La especificación de telencefálicas neuronas glutamatérgicas a partir de células madre pluripotentes

El objetivo general de este procedimiento es generar neuronas cefálicas a partir de células madre embrionarias humanas o ESC H mediante el paso de puntos de control similares a los observados durante el desarrollo humano. Esto se logra primero permitiendo que las HSC se diferencien espontáneamente en suspensión en medio HESC y luego transfiriéndolas al medio de inducción neural para diferenciarse de manera más selectiva. A continuación, se permite que los cuerpos embrionarios o agregados de PSC se adhieran a las placas tratadas con cultivo de tejidos, donde las células se expanden y se diferencian en una monocapa.

Con los centros formando células neuroepiteliales morfológicamente similares a las células kilométricas. A continuación, se aíslan las células neuroepiteliales y se colocan en cultivos en suspensión donde forman neuroesferas. Finalmente, las neuroesferas se colocan en cubreobjetos donde pueden diferenciarse aún más.

En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran los tipos específicos de neuronas formadas a través de la inmunotinción o la electrofisiología. Las implicaciones de esta técnica se extienden a una amplia variedad de enfermedades genéticamente hereditadas, ya que también se pueden generar neuronas específicas del paciente a partir de células madre pluripotentes inducidas, donde se puede dilucidar el mecanismo de acción y las posibles terapias. Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre el desarrollo de subtipos de neurotipos cefálicos de talón a partir de células madre pluripotentes.

También se puede aplicar a otros sistemas, como las enfermedades humanas relacionadas con las neuronas cefálicas de la garra Para generar agregados de células madre pluripotentes humanas, comience cultivando células madre pluripotentes humanas en alimentadores de fibroblastos embrionarios de ratón en medio HESC suplementado con FGF básico durante cinco a siete días, las colonias serán grandes, pero aún indiferenciadas. Cuando las colonias hayan alcanzado la etapa correcta en un tubo de 50 mililitros. Prepare una solución de un miligramo por mililitro de dis bays en medio D-M-E-M-F 12 de acuerdo con el protocolo de texto.

Aspire el medio de las células y luego enjuáguelas una vez con D-M-E-M-F 12. Después de retirar el lavado, agregue un mililitro de dis bays a cada pocillo e incube a 37 grados centígrados durante tres a cinco minutos. A los tres minutos, revisa debajo del microscopio los bordes curvados que se ven un poco más oscuros.

Si es necesario, incube las células durante más tiempo. Cuando las celdas estén listas, retire la solución de dase y lave las celdas una vez con D-M-E-M-F 12 antes de reemplazar el lavado con 1,5 mililitros de medio HESC para separar y romper las celdas. Coloque la punta de una pipeta de vidrio de 10 mililitros en las celdas hacia la pared inferior derecha de un pocillo y, con un pequeño movimiento hacia arriba y hacia abajo, muévase a través del pocillo hasta el otro lado antes de regresar en la dirección opuesta.

Una vez que todas las células estén en suspensión, colóquelas en tubos de 15 mililitros y centrifuérrelas a 200 G durante dos minutos antes de retirar el medio del pellet. Usando medio HESC, transfiera las células a un matraz para su cultivo. Por ejemplo, para celdas de seis pocillos de HSC, use un matraz T 75 con 50 mililitros de HESC. Medio.

Incubar las células a 37 grados centígrados durante 12 horas. A continuación, para eliminar los restos de células, transfiera las células y el medio a un tubo de 50 mililitros y lave las células una vez antes de transferirlas con 50 mililitros de medio fresco a un matraz nuevo. Continúe alimentando las células de esta manera hasta el quinto día.

En el quinto día, centrifuga las células y transfiérelas a un nuevo matraz T 75. Con 50 mililitros de medio de inducción neural o NIM, incubarlos durante dos o tres días reemplazando la mitad del NIM cada día después de la placa de incubación, las células usando laminina o FBS para ayudarlas a adherirse a las placas a la placa. Usando FBS, agregue 1.5 mililitros de medio con celdas a cada uno.

Bueno, agite suavemente la placa para esparcir los agregados y permitir que las células se adhieran durante la noche. A 37 grados centígrados del día siguiente, reemplace todo el medio con dos mililitros de NIM por pocillo. Después de uno o dos días de incubación, cada agregado se extenderá para formar una monocapa y, en un par de días, los centros de la mayoría de estas células parecerán morfológicamente similares a las células columer.

Alrededor de los días 14 a 17, las células columer aparecerán más compactas. A veces, las células forman crestas o anillos con un lumen visible en su interior. Antes de aislar las células, examínelas para detectar la presencia de células epiteliales no pertenecientes a la UE y utilice la punta de una pipeta para rasparlas.

Aislar las células neuroepiteliales que se encuentran en el centro de las colonias. Utilice una micropipeta y una pipeta filtrada estéril de un mililitro para aplicar presión en el centro de la colonia y que se levante. Ten cuidado de no dejar que la parte exterior de la colonia se desprenda también.

