El ditranol como una matriz para láser asistida por matriz de desorción / ionización de imágenes en una transformada de Fourier de iones de resonancia de ciclotrón Espectrómetro de Masas

Este procedimiento localiza espacialmente múltiples lípidos endógenos dentro de un cristalino bovino. Utilizando la técnica de ionización por desorción láser asistida por matriz, imagen espectrométrica de masas. Primero, prepare una sección delgada de tejido de cristalino bovino y aplique una multimatriz, luego adquiera un conjunto de datos espectrométricos de masas MALDI.

Procese el conjunto de datos para obtener una representación visual de los lípidos detectados en la sección de tejido del cristalino. En conjunto, estos resultados pueden determinar la ubicación y abundancia relativa de los lípidos dentro de un cristalino bovino y generar una representación visual de esta distribución. En comparación con otros métodos, como la extracción de lípidos seguida de análisis por LCMS, la imagen por espectrometría de masas MALDI permite la visualización simultánea de múltiples lípidos sin perder su localización espacial. Retire las muestras de tejido congeladas rápidamente del almacenamiento a menos 80 grados Celsius.

Retire la cápsula de la superficie del cristalino para fijar una sección completa del cristalino de ternera. Coloque una o dos gotas de agua sobre la plataforma de corte del criostato. Coloque rápidamente el cristalino en el agua antes de que esta se solidifique, una vez que el criostato haya alcanzado la temperatura óptima.

Corte el tejido en secciones de 20 micrones de grosor mediante cortes ecuatoriales. Deseche las primeras secciones del tejido y utilice únicamente rebanadas cercanas al plano ecuatorial o que lo incluyan para la obtención de imágenes del tejido del cristalino ocular. Añada 1,5 microlitros de ácido fórmico para humedecer previamente la superficie de una portaobjetos recubierta con ITO.

Luego, transfiera cuidadosamente las secciones de tejido al portaobjetos dentro del criostato. A continuación, liofilice los portaobjetos durante 15 minutos antes de la aplicación de la matriz MALDI. Utilizando un bolígrafo de tinta correctora, agregue tres marcas de alineación sobre la superficie no conductiva del portaobjetos de vidrio recubierto con ITO.

Ahora tome una imagen óptica de la laminilla de tejido utilizando un escáner plano y guárdela en un formato adecuado, como TIFF o jpeg. Primero, cubra los bordes de la superficie frontal de las laminillas de vidrio recubiertas con ITO usando cinta adhesiva para que la matriz no recubra los bordes de la laminilla. Prepare la matriz para su uso en un disolvente adecuado.

Luego aplique soluciones de matriz sobre las superficies de las secciones de tejido. Recubra el portaobjetos de vidrio utilizando 20 ciclos de recubrimiento con matriz. Alternativamente, se puede usar un pulverizador asistido neumáticamente si el disolvente es incompatible con el pulverizador electrónico de matriz.

Para la solución de calibración de masa, diluya la solución estándar de mezcla de ajuste de ES en un factor de uno a 200 en isopropanol al 60%. Introduzca dos microlitros por minuto de la solución diluida de mezcla de ajuste de ES en la fuente de ionización por electroaspersión en modo dual del instrumento para un espectrómetro de resonancia ciclotrónica de iones transformado por transformada de Fourier. Operar el instrumento F-T-I-C-R en modo ESI de iones positivos con detección de banda ancha y un tamaño de adquisición de datos de 1024 kilobytes por segundo. Generalmente, ajuste los parámetros de ESI a un voltaje de electroaspersión en la cápsula de 3.900 voltios.

Un voltaje del escudo de pulverización de 3.600 voltios, flujo de gas nitrógeno nebulizador a dos litros por minuto. Flujo de gas nitrógeno seco a cuatro litros por minuto y temperatura de 200 grados Celsius. También establezca el voltaje del skimmer uno en 15 voltios.

Tiempo de vuelo de 0,01 segundos, flujo de gas de argón de colisión de 0,4 litros por segundo, tiempo de acumulación de iones en la fuente de 0,1 segundo y tiempo de acumulación de iones en la celda de colisión de 0,2 segundos. Ajuste ahora los parámetros de operación del F-T-I-C-R para maximizar la sensibilidad analítica en el rango de masas de relación masa/carga de 200 a 1400, manteniendo buenas señales de decaimiento por inducción libre en el dominio del tiempo. Luego, adquiera los espectros de masas por ESI y calibre el instrumento utilizando las masas de referencia de los compuestos estándar en la solución de mezcla de ajuste E es.

