Diferenciación de células madre pluripotentes humanas en neuronas utilizando lentivirus modificados

Trate las células madre pluripotentes humanas adheridas con lentivirus modificados en un reactivo de transfección.

El virus transporta genes para la resistencia a los antibióticos y el factor de transcripción neurogénico, controlado por los elementos reguladores y sensibles a la tetraciclina.

El reactivo de transfección cargado positivamente mejora la fusión viral y la liberación de su contenido.

El ARN viral se transcribe inversamente en ADN y se integra en el ADN de la célula madre, lo que permite la expresión de elementos reguladores que producen proteínas activadoras.

Agregue un medio basal con derivado de tetraciclina, que forma un complejo con las proteínas activadoras.

Este complejo se une al elemento sensible a la tetraciclina, promoviendo la expresión génica y produciendo los factores de transcripción neurogénicos que inducen la diferenciación de las células madre en neuronas.

Agregue un medio basal con un medicamento antibiótico para eliminar las células no transfectadas.

Tratar las células con una solución de desprendimiento que contenga enzimas proteolíticas que degradan la matriz extracelular o ECM y liberan las células.

Retire las enzimas y vuelva a colocar las células en pocillos recubiertos de ECM con un medio de maduración, promoviendo la maduración neuronal.

Dos días antes de la inducción de la diferenciación, desprenda las células madre embrionarias agregando 1 mililitro de solución de desprendimiento celular e incubando a temperatura ambiente durante 10 minutos. Transfiera las células a un tubo. Luego, lave el pozo con 2 mililitros de medio y agréguelo al mismo tubo. Centrifugar las células a 300 veces g durante 5 minutos. Luego, vuelva a suspender el sedimento en el medio y coloque las celdas en placas de seis pocillos recubiertas de matriz a la densidad de asiento de 1 por 10 a las quintas celdas por pocillo.

Al día siguiente, agregue lentivirus que expresen Ngn2 más PuroR y transactivador de tetraciclina junto con polibeno en medio fresco de mantenimiento de células ES. El día cero, agregue 2 microgramos por mililitro de doxiciclina en medio DMEM / F12 suplementado con N2 y sin morfógenos. El primer día, agregue puromicina en DMEM / F12 fresco más N2 y doxiciclina hasta la concentración final de 1 microgramo por mililitro.

Seleccione las células transducidas en puromicina durante al menos 24 horas. El segundo día, separe las neuronas diferenciadoras con una solución de desprendimiento celular y vuelva a colocarlas en placas de 24 pocillos recubiertas con una solución de matriz. Mantenerlos en medio NBA/B27 sin doxiciclina. Cultive neuronas inducidas puras en las placas recubiertas con soluciones basadas en matriz extracelular.