El aislamiento de miocitos auriculares humanos para la medición simultánea de Ca
3 de julio de 2013
Se describe el aislamiento de miocitos auriculares humanos que pueden ser utilizados para el Ca intracelular 2 + Mediciones en combinación con estudios de patch-clamp electrofisiología.
El objetivo general de este procedimiento es aislar miocitos atriales humanos adecuados para mediciones simultáneas de calcio, transitorios y corrientes de membrana. La muestra atrial derecha se obtiene de pacientes sometidos a cirugía cardíaca abierta y se transporta rápidamente para comenzar el procedimiento. El primer paso del procedimiento consiste en limpiar el tejido y cortarlo en pequeños fragmentos de tejido.
El segundo paso consiste en una digestión enzimática doble del tejido con enzimas proteolíticas que da como resultado miocitos auriculares aislados. El paso final comprende la carga de los miocitos con un colorante fluorescente sensible al calcio. En última instancia, el uso combinado de microscopía de fluorescencia epiescopia y la técnica de "patch clamp" permite obtener grabaciones simultáneas de transitorios de calcio junto con corrientes de membrana o potenciales de acción.
Este método puede ayudar a comprender la base molecular de las alteraciones en el manejo celular del calcio que subyacen a enfermedades cardíacas como la fibrilación auricular, demostrando el método será Claudia Lira, la técnica superior de nuestro laboratorio. El tejido auricular humano obtenido de pacientes sometidos a cirugía cardíaca abierta para derivación de bypass coronario o reemplazo de la válvula mitral debe transportarse rápidamente al laboratorio en solución de transporte. Una vez en el laboratorio, transfiera la muestra de tejido y la solución a una placa de 10 centímetros. Luego, elimine aproximadamente el tejido adiposo utilizando tijeras.
A continuación, agite la muestra de tejido. Guarde entre 200 y 600 miligramos para el aislamiento celular y congele el resto en nitrógeno líquido para análisis bioquímico. Transfiera el tejido destinado al aislamiento celular a una placa con solución fría sin calcio y corte el tejido en fragmentos de un milímetro cúbico para lavarlo.
Trasfiera la solución junto con la solución libre de calcio al vaso de precipitados con camisa. Caliente a 37 grados. Proporcione oxígeno desde una línea tapada con la punta de una pipeta para evitar burbujas intensas.
Agite cuidadosamente el tejido durante aproximadamente tres minutos con una barra magnética de agitación. Luego, permita que el tejido se sedimente. Ahora, filtre cuidadosamente el sobrenadante a través de una malla de nailon de 200 micrones.
La mayor parte del tejido debe permanecer en el vaso de precipitados. Rellene nuevamente el vaso con solución libre de calcio calentada a 37 grados. Luego, devuelva los fragmentos de tejido filtrados desde la malla al vaso de precipitados utilizando pinzas y repita el procedimiento de lavado dos veces.
Comience esta parte del procedimiento preparando 20 mililitros de la solución enzimática E uno, calentada a 37 grados Celsius, que contiene colagenasa y proteasa. Filtre cuidadosamente la solución libre de calcio tras el último paso de lavado y resuspenda el tejido lavado en la solución E uno. Devuelva el tejido recolectado sobre la malla al vaso de precipitados.
Agite suavemente la suspensión durante 10 minutos. Luego añada 40 microlitros de cloruro de calcio 10 milimolar y continúe agitando durante 35 minutos. A continuación, filtre cuidadosamente el sobrenadante a través de una malla de nailon.
La mayor parte del tejido debe permanecer en el vaso de precipitados. Prepare 20 mililitros de la solución enzimática E dos que contenga solo colagenasa uno, y úsela para rellenar nuevamente el vaso de precipitados. Devuelva el tejido recolectado en la malla al vaso de precipitados.
Luego, agregue inmediatamente 40 microlitros de solución de cloruro de calcio 10 milimolar durante la segunda digestión, y ocasionalmente use tijeras para trocear los coágulos de tejido. Después de cinco minutos, tome una muestra de la suspensión para verificar la disociación de las células bajo un microscopio. Continúe tomando muestras cada dos o tres minutos hasta que sean claramente visibles los cardiomiocitos estriados en forma de bastón.
Luego detenga la agitación, permitiendo que el tejido se sedimente. Una vez sedimentado, filtre cuidadosamente el sobrenadante a través de una malla de nailon y hacia un tubo plástico de 50 mililitros. A continuación, suspenda el tejido en 20 mililitros de solución de almacenamiento y devuelva los fragmentos de tejido filtrados desde la malla al vaso de precipitados.