Para ajustar el instrumento para su funcionamiento en modo MALDI, disuelva varias alícuotas de un microlitro de una solución estándar mixta de turina y INE en la solución de matriz a una concentración de un micromolar cada una, y aplique estas soluciones directamente sobre una de las secciones de tejido muestral. Coloque el portaobjetos en un adaptador para portaobjetos tisulares y cargue el adaptador desde el lado MALDI en la fuente iónica dual ESI-MALDI. A continuación, optimice los parámetros operativos MALDI adecuados para la potencia del láser y el número de disparos láser necesarios para la acumulación de la señal MALDI en cada escaneo de masas.

Después de ajustar, calibrar y optimizar el instrumento para experimentos de IMS MALDI, alinee la ubicación física de una sección de tejido que se va a imaginar con su imagen óptica registrada dentro del software de adquisición. Alinee las tres marcas de líquido corrector utilizando un método de triangulación de tres puntos. Luego, inicie una operación simultánea de ESI MALDI para que cada espectro de masas contenga los picos de masa de referencia de la solución de mezcla de ajuste E ES para la calibración interna de masa posterior a la adquisición.

Primero, atenúe la señal de ESI reduciendo el voltaje del capilar hasta que las señales de MALDI dominen los espectros, mientras que las señales de calibración interna de masa de ESI aún sean lo suficientemente altas. A continuación, configure un método automatizado de barrido para el láser de radiación. Utilizando un análisis de puntos aleatorios.

Defina las regiones del tejido que se van a imaginar y establezca el tamaño de paso RA del láser adecuado. Calibre los espectros de masas MALDI utilizando calibración interna para la comparación inicial y para seleccionar picos para MS/MS de isótopos y seleccione los picos mono-isotópicos utilizando un script personalizado en VBA, luego exporte las listas resultantes de picos mono-isotópicos. Introduzca los valores medidos de la relación masa a carga en las bases de datos de metabolomos Melin nueve y/o HMDB para coincidencia de masas con las entradas de la biblioteca.

A continuación, genere imágenes MALDI para todas las entidades lipídicas detectadas en toda la sección de tejido utilizando un software de imágenes con un ancho de filtro de masa de una parte por millón en el ápice del pico. Una vez que se hayan generado imágenes para todos los valores de relación masa/carga que coincidan con las entradas de la base de datos, genere también imágenes para todos los demás picos con el fin de buscar patrones de distribución únicos que puedan investigarse posteriormente en algunos tejidos específicos, como el cristalino de bovino. A menudo se observa un desgarro extenso del tejido cuando se utiliza el montaje por descongelación directa.

El pretratamiento del portaobjetos IT OAS con etanol o ácido fórmico ayuda a mantener la integridad de las secciones de tejido durante la montadura del tejido. Tanto la elección de la matriz como la selección del disolvente son factores importantes que influyen en la calidad de los espectros MALDI. Estos ejemplos comparan un espectro producido con un disolvente de matriz eficiente frente a una mala elección de disolvente de matriz para el diol.

Una vez adquirido el conjunto de espectros de masas procedentes de un experimento de IMS por MALDI, se puede generar la imagen de cada uno de los iones detectados. Cada píxel representa un punto de irradiación láser en la superficie de una sección de tejido. Las concentraciones relativas de los analitos pueden detallarse en las diferentes regiones de la sección de tejido.

En la mayoría de los experimentos, los datos se normalizan según la corriente iónica total dentro de cada espectro. Sin esta normalización, las áreas con mejor matriz analito-COC podrían provocar señales más intensas para los analitos, lo que sesgaría los datos. La preparación del tejido también puede alterar drásticamente la imagen que se genera.

Si la muestra está demasiado húmeda, entonces los analitos se deslocalizarán en el tejido y se perderá gran parte de la información espacial. Esta demostración de un experimento de imagen de tejidos en el cristalino ocular utilizó diol como una matriz múltiple para determinar la distribución espacial de lípidos mediante F-T-I-C-R-M-S. La obtención de imágenes de lípidos en diferentes tipos de tejido puede lograrse usando diol u otra matriz de manera similar.