe el aislamiento de miocitos auriculares humanos que pueden ser utilizados para el Ca intracelular<sup&gt; 2 +</sup&gt; Mediciones en combinación con estudios de patch-clamp electrofisiología.

El aislamiento de miocitos auriculares humanos para la medición simultánea de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transitorios y corrientes de membrana

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar miocitos atriales humanos adecuados para mediciones simultáneas de calcio, transitorios y corrientes de membrana. La muestra atrial derecha se obtiene de pacientes sometidos a cirugía cardíaca abierta y se transporta rápidamente para comenzar el procedimiento. El primer paso del procedimiento consiste en limpiar el tejido y cortarlo en pequeños fragmentos de tejido.El segundo paso consiste en una digestión enzimática doble del tejido con enzimas proteolíticas que da como resultado miocitos auriculares aislados. El paso final comprende la carga de los miocitos con un colorante fluorescente sensible al calcio. En última instancia, el uso combinado de microscopía de fluorescencia epiescopia y la técnica de "patch clamp" permite obtener grabaciones simultáneas de transitorios de calcio junto con corrientes de membrana o potenciales de acción.Este método puede ayudar a comprender la base molecular de las alteraciones en el manejo celular del calcio que subyacen a enfermedades cardíacas como la fibrilación auricular, demostrando el método será Claudia Lira, la técnica superior de nuestro laboratorio. El tejido auricular humano obtenido de pacientes sometidos a cirugía cardíaca abierta para derivación de bypass coronario o reemplazo de la válvula mitral debe transportarse rápidamente al laboratorio en solución de transporte. Una vez en el laboratorio, transfiera la muestra de tejido y la solución a una placa de 10 centímetros. Luego, elimine aproximadamente el tejido adiposo utilizando tijeras.A continuación, agite la muestra de tejido. Guarde entre 200 y 600 miligramos para el aislamiento celular y congele el resto en nitrógeno líquido para análisis bioquímico. Transfiera el tejido destinado al aislamiento celular a una placa con solución fría sin calcio y corte el tejido en fragmentos de un milímetro cúbico para lavarlo.Trasfiera la solución junto con la solución libre de calcio al vaso de precipitados con camisa. Caliente a 37 grados. Proporcione oxígeno desde una línea tapada con la punta de una pipeta para evitar burbujas intensas.Agite cuidadosamente el tejido durante aproximadamente tres minutos con una barra magnética de agitación. Luego, permita que el tejido se sedimente. Ahora, filtre cuidadosamente el sobrenadante a través de una malla de nailon de 200 micrones.La mayor parte del tejido debe permanecer en el vaso de precipitados. Rellene nuevamente el vaso con solución libre de calcio calentada a 37 grados. Luego, devuelva los fragmentos de tejido filtrados desde la malla al vaso de precipitados utilizando pinzas y repita el procedimiento de lavado dos veces.Comience esta parte del procedimiento preparando 20 mililitros de la solución enzimática E uno, calentada a 37 grados Celsius, que contiene colagenasa y proteasa. Filtre cuidadosamente la solución libre de calcio tras el último paso de lavado y resuspenda el tejido lavado en la solución E uno. Devuelva el tejido recolectado sobre la malla al vaso de precipitados.Agite suavemente la suspensión durante 10 minutos. Luego añada 40 microlitros de cloruro de calcio 10 milimolar y continúe agitando durante 35 minutos. A continuación, filtre cuidadosamente el sobrenadante a través de una malla de nailon.La mayor parte del tejido debe permanecer en el vaso de precipitados. Prepare 20 mililitros de la solución enzimática E dos que contenga solo colagenasa uno, y úsela para rellenar nuevamente el vaso de precipitados. Devuelva el tejido recolectado en la malla al vaso de precipitados.Luego, agregue inmediatamente 40 microlitros de solución de cloruro de calcio 10 milimolar durante la segunda digestión, y ocasionalmente use tijeras para trocear los coágulos de tejido. Después de cinco minutos, tome una muestra de la suspensión para verificar la disociación de las células bajo un microscopio. Continúe tomando muestras cada dos o tres minutos hasta que sean claramente visibles los cardiomiocitos estriados en forma de bastón.Luego detenga la agitación, permitiendo que el tejido se sedimente. Una vez sedimentado, filtre cuidadosamente el sobrenadante a través de una malla de nailon y hacia un tubo plástico de 50 mililitros. A continuación, suspenda el tejido en 20 mililitros de solución de almacenamiento y devuelva los fragmentos de tejido filtrados desde la malla al vaso de precipitados.Disocie aún más las células mediante agitación mecánica suave. Con una pipeta de 20 mililitros, intente evitar la formación de burbujas. A continuación, filtre cuidadosamente el sobrenadante a través de una malla de nailon tras la centrifugación de filtración, recolectando ambos