El aislamiento de miocitos auriculares humanos para la medición simultánea de Ca ^{2 +} Transitorios y corrientes de membrana

El objetivo general de este procedimiento es aislar miocitos auriculares humanos adecuados para mediciones simultáneas de calcio, transitorios y corrientes de membrana. La muestra auricular correcta se obtiene de pacientes que se someten a una cirugía a corazón abierto y se transporta rápidamente para comenzar el procedimiento. El primer paso del procedimiento es limpiar el tejido y cortarlo en pequeños trozos de tejido.

El segundo paso es una doble digestión enzimática del tejido con enzimas proteolíticas que dan lugar a miocitos auriculares aislados. El paso final consiste en cargar los miocitos con un colorante fluorescente sensible al calcio. En última instancia, el uso combinado de la microscopía de epifluorescencia y la técnica de fijación de parche produce registros simultáneos de transitorios de calcio con corrientes de membrana o potenciales de acción.

Este método puede ayudar a comprender las bases moleculares del calcio celular que maneja las anomalías subyacentes a las enfermedades cardíacas como la fibrilación auricular, demostrando que el método será Claudia Lira, la técnica superior de nuestro laboratorio, El tejido auricular humano obtenido de pacientes sometidos a cirugía a corazón abierto para injerto de bypass coronario, o reemplazo de la válvula mitral debe transportarse rápidamente al laboratorio en solución de transporte. Una vez en el laboratorio, transfiera la muestra de tejido y la solución a un plato de 10 centímetros. A continuación, retire bruscamente el tejido graso con unas tijeras.

A continuación, agite la muestra de tejido. Conservar entre 200 y 600 miligramos para el aislamiento celular y congelar el resto en nitrógeno líquido para su análisis bioquímico. Transfiera el tejido para el aislamiento celular a un plato de solución fría sin calcio y corte el tejido en trozos de un milímetro cúbico para lavar el tejido.

Transfiéralo junto con la solución sin calcio al vaso de precipitados encamisado. Calentado a 37 grados. Suministre oxígeno desde una línea tapada con una punta de pipeta para evitar fuertes burbujas.

Revuelva el pañuelo con cuidado durante unos tres minutos con una barra magnética para agitar. Luego deje que el pañuelo se asiente. Ahora cuele con cuidado el sobrenadante a través de una malla de nailon de 200 micras.

La mayor parte del tejido debe permanecer en el vaso de precipitados. Rellene el vaso de precipitados con una solución tibia sin calcio a 37 grados. A continuación, vuelva a colocar los trozos de tejido colados de la malla en el vaso de precipitados con pinzas y repita el procedimiento de lavado dos veces.

Comience esta parte del procedimiento preparando 20 mililitros de solución enzimática E calentada a 37 grados Celsius, que contiene colagenasa y proteasa. Cuele cuidadosamente la solución sin calcio después del último paso de lavado y vuelva a suspender el tejido lavado en la solución E one. Regrese el pañuelo recogido en la malla al vaso de precipitados.

Revuelva la suspensión con cuidado durante 10 minutos. Luego agregue 40 microlitros de cloruro de calcio de 10 milimolares y continúe revolviendo durante 35 minutos. A continuación, cuela el sobrenadante con cuidado a través de una malla de nylon.

La mayor parte del tejido debe permanecer en el vaso de precipitados. Prepare 20 mililitros de solución enzimática E dos que contengan colagenasa uno solamente, y utilícela para rellenar el vaso de precipitados. Regrese el pañuelo recogido en la malla al vaso de precipitados.

Luego agregue inmediatamente 40 microlitros de solución de cloruro de calcio de 10 milimolares durante la segunda digestión, ocasionalmente use tijeras para cortar los coágulos de tejido. Después de cinco minutos, tome una muestra de la suspensión para verificar la disociación de las células bajo un microscopio. Siga tomando muestras cada dos o tres minutos hasta que los cardiomiocitos estriados en forma de bastoncillo sean claramente visibles.

Luego deje de remover, permitiendo que el pañuelo se asiente. Una vez asentado, cuela cuidadosamente el sobrenadante a través de una malla de nailon y en un tubo de plástico de 50 mililitros. A continuación, suspenda el pañuelo en una solución de almacenamiento de 20 mililitros y devuelva los trozos de tejido colados de la malla al vaso de precipitados.