Disocie aún más las células mediante agitación mecánica suave. Con una pipeta de 20 mililitros, intente evitar la formación de burbujas. A continuación, filtre cuidadosamente el sobrenadante a través de una malla de nailon tras la centrifugación de filtración, recolectando ambos sobrenadantes a 90 5G durante 10 minutos.
Para obtener el sedimento celular, deseche los sobrenadantes por aspiración sin perturbar el sedimento. Suspender cada sedimento en 1,5 mililitros de solución de almacenamiento a temperatura ambiente. A continuación, añada 7,5 microlitros de solución de cloruro de calcio 10 milimolar a cada tubo y espere 10 minutos.
Luego, agregue 7,5 microlitros adicionales de cloruro de calcio y espere otros 10 minutos. Después de la espera, añada un tercer volumen de 15 microlitros de cloruro de calcio 10 milimolar para llevar la concentración final de cloruro de calcio en la solución a 0,2 milimolar. El propósito de este aislamiento es obtener células adecuadas para mediciones de calcio intracelular.
Por lo tanto, es un requisito crítico omitir cualquier tampón de calcio, como EGTA, de la solución de almacenamiento. Transfiera 1,5 mililitros de la suspensión celular a un tubo microcentrífugo de dos mililitros. Los siguientes pasos deben realizarse teniendo en cuenta la sensibilidad a la luz del indicador fluorescente de calcio.
Flu O tres. Primero, prepare una solución stock de flu O 3 de un milimolar. Esta solución puede almacenarse a menos veinte grados Celsius durante hasta una semana.
A continuación, agregue 15 microlitros de la solución stock de flu oh 3:00 AM a la suspensión celular de 1,5 mililitros. Agite cuidadosamente la mezcla e incube la suspensión durante 10 minutos a temperatura ambiente en una caja opaca. Tras la incubación, centrifugue brevemente el tejido a aproximadamente 6.000 RPM.
Luego, deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento en 1,5 mililitros de solución de baño. Deje la suspensión celular durante aproximadamente 30 minutos para la desesterificación antes de comenzar los experimentos. A continuación, continúe con la medición simultánea de calcio mediante parche en configuración ciego y fluorescencia epi utilizando el protocolo descrito.
Los miocitos se aislaron del tejido auricular y se cuantificaron en una lámina de microscopio con buscador de células. Los rendimientos celulares promedio indican claramente una tendencia a menores rendimientos celulares en muestras de pacientes con fibrilación auricular crónica. Los miocitos cargados con Flu oh tres se estimularon a 0,5 hertz en configuración de fijación de corriente para provocar potenciales de acción; aproximadamente el 90 % de las células estudiadas mostraron contracciones regulares.
En respuesta a esta estimulación, el cambio a microscopía de fluorescencia visualiza la liberación de calcio inducida por el potencial de acción desde el retículo sarcoplásmico, lo que inicia la contracción celular. Grabaciones representativas de pacientes con ritmo sinusal y fibrilación auricular muestran que los potenciales de acción auriculares suelen tener una forma de pico y cúpula, mientras que la triangulación y acortamiento del potencial de acción son signos típicos del remodelado auricular.
En pacientes con fibrilación auricular, los transitorios intracelulares de calcio registrados simultáneamente revelaron niveles aumentados de calcio diastólico y una amplitud reducida del transitorio de calcio en miocitos de pacientes con fibrilación auricular para registrar las corrientes de calcio de tipo L. Las corrientes de potasio se bloquearon utilizando tetraaminopiridina y cloruro de bario. Las células se estimularon a 0,5 hercios en configuración de bloqueo de voltaje utilizando un potencial de reposo de menos 80 milivoltios con una rampa de 100 milisegundos a menos 40 milivoltios y un pulso de prueba de 100 milisegundos a 10 milivoltios.
Los registros representativos muestran que la fibrilación auricular se asocia con una corriente de calcio tipo L reducida. Nuevamente, el nivel diastólico de calcio aumentó, mientras que la amplitud del transitorio de calcio fue menor. En la fibrilación auricular.
La aplicación del agonista no selectivo de los receptores adrenérgicos beta, isopreno, aumentó las amplitudes de las corrientes de calcio de tipo L y del transitorio de calcio citosólico. En ambos grupos, esto sugiere que las células poseen una cascada de transducción de señales adrenérgicas beta intacta. Los resultados muestran que este método proporciona miocitos tolerantes al calcio de alta calidad, adecuados para mediciones simultáneas mediante parche adherido y transitorios de calcio.
Además, los miocitos obtenidos pueden ser útiles para mediciones de acortamiento celular, tinción inmunológica o tinción de UTT.