sobrenadantes a 90 5G durante 10 minutos.Para obtener el sedimento celular, deseche los sobrenadantes por aspiración sin perturbar el sedimento. Suspender cada sedimento en 1,5 mililitros de solución de almacenamiento a temperatura ambiente. A continuación, añada 7,5 microlitros de solución de cloruro de calcio 10 milimolar a cada tubo y espere 10 minutos.Luego, agregue 7,5 microlitros adicionales de cloruro de calcio y espere otros 10 minutos. Después de la espera, añada un tercer volumen de 15 microlitros de cloruro de calcio 10 milimolar para llevar la concentración final de cloruro de calcio en la solución a 0,2 milimolar. El propósito de este aislamiento es obtener células adecuadas para mediciones de calcio intracelular.Por lo tanto, es un requisito crítico omitir cualquier tampón de calcio, como EGTA, de la solución de almacenamiento. Transfiera 1,5 mililitros de la suspensión celular a un tubo microcentrífugo de dos mililitros. Los siguientes pasos deben realizarse teniendo en cuenta la sensibilidad a la luz del indicador fluorescente de calcio.Flu O tres. Primero, prepare una solución stock de flu O 3 de un milimolar. Esta solución puede almacenarse a menos veinte grados Celsius durante hasta una semana.A continuación, agregue 15 microlitros de la solución stock de flu oh 3:00 AM a la suspensión celular de 1,5 mililitros. Agite cuidadosamente la mezcla e incube la suspensión durante 10 minutos a temperatura ambiente en una caja opaca. Tras la incubación, centrifugue brevemente el tejido a aproximadamente 6.000 RPM.Luego, deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento en 1,5 mililitros de solución de baño. Deje la suspensión celular durante aproximadamente 30 minutos para la desesterificación antes de comenzar los experimentos. A continuación, continúe con la medición simultánea de calcio mediante parche en configuración ciego y fluorescencia epi utilizando el protocolo descrito.Los miocitos se aislaron del tejido auricular y se cuantificaron en una lámina de microscopio con buscador de células. Los rendimientos celulares promedio indican claramente una tendencia a menores rendimientos celulares en muestras de pacientes con fibrilación auricular crónica. Los miocitos cargados con Flu oh tres se estimularon a 0,5 hertz en configuración de fijación de corriente para provocar potenciales de acción; aproximadamente el 90 % de las células estudiadas mostraron contracciones regulares.En respuesta a esta estimulación, el cambio a microscopía de fluorescencia visualiza la liberación de calcio inducida por el potencial de acción desde el retículo sarcoplásmico, lo que inicia la contracción celular. Grabaciones representativas de pacientes con ritmo sinusal y fibrilación auricular muestran que los potenciales de acción auriculares suelen tener una forma de pico y cúpula, mientras que la triangulación y acortamiento del potencial de acción son signos típicos del remodelado auricular.En pacientes con fibrilación auricular, los transitorios intracelulares de calcio registrados simultáneamente revelaron niveles aumentados de calcio diastólico y una amplitud reducida del transitorio de calcio en miocitos de pacientes con fibrilación auricular para registrar las corrientes de calcio de tipo L. Las corrientes de potasio se bloquearon utilizando tetraaminopiridina y cloruro de bario. Las células se estimularon a 0,5 hercios en configuración de bloqueo de voltaje utilizando un potencial de reposo de menos 80 milivoltios con una rampa de 100 milisegundos a menos 40 milivoltios y un pulso de prueba de 100 milisegundos a 10 milivoltios.Los registros representativos muestran que la fibrilación auricular se asocia con una corriente de calcio tipo L reducida. Nuevamente, el nivel diastólico de calcio aumentó, mientras que la amplitud del transitorio de calcio fue menor. En la fibrilación auricular.La aplicación del agonista no selectivo de los receptores adrenérgicos beta, isopreno, aumentó las amplitudes de las corrientes de calcio de tipo L y del transitorio de calcio citosólico. En ambos grupos, esto sugiere que las células poseen una cascada de transducción de señales adrenérgicas beta intacta. Los resultados muestran que este método proporciona miocitos tolerantes al calcio de alta calidad, adecuados para mediciones simultáneas mediante parche adherido y transitorios de calcio.Además, los miocitos obtenidos pueden ser útiles para mediciones de acortamiento celular, tinción inmunológica o tinción de UTT.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Kv canal disfunción se asocia con arritmias cardíacas. Con el fin de estudiar los mecanismos moleculares que conducen a tales arritmias que utilizan un protocolo sistemático para el aislamiento de cardiomiocitos auriculares y ventriculares de Kv de canal ratones knockout auxiliares de subunidades. Cardiomiocitos aislados a continuación, puede ser utilizado inmediatamente para estudios electrofisiológicos celulares, bioquímicos o inmunofluorescencia (IF) ensayos.