Disociar aún más las células mediante una suave tación mecánica. Con una pipeta de 20 mililitros, intente evitar la formación de burbujas. A continuación, cuele cuidadosamente el sobrenadante a través de una malla de nailon después de la centrífuga de colado, ambas colecciones de sobrenadante a 90 5G durante 10 minutos.

Para pellet las celdas, deseche los sobrenadantes por aspiración sin alterar el pellet resus. Suspenda cada pellet en 1,5 mililitros de solución de almacenamiento a temperatura ambiente. A continuación, agregue 7,5 microlitros de solución de cloruro de calcio de 10 milimolares a cada tubo y espere 10 minutos.

Luego agregue 7.5 microlitros más de cloruro de calcio y espere otros 10 minutos. Después de la espera, agregue un tercer volumen de 15 microlitros de cloruro de calcio de 10 milimolares para llevar la concentración final de cloruro de calcio en solución a 0,2 milimolares. El propósito de este aislamiento es lograr células que sean adecuadas para las mediciones de calcio intracelular.

Por lo tanto, es un requisito crítico omitir cualquier tampón de calcio como EGGA de la solución de almacenamiento. Transfiera 1,5 mililitros de la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros. Los siguientes pasos deben ejecutarse teniendo en cuenta la sensibilidad a la luz del indicador de calcio fluorescente.

Gripe O tres. Primero, prepare una solución madre de un milimolar para la gripe a las 3:00 a.m. Esta solución se puede almacenar a 20 grados centígrados bajo cero durante un máximo de una semana.

A continuación, agregue 15 microlitros de la solución madre de gripe a las 3:00 a.m. a la suspensión de celdas de 1.5 mililitros. Agite la mezcla con cuidado e incube la suspensión durante 10 minutos a temperatura ambiente en una caja opaca. Después de la incubación, centrifugar brevemente el tejido a unas 6.000 RPM.

A continuación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1,5 mililitros de solución de baño. Deje la suspensión celular durante unos 30 minutos para su esterificación antes de comenzar los experimentos. A continuación, proceda con mediciones simultáneas de parche y calcio epifluorescente utilizando el protocolo descrito.

Los miocitos se aislaron del tejido auricular y se cuantificaron en un portaobjetos de microscopio buscador de células. Los rendimientos celulares promedio indican claramente que hay una tendencia a disminuir los rendimientos celulares en muestras de pacientes con fibrilación auricular crónica. Se estimularon tres miocitos cargados a 0,5 hercios en configuración de pinza de corriente para provocar potenciales de acción, aproximadamente el 90% de las células investigadas mostraron contracciones regulares.

En respuesta a esta estimulación, el cambio a la microscopía de fluorescencia visualiza el potencial de acción desencadenado por la liberación de calcio del retículo sarcoplásmico, que inicia la contracción celular. Las grabaciones representativas de pacientes con ritmo sinusal y fibrilación auricular muestran que la sr. Los potenciales de acción del paciente suelen tener forma de espiga y cúpula, mientras que la triangulación y el acortamiento de los potenciales de acción son características típicas de la remodelación auricular.

En los pacientes con fibrilación auricular, los transitorios de calcio intracelular registrados simultáneamente revelaron un aumento de los niveles de calcio diastólico y una reducción de la amplitud transitoria del calcio en los miocitos de los pacientes con fibrilación auricular para registrar corrientes de calcio tipo L. Las corrientes de potasio se bloquearon utilizando cuatro aminoácidos paridina y cloruro de bario. Las celdas se estimularon a 0,5 hercios en configuración de pinza de voltaje utilizando un potencial de retención de menos 80 milivoltios con una rampa de 100 milisegundos a menos 40 milivoltios y un pulso de prueba de 100 milisegundos a 10 milivoltios.

Los registros representativos muestran que la fibrilación auricular se asocia con una corriente de calcio reducida tipo L. De nuevo, el nivel diastólico de calcio estaba aumentado, mientras que la amplitud transitoria del calcio era menor. En la fibrilación auricular.

La aplicación del agonista no selectivo del receptor beta suprarrenal isopreno aumentó las amplitudes de las corrientes de calcio tipo L y el transitorio de calcio citosólico. En ambos grupos, esto sugiere que las células tienen una cascada de transducción de señales beta adrenérgica intacta. Los resultados muestran que este método proporciona miocitos tolerantes al calcio de alta calidad, que son adecuados para mediciones simultáneas de pinzamiento de parche y transitorios de calcio.

Además, los miocitos obtenidos pueden ser útiles para las mediciones de acortamiento celular, tinción inmunitaria o tinción TTU.