Transfiera dos placas de células aisladas a un tubo de 15 mililitros y centrifugue a 200 g durante dos minutos. Después de retirar el medio, transfiera las células a un matraz T 25 tratado sin cultivo de tejidos que contenga 10 mililitros de NIM. Con la adición de B27 incubar durante la noche del día siguiente, las células deberían tener una apariencia esférica.

A veces, las células periféricas también se aíslan y, por lo general, se adhieren al fondo del matraz. Si esto sucede, transfiera las células esféricas a un nuevo matraz, dejando las células adheridas detrás del cultivo. Las neuroesferas y la suspensión durante una semana en NIMB 27 para promover la resistencia y proliferación celular.

Agregue A MP cíclico y factor de crecimiento similar a la insulina uno. Al final de la semana, las neuroesferas contendrán progenitores cefálicos y están listas para ser colocadas en cubreobjetos para su diferenciación terminal. Para preparar cubreobjetos recubiertos de poliuretano y laminina en 24 placas, las placas de pocillos comienzan recubriendo cubreobjetos limpios con una solución de 0,1 miligramos por mililitro de poliuretano a 37 grados centígrados durante la noche para recubrir los cubreobjetos con laminina a 50 microlitros de 20 microgramos por mililitro de laminina en diferenciación neuronal.

Medio a cada cubreobjetos tratado con poliuretano. Teniendo cuidado de que solo el líquido toque el cubreobjetos. Incubarlos a 37 grados centígrados durante una o dos horas.

Después de la incubación de la laminina, recoja y lave las neuroesferas en D-M-E-M-F 12. Si las células son demasiado grandes para adherirlas correctamente, agregue alrededor de dos mililitros de Accutane e incube las células a 37 grados centígrados durante tres minutos. A continuación, agregue un volumen igual de inhibidor de tripsina y después de centrifusionar las células a 200 G durante tres minutos, reemplace la solución con NDM y use un P 200 para romper las células en pequeños grupos.

Colóquelos en cubreobjetos prerrecubiertos, aspire la mayor parte del medio y transfiera las celdas a una placa de Petri de seis centímetros en unas pocas gotas del medio para que su selección sea más fácil sin tener que quitar la laminina de los cubreobjetos prerrecubiertos. Transfiere alrededor de cuatro a cinco neuroesferas a cada uno. Deje que las neuroesferas se adhieran durante al menos dos a cuatro horas antes de agregar 0,5 mililitros de medio de neurodiferenciación suplementado con B 27 cíclico.

Un MP y factores neurotróficos reemplazan la mitad del medio cada dos días. Las células se pueden mantener durante varios meses, como se muestra aquí. Este protocolo describe cómo diferenciar las PSC humanas en neuronas glutamatérgicas cefálicas a través de varios pasos críticos.

La formación de PSC agrega la inducción de células neuroepiteliales, la generación de progenitores cefálicos de talón y la diferenciación terminal de estos progenitores en neuronas cefálicas de talón. Este sistema es robusto y eficiente en la generación de neuronas cefálicas, progenitoras y glutamatérgicas, por ejemplo. Sin la adición de factores de ajuste, las HSC se diferenciaron en el linaje neuronal y 24 días después de la diferenciación.

La mayoría de los precursores neuronales fueron positivos para Fox G uno, factor de transcripción A expresado por el céfalo, pero negativos para HOKs B cuatro, marcador A para las células cerebrales posteriores y de la médula espinal, lo que sugiere que los progenitores cefálicos del telón se generaron con éxito. Estos progenitores cefálicos de telón poseen un fenotipo dorsal como lo indica la expresión de PAC seis. Marcador expresado por los progenitores dorsales, pero no por los progenitores NK X 2.1 A para los progenitores ventrales.

Después de una mayor diferenciación, estos progenitores dorsales cefálicos se diferenciaron en neuronas glutamatérgicas, que fueron positivas para el marcador glutamatérgico. Las neuronas TBR uno que dieron positivo para TBR uno también fueron positivas para los marcadores neuronales beta tres, tubulina o mapa dos. Estas células también expresaron el transportador vesicular de glutamato uno o el glúteo V uno, un marcador de neuronas glutamatérgicas maduras que sugiere la generación eficiente de neuronas glutamatérgicas cefálicas talón en el cultivo.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la electrofisiología, para responder a preguntas adicionales, como si estas neuronas pueden hacer conexiones sinápticas con otras células. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión. Tuvo que diferenciar células madre pluripotentes humanas y neuronas glutamatérgicas cefálicas a través de varios pasos críticos.

La formación de células madre pluripotentes agrega la inducción de células neuroepiteliales, la generación de progenitores cefálicos y la diferenciación terminal de estos progenitores en neuronas cefálicas.