Derivación eficiente de los Derechos Humanos progenitores neuronales y neuronas de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

El objetivo general del siguiente experimento es derivar la progenie neuronal directa y exclusivamente a partir de células madre embrionarias humanas pluripotentes mediante inducción de moléculas pequeñas. Esto se logra mediante la adición de ácido rettino a las células indiferenciadas mantenidas en condiciones definidas. A continuación, el proceso de diferenciación continúa separando las células en un cultivo en suspensión donde forman grupos celulares flotantes llamados neuroblastos.

Si se permite que los neuroblastos se adhieran a una placa de cultivo de tejidos en medios de neurodiferenciación neurológica, desarrollan características de neuronas maduras. En última instancia, la inmunofluorescencia y la deconvolución o microscopía confocal se pueden utilizar para mostrar el efecto del tratamiento con ácido rettino en la morfología y la expresión de marcadores de las células madre embrionarias humanas tratadas. En otras técnicas, solo una pequeña fracción de células persigue un fenotipo neuronal, mientras que nuestro método permite la inducción eficiente y bien controlada de células madre embrionarias humanas pluripotentes exclusivamente hacia un linaje neuronal mediante la simple provisión de pequeñas moléculas.

Hay que tener cuidado con algunos pasos a la hora de reparar soluciones de stock. Tenga cuidado de descongelar lentamente la matrigel y la laminina humana de menos 80 grados Celsius a cuatro grados Celsius, almacene los medios durante la noche a cuatro grados Celsius y siempre caliente los medios a 37 grados Celsius antes de usarlos. Además, cuando se preparan medios de ESL humanos, algunos de los suplementos se agregan justo antes de que se use.

Estos incluyen BFGF, ácido ascórbico, insulina humana activa en A y transferible. A continuación, prepare el gel de matra o las soluciones de trabajo de laminina humana inmediatamente antes del recubrimiento de la placa. Incubar las placas a 37 grados SIUs en dióxido de carbono al 5%: Después de preparar las placas de cultivo de tejidos prerrecubiertas de gelatina.

La gelatina puede ser reemplazada por la solución de trabajo de matrigel o laminina. Cubra estas placas incubándolas durante la noche a cuatro grados centígrados. Comience permitiendo que las colonias de células madre embrionarias humanas crezcan durante cinco a siete días y luego prepárese para dividirse.

Algunas de ellas Selecta colonias con más del 75%Bajo células ES humanas diferenciadas, suelen ser ligeramente opacas con bordes definidos colonias que contienen células apiladas. Una indicación del comienzo de la diferenciación suelen ser las colonias blancas que contienen células mayoritariamente diferenciadas, que suelen parecer claras. No seleccione colonias blancas o claras.

Sostenga las placas a la luz y use un marcador para delinear las colonias ligeramente opacas en la parte inferior de las placas a lo largo de los contornos. Utilice el borde de una punta de pipeta P dos estéril para separar la capa de fibroblastos circundante de la colonia de células madre embrionarias humanas. A continuación, retire las células de fibroblastos circundantes y también elimine todas las partes diferenciadas de la colonia.

Ahora aspire los medios viejos que contienen las células diferenciadas separadas. A continuación, en cada pocillo, lave las células indiferenciadas una vez con un medio de células E es humanas que carezcan de BFGF, y luego agregue tres mililitros de medios ESL humanos frescos que contengan B-F-G-F-B-F-G-F al medio fresco inmediatamente antes de usar. Ahora utilice una punta de pipeta P dos estéril para cortar las colonias en trozos pequeños y separarlas de la placa.

Tire de las piezas de colonia desprendidas en su medio en un tubo cónico de 50 mililitros. Saca uno adicional. Enjuague de medios mililitros por pocillo.

Las células ahora están listas para una mayor diferenciación utilizando moléculas pequeñas. Comience calentando los platos recién recubiertos a 37 grados centígrados. Aspire la solución de recubrimiento de las placas y agregue una alícuota de cuatro mililitros de medio que contenga piezas de colonia en cada pocillo, luego transfiera suavemente las placas a una incubadora sin agitarlas.

No moleste las placas para que puedan sembrar. Después de sembrar durante tres días, haga nuevos medios que contengan ácido ómico. A continuación, retire la mayor parte de los medios antiguos, dejando solo los medios suficientes para que las células permanezcan sumergidas.

