El ditranol como una matriz para láser asistida por matriz de desorción / ionización de imágenes en una transformada de Fourier de iones de resonancia de ciclotrón Espectrómetro de Masas

Este procedimiento localiza espacialmente múltiples lípidos endógenos dentro de un cristalino bovino. Utilizando la técnica de ionización por dessorción láser asistida por matriz, imágenes de espectrometría de masas. En primer lugar, prepare una sección delgada de tejido de lente bovina y aplique una matriz múltiple, luego adquiera un conjunto de datos de espectro de masas maldi.

Procese el conjunto de datos en una representación visual de los lípidos detectados en la sección de tejido del cristalino. En conjunto, estos resultados pueden determinar la ubicación y la abundancia relativa de los lípidos dentro de una lente bovina y producir una representación visual de esta distribución. En comparación con otros métodos, como la extracción de lípidos seguida del análisis LCMS, las imágenes de espectrometría de masas de Maldi permiten la visualización de múltiples lípidos simultáneamente sin perder su localización espacial. Retire las muestras de tejido congelado rápidamente del almacenamiento a menos 80 grados centígrados.

Retire la cápsula de la superficie de la lente para fijar una sección completa de la lente de un ternero bovino. Coloque una o dos gotas de agua en la etapa de corte de tejido de un criostato. Coloque rápidamente la lente en el agua antes de que se solidifique cuando el criostato se haya equilibrado a la temperatura óptima.

Corta el tejido ecuatorialmente en secciones de 20 micras de grosor. Deseche las primeras secciones de tejido y use solo cortes que estén cerca del plano ecuatorial o agregue el plano ecuatorial para obtener imágenes del tejido del lente ocular. Agregue 1,5 microlitros de ácido fórmico para humedecer previamente la superficie de un portaobjetos de vidrio recubierto de ITO.

A continuación, transfiera con cuidado las secciones de tejido al portaobjetos dentro del criostato. A continuación, liofilizar los portaobjetos durante 15 minutos antes de la aplicación de la matriz maldi. Con un bolígrafo de líquido corrector, agregue tres marcas de enseñanza en la superficie no conductora del portaobjetos de vidrio recubierto de ITO.

Ahora tome una imagen óptica del portaobjetos de tejido utilizando un escáner plano y guárdela en un formato adecuado, como TIFF o jpeg. Primero, cubra los bordes de la superficie frontal de los portaobjetos de vidrio recubiertos de ITO con cinta adhesiva para que la matriz no cubra los bordes del portaobjetos. Prepare la matriz para ser utilizada en un solvente apropiado.

A continuación, aplique soluciones matriciales a las superficies de las secciones de tejido. Cubra el portaobjetos de vidrio utilizando 20 ciclos de recubrimiento de matriz. Alternativamente, se puede utilizar un pulverizador de aerógrafo asistido neumáticamente para aplicar las matrices si un disolvente es incompatible con el pulverizador de matriz electrónica.

Para la solución de calibración de masas, diluya la solución estándar de la mezcla de sintonización ES por un factor de uno a 200 en 60% Isopropanol introdujo dos microlitros por minuto de la solución diluida de la mezcla de sintonización ES en la fuente de iones de ionización por electropulverización de modo dual en el instrumento para cuatro ms de resonancia de ciclotrón de iones transformados. Opere el instrumento F-T-I-C-R en el modo ESI de iones positivos con detección de banda ancha y un tamaño de adquisición de datos de 1024 kilobytes por segundo. Por lo general, configure los parámetros ESI de voltaje de electropulverización capilar de 3, 900 voltios.

Un voltaje de protección de pulverización de 3, 600 voltios nebulizador flujo de gas nitrógeno a dos litros por minuto. Flujo de gas nitrógeno seco a cuatro litros por minuto y temperatura de 200 grados centígrados. También configure el skimmer un voltaje a 15 voltios.

Tiempo de vuelo a 0,01 segundos: flujo de gas argón de colisión a 0,4 litros por segundo, tiempo de acumulación de iones de la fuente a 0,1 segundos y tiempo de acumulación de iones de la celda de colisión a 0,2 segundos. Ahora ajuste los parámetros de operación F-T-I-C-R para maximizar la sensibilidad analítica en el rango de masa de la relación masa-carga de 200 a 1400 mientras se mantienen buenas señales de decaimiento de inducción libre en el dominio del tiempo. A continuación, adquiera los espectros de masas ESI y calibre el instrumento utilizando las masas de referencia de los compuestos estándar en la solución de mezcla de afinación E.