Aislamiento y grabaciones Kv Canal murinos en miocitos auriculares y ventriculares

Los conocimientos actuales sobre las bases celulares de las enfermedades cardiacas se basa principalmente en estudios sobre modelos animales. Aquí describimos y validar un nuevo método para obtener cardiomiocitos viables individuales de pequeñas muestras quirúrgicas de miocardio ventricular humano. Miocitos ventriculares humanos pueden ser utilizados para estudios electrofisiológicos y las pruebas de drogas.

Aislamiento y caracterización funcional de Human ventricular cardiomiocitos a partir de muestras quirúrgicas recientes

Métodos se demuestran para el aislamiento de miocitos nódulo sinoauricular (SAMs) de ratones adultos para estudios de electrofisiología de pinzamiento zonal o de formación de imágenes. Las células aisladas se pueden utilizar directamente o se pueden mantener en cultivo para permitir la expresión de proteínas de interés, tales como la prensa codificados genéticamente.

Los métodos para el aislamiento, cultivo y caracterización funcional de los miocitos del nodo sinusal ratones adultos

Este protocolo describe la evaluación electrofisiológica de atria murino utilizando un sistema de mapeo óptico con una alta resolución espacial y temporal, incluyendo grabaciones duales de la tensión de la membrana y Ca2 + transitoria bajo programado estimulación a través de un catéter electrodo especializados.

Evaluación electrofisiológica de Atria murino con mapeo óptico alta resolución

Aquí, describimos un procedimiento optimizado, a base de Langendorff para el aislamiento de cardiomiocitos la sola célula de un modelo de rata de la falta de corazón relacionados con el síndrome metabólico con fracción de eyección conservada. Una regulación manual de la presión intraluminal de las cavidades cardiacas se implementa para obtener funcionalmente intacto miocitos adecuado para estudios de excitación-contracción-acoplamiento.

Aislamiento de cardiomiocitos auricular de un modelo de rata de la falta de corazón relacionados con el síndrome metabólico con fracción de eyección preservada

Este protocolo se utiliza para aislar cardiomiocitos auriculares individuales del corazón adulto del ratón utilizando un enfoque de digestión de trozos. Este enfoque se utiliza para aislar los miocitos auriculares derecho o izquierdo que se pueden utilizar para caracterizar la electrofisiología de miocitos auriculares en estudios de abrazaderas de parches.

Aislamiento de miocitos auriculares de ratones adultos

Presentado es un protocolo para el aislamiento de cardiomiocitos ventriculares humanos y animales de rodajas de miocardio cortados por vibratome. Se pueden obtener altos rendimientos de células tolerantes al calcio (hasta 200 células/mg) a partir de pequeñas cantidades de tejido (&lt;50 mg). El protocolo es aplicable al miocardio expuesto a isquemia fría durante un máximo de 36 h.

Aislamiento de cardiomiocitos ventriculares humanos de rebanadas de miocardio de corte de vibratome

Se describe un método para el aislamiento simultáneo de micocitos y no miocitos tanto de las adriículas como de los ventrículos de un solo corazón de ratón adulto. Este protocolo da como resultado rendimientos consistentes de micocitos cardíacos altamente viables y no miocitos y detalla condiciones óptimas de cultivo específicos de células para fenotipado y análisis in vitro.

Aislamiento simultáneo y cultura de los miocitos atriales, los miocitos ventriculares y los no miocitos de un corazón de ratón adulto

Los modelos de ratón permiten estudiar los mecanismos clave de la arritmogénesis. Para este propósito, los cardiomiocitos de alta calidad son necesarios para realizar mediciones de parche y pinza. Aquí, se describe un método para aislar miocitos aurinos y ventriculares a través de la perfusión de Langendorff retrógrada basada en enzimas, que permite mediciones simultáneas de transitorios de calcio y corriente de calcio de tipo L.

Aislamiento de miocitos aurículas y ventriculares murinas de alta calidad para mediciones simultáneas de transitorios de Ca2+ y corriente de calcio tipo L

Este protocolo describe modificaciones del método de Langendorff, incluida la profundidad de la canulación de la aorta para el aislamiento simultáneo de miocitos auriculares y ventriculares de ratones adultos.

Modificaciones del método de Langendorff para el aislamiento simultáneo de miocitos auriculares y ventriculares de ratones adultos

Aprende a aislar miocitos auriculares humanos para medir transitorios de calcio y corrientes de membrana simultáneamente. Este método permite estudiar la fisiología cardíaca y enfermedades como la fibrilación auricular.

El aislamiento de miocitos auriculares humanos para la medición simultánea de Ca

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