Descripción general
Este artículo describe un método para aislar miocitos atriales humanos, que son esenciales para estudiar la dinámica del calcio intracelular y las propiedades electrofisiológicas. El procedimiento permite mediciones simultáneas de transitorios de calcio y corrientes de membrana, proporcionando información sobre la función cardíaca y las enfermedades cardiovasculares.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Fisiología cardíaca
- Electrofisiología
- Biología celular
Antecedentes
- Los miocitos auriculares desempeñan un papel fundamental en la función cardíaca.
- Comprender el manejo del calcio es esencial para abordar las enfermedades cardíacas.
- La fibrilación auricular es una afección común asociada a anomalías en el manejo del calcio.
- El aislamiento de miocitos permite un estudio detallado de sus propiedades.
Objetivo del estudio
- Para aislar miocitos atriales humanos con fines de investigación.
- Para permitir mediciones de calcio intracelular y corrientes de membrana.
- Para investigar la base molecular de las enfermedades cardíacas.
Métodos Utilizados
- Recolección de tejido auricular derecho de pacientes durante la cirugía.
- Digestión enzimática del tejido para aislar los miocitos.
- Carga de los miocitos con un colorante fluorescente sensible al calcio.
- Grabaciones simultáneas mediante parche de voltaje y microscopía de fluorescencia.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de miocitos auriculares adecuados para experimentos.
- Capacidad demostrada para medir transitorios de calcio junto con corrientes de membrana.
- Se observaron variaciones en los rendimientos celulares relacionadas con las condiciones del paciente.
- Se proporcionó un protocolo para estudios futuros sobre la función cardíaca.
Conclusiones
- El método de aislamiento es eficaz para estudiar los miocitos auriculares.
- Las mediciones simultáneas mejoran la comprensión de la fisiología cardíaca.
- Este enfoque puede contribuir a la investigación sobre la fibrilación auricular y otras enfermedades cardíacas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La medición simultánea de transitorios de Ca2+ y corrientes de membrana en miocitos atriales humanos aislados permite una evaluación directa de la electrofisiología cardíaca y el manejo del calcio a nivel celular. Esta capacidad es fundamental para reducir los riesgos asociados con hipótesis sobre objetivos relacionados con la fibrilación auricular y otros trastornos cardíacos, y para respaldar la confianza predictiva en las primeras etapas del descubrimiento de fármacos cardíacos. El método proporciona un puente traslacional desde el tejido derivado del paciente hasta lecturas funcionales, informando las decisiones sobre carteras de objetivos cardíacos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la investigación mecanicista de canales iónicos y dianas en el manejo del calcio en células cardíacas humanas.
- Apoya la validación funcional de vías relevantes para la enfermedad implicadas en la fibrilación auricular.
- Proporciona confianza predictiva en la selección de dianas al vincular mecanismos moleculares con fenotipos celulares.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona preparaciones validadas de miocitos humanos adecuadas para ensayos de parche de membrana (patch-clamp) y basados en fluorescencia.
- Facilita la medición cuantitativa y reproducible de parámetros electrofisiológicos y de señalización de calcio.
- Permite la estandarización de ensayos para cribado de compuestos y estudios comparativos posteriores.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea los resultados celulares con fenotipos cardíacos humanos relevantes para la enfermedad, garantizando continuidad traslacional.
- Facilita el avance ajustado al riesgo de dianas cardíacas al proporcionar evidencia directa proveniente de células derivadas de pacientes.
- Permite el descubrimiento y la validación de biomarcadores mediante mediciones funcionales simultáneas.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica al proporcionar una plataforma para la prueba de hipótesis, el desarrollo de ensayos y la validación traslacional utilizando células cardíacas humanas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas y la aclaración de vías para objetivos cardíacos.
- Tamizaje: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles para la evaluación de compuestos en sistemas humanos validados.
- Analítica: Permite la comparación directa de parámetros de señalización electrofisiológica y de calcio entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento inicial con la validación preclínica mediante modelos celulares derivados de pacientes.
- Reutilización Empresarial: Establece un flujo de trabajo reutilizable para la evaluación de objetivos cardíacos y el desarrollo de ensayos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas cardíacas.
- Valor operativo: Estandariza los protocolos de aislamiento y medición para lograr reproductibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de avance o interrupción y reduce el riesgo biológico en fases avanzadas de las carteras cardíacas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas cardíacas y el avance traslacional.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de tejido cardíaco, electrofisiología con parche de membrana (patch-clamp) y microscopía de fluorescencia.
- Exige acceso a instrumentación especializada para mediciones simultáneas de actividad eléctrica y calcio.
- Necesita la estandarización entre equipos en el procesamiento de tejidos y los protocolos de ensayo.
- Puede ser necesaria una adaptación para distintos modelos de enfermedades cardíacas o fuentes de tejido.
- El rendimiento celular y la viabilidad pueden variar según la condición del paciente, lo que afecta el número de experimentos realizables.