Para ajustar el instrumento para el funcionamiento de MALDI, disuelva varias alícuotas de un microlitro de una solución estándar mixta de turina e INE en la solución de matriz a una concentración de un micromolar cada una y coloque estas soluciones directamente en una de las secciones de tejido de la muestra. Coloque el portaobjetos en un adaptador de portaobjetos de tejido y cargue el adaptador desde el lado MALDI en la fuente de iones maldi ESI dual. A continuación, optimice los parámetros de funcionamiento MALDI adecuados para la potencia del láser y el número de disparos láser para la acumulación de señal MALDI para cada escaneo masivo.

Después de ajustar, calibrar y optimizar el instrumento para los experimentos maldi MSI, alinee la ubicación física de una sección de tejido que se va a fotografiar con su imagen óptica grabada dentro del software de imágenes. Alinee las tres marcas de líquido corrector utilizando un método de triangulación de tres puntos. A continuación, comience una operación simultánea de ESI MALDI de modo que cada espectro de masas contenga los picos de masa de referencia de la solución de mezcla de sintonización E ES para la calibración de masa interna posterior a la adquisición.

En primer lugar, atenúe la señal ESI disminuyendo el voltaje capilar hasta que las señales MALDI dominen los espectros, mientras que las señales de calibre ESI aún son lo suficientemente altas para la calibración de masa interna. A continuación, configure un método de rasing automatizado para el láser de radiación. Usando un análisis de puntos aleatorios.

Defina las regiones de tejido que se van a visualizar y establezca el tamaño de paso de RA láser adecuado. Calibre los espectros de masas MALDI utilizando la calibración interna para la comparación inicial, y para seleccionar picos para el isótopo MSMS y seleccione los picos monoisotópicos utilizando un script VBA personalizado y exporte las listas de picos monoisotópicos resultantes. Introduzca los valores medidos de la relación masa-carga en las bases de datos del metaboloma Melin nine y/o HMDB para que la masa coincida con las entradas de la biblioteca.

A continuación, genere imágenes maldi para todas las entidades lipídicas detectadas en toda la sección de tejido utilizando un software de imágenes con un ancho de filtro de masa de una parte por millón en el ápice máximo. Una vez que se han generado las imágenes para todos los valores de relación masa-carga que coinciden con las entradas de la base de datos, también se generan imágenes para todos los demás picos para buscar patrones de distribución únicos que se pueden investigar más adelante para algunos tejidos específicos, como el cristalino bovino. A menudo se observa un desgarro extenso del tejido cuando se utiliza el montaje de descongelación directa.

El preco del portaobjetos IT OAS con etanol o ácido fórmico ayuda a mantener la integridad de las secciones de tejido durante el montaje del tejido. Tanto la elección de la matriz como la selección del disolvente son factores importantes que influyen en la calidad de los espectros MALDI. Estos ejemplos comparan un espectro producido con un solvente de matriz eficiente con una mala elección de solvente de matriz para diol.

Una vez que se ha adquirido el conjunto de espectros de masas de un experimento Maldi MSI, se puede generar la imagen de cada uno de los iones detectados. Cada píxel representa un punto de irradiación láser desde la superficie de una sección de tejido. Las concentraciones relativas de los analitos se pueden detallar en las diferentes porciones de la sección de tejido.

En la mayoría de los experimentos, los datos se normalizan como la corriente iónica total dentro de cada espectro. Sin esta normalización, las áreas con mejor matriz de analitos, la cristalización de COC podría causar señales más fuertes para los analitos, y esto sesgaría los datos. La preparación de tejidos también puede cambiar drásticamente la imagen que se genera.

Si la muestra está demasiado húmeda, los analitos se deslocalizarán en el tejido y se perderá gran parte de la información espacial. Esta demostración de un experimento de imagen de tejido en lente ocular utilizó diol como un Matrixx múltiple para determinar la distribución espacial de los lípidos por F-T-I-C-R-M-S. La obtención de imágenes de lípidos en diferentes tipos de tejidos se puede lograr utilizando diol u otra matriz de manera similar.