Nunca se debe permitir que las células se sequen para cada uno. Bueno, agregue cuatro mililitros de medios de células madre embrionarias humanas frescas con BFGF y ácido rettino. Reemplace el medio cada dos días y permita que crezcan las colonias de células madre embrionarias humanas tratadas con ácido rettino.

Después de siete u ocho días, las células habrán sufrido cambios morfológicos en células grandes y diferenciadas. A continuación, proceda a realizar un cultivo de células en suspensión para que un cultivo en suspensión comience separando las colonias de ESL de las células que se han diferenciado espontáneamente y migrado para formar una capa de fibroblastos. Utilice la técnica mencionada anteriormente con una punta de pipeta estéril y, a continuación, aspire los medios antiguos que contienen células de fibroblastos desprendidas flotantes.

Lave las células una vez con medios HESC y vuelva a suspenderlas en tres mililitros de medios HESC. Ahora utilizando una punta de pipeta P dos estéril. Corta las colonias en trozos pequeños y sepáralas del plato.

Tire de los medios con colonias separadas en un solo tubo cónico de 50 mililitros. Enjuague los pocillos con un mililitro de medio y agregue el enjuague a la piscina. A continuación, alícuota de cuatro mililitros de las células agrupadas en cada pocillo de una placa de fijación ultrabaja de seis pocillos durante cuatro o cinco días, mantenga la placa en una incubadora.

Durante este tiempo, se formarán grupos celulares flotantes o neuroblastos para avanzar aún más el neuroblasto a un fenotipo neuronal más maduro. Tire de los medios que los contienen en un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, centrifugar las células a 1.400 rpm durante cinco minutos.

Aspire, pese la mayor cantidad posible de medios antiguos y agregue una cantidad igual de medios NSC nuevos que contengan VEGF N NT three y BDNF. Mezcle las celdas en una suspensión pipeteando, luego alícuota cuatro mililitros de la suspensión por pocillo en seis. Las placas de cultivo de tejidos de pocillos transfieren las placas a una incubadora humidificada a 37 grados centígrados.

El neuroblasto se adherirá a las placas de cultivo durante la noche para un cultivo 3D en Matrigel o laminado humano a la suspensión del neuroblasto. Y una matriz 3D polimerizará a 37 grados centígrados. Reemplace los medios cada dos días.

Dentro de dos semanas, aparecerán extensas redes de células neuronales portadoras de neuritas y células pigmentadas, el ácido rettino se vuelve suficiente para inducir a las células madre embrionarias humanas mantenidas en el sistema de cultivo definido a la transición de la pluripotencia exclusivamente a un fenotipo neuroepidérmico. Tras la exposición de células E es humanas indiferenciadas al ácido retinoico, todas las células de la colonia sufrieron cambios morfológicos en grandes células diferenciadas que dejaron de expresar el marcador asociado a la pluripotencia OCT cuatro. Las células también comenzaron a expresar varios marcadores asociados al neuroectodermo, como HNK uno, a, P, dos y TRKC.

Estas grandes células diferenciadas continuaron multiplicándose y las colonias aumentaron de tamaño de forma espontánea, expresando el marcador neuronal temprano, beta tres tubulina. El mapa de marcadores neuronales más maduros dos comenzó a aparecer en áreas de las colonias donde las células se habían acumulado. Coincidentemente, con la aparición de las células neuroectodérmicas, el factor de transcripción neuronal específico NER uno implicado en la diferenciación neuronal dopaminérgica y la activación del gen de la tirosina hidroxilasa translocado al núcleo.

Después del desprendimiento, las células madre embrionarias humanas tratadas con ácido rettino formaron neuroblasto en un cultivo en suspensión tras la eliminación del FGF básico y después de permitir que el neuroblasto se adhiriera a una placa de cultivo de tejidos, comenzaron a aparecer extensas redes de células neuronales portadoras de neuritas y células pigmentadas, típicas del SNC, con un aumento drástico en la eficiencia y pudieron cultivarse durante tres meses. Estas células neuronales derivadas de células madre embrionarias humanas expresaron beta tres tubulina en comparación con la diferenciación espontánea de múltiples linajes de las células sin tratamientos con ácido rettino y coexpresaron el mapa dos una vez dominadas. Esta técnica se puede utilizar para generar progenitores neuronales en células neuronales de manera uniforme a partir de células madre embrionarias humanas pluripotentes en aproximadamente cuatro semanas si se realiza correctamente.

No olvide que trabajar con células humanas puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como asegurarse de que las líneas celulares estén libres de patógenos y micoplasma antes de realizar este procedimiento.