La microinyección de una sola célula de Análisis de Comunicación Móvil
February 26th, 2017
Se describe aquí cómo realizar una microinyección de una sola célula de Lucifer amarillo para visualizar la comunicación celular a través de las uniones gap-en las células vivas, y proporcionar algunos consejos útiles. Esperamos que este documento ayudará a cada uno para evaluar el grado de acoplamiento celular debido a uniones gap funcionales. Todo lo descrito aquí podría ser, en principio, adaptado a otros colorantes fluorescentes con peso molecular inferior a 1.000 Daltons.
Hola, mi nombre es Anael. Trabajo en la Fundación Oswaldo Cruz en el Laboratorio de Comunicación Celular. Estudiamos aquí los receptores P2 y la inyección de gap en el contexto del sistema inmune y el hígado.
Hoy, les presentaré la microinyección de células. Las inyecciones de espacio desempeñan algunas funciones fisiológicas como la transmisión de sinapsis, las contracciones cardíacas y otras. Para esta técnica, podemos estudiar si las inyecciones de gap son funcionales o no.
Bien, veamos los componentes básicos de la configuración de microinyección. Aquí tenemos el microscopio de fluorescencia invertida donde veremos las células. Se trata de una cámara CCD para registrar los resultados.
Tenemos aquí el generador de corriente con el que introduciremos el tinte en la célula. A continuación tenemos el soporte donde se conecta el microelectrodo. Y el micro-manipulador que está conectado al soporte y permite el movimiento del microelectrodo en los tres ejes, Z, Y y X. Antes de comenzar el experimento, tenemos que hacer el microelectrodo.
Utilizamos este capilar de vidrio de borosilicato y este equipo llamado polar. Aquí colocamos el capilar de borosilicato. Este filamento de tungsteno lo calentaremos para hacer dos microelectrodos.
Ahora el calentamiento del filamento de tungsteno y la onda aquí tiraremos hacia abajo para hacer los dos microelectrodos. Fácil. Nuestro primer paso es llenar el microelectrodo con el tinte. Un consejo aquí es que tienes que llenar solo la punta con unos pocos microlitros para hacer el experimento.
No es necesario llenarlo todo. Nota con más detalles. Llene solo la punta.
Comencemos un experimento. Aquí tenemos las células en la placa de Petri, en una solución de sodio. El cable plateado conectado al generador de corriente.
Ahora tenemos que colocar los microelectrodos en la etapa principal. Aquí, en la etapa principal, tenemos otro cable plateado también conectado al generador de corriente. Una vez colocado el microelectrodo, podemos introducirlo en el interior del baño.
Tenga en cuenta que la punta de la pipeta toca cuidadosamente la bañera. Este procedimiento se realiza con mucho cuidado para evitar el choque de la punta en el fondo de la placa de Petri. Una vez dentro de la bañera, podemos acudir al microscopio para buscar la sombra de la micropipeta.
Recomendamos que comencemos a mirar en la lente de aumento. Cuando encontremos la sombra de la pipeta, podemos mover el microelectrodo hacia la célula utilizando el micromanipulador. Una vez que está muy cerca de la celda, podemos hacer una prueba para verificar si el microelectrodo no está obstruido.
Cómo veremos a continuación. Aquí estamos viendo la micropipeta y estamos ajustando la micropipeta muy cerca de la célula. Podemos ver el movimiento de las células a derecha e izquierda.
Luego cambiamos al filtro, filtro de fluorescencia. Podemos aplicar pulso hiperpolarizador para comprobar si la punta de la pipeta no está obstruida. Dado que la micropipeta está dentro de la célula, podemos aplicar pulso hiperpolarizante para cargar la célula con el colorante.
Utilizamos aquí el tinte amarillo suelto y libre. Después de cargar la celda con el tinte, si las celdas vecinas están conectadas por inyecciones de espacio, esperamos unos minutos y veremos que las células vecinas se iluminan por la difusión del tinte por estas inyecciones de espacio. En nuestro experimento podemos ver cinco células, marcadas con estrellas, que muestran fluorescencia.
Aquí hay un buen ejemplo de un experimento de microinyección en células epiteliales tímicas, en A y B.In las figuras C y D, muestra una microinyección en célula tímica inerte de color amarillo libre suelto y otro colorante, no permeable a la inyección de huecos mostrado en el inserto. La línea celular epitelial tímica de la figura E y F microinyectada con amarillo libre suelto y en el inserto amarillo libre suelto y un bloque de inyección de espacio. Los resultados muestran que el amarillo libre suelto no se extendió a las células vecinas.
A continuación vemos una microinyección en células epiteliales tímicas, en presencia de dexametasona y la cuantificación en B. La dexametasona aumentó el grado de acoplamiento, como se muestra en la figura B. De 100 inyecciones, el número de tres o cuatro células conectadas fue más frecuente en presencia de este fármaco. Espero poder ayudar a los principiantes a hacer esta importante técnica para el estudio de la comunicación celular. Gracias y adiós.
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Visión general
Este artículo describe la técnica de microinyección unicelular de Lucifer Yellow para visualizar la comunicación celular a través de uniones comunicantes en células vivas. Proporciona consejos prácticos para que los investigadores evalúen el acoplamiento celular debido a uniones comunicantes funcionales.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Comunicación celular
- Neurociencia
- Inmunología
Fundamentos
- Las uniones comunicantes juegan roles críticos en procesos fisiológicos.
- Están involucradas en la transmisión sináptica y las contracciones cardíacas.
- Entender su funcionalidad es esencial para varios estudios biológicos.
- Lucifer Yellow es un colorante fluorescente utilizado para la visualización.
Propósito del estudio
- Demostrar la técnica de microinyección para estudiar las uniones comunicantes.
- Evaluar el grado de acoplamiento celular en células vivas.
- Proporcionar información sobre la funcionalidad de las uniones comunicantes.
Métodos utilizados
- Microinyección unicelular de Lucifer Yellow.
- Visualización de la comunicación celular.
- Evaluación de uniones comunicantes funcionales.
- Adaptación de la técnica para otros colorantes fluorescentes.
Resultados principales
- Visualización exitosa de la comunicación celular a través de uniones comunicantes.
- Evaluación del acoplamiento celular demostrada.
- Técnica aplicable a varios colorantes fluorescentes con un peso molecular inferior a 1,000 Daltons.
- Información sobre los roles fisiológicos de las uniones comunicantes proporcionada.
Conclusiones
- La técnica de microinyección es efectiva para estudiar las uniones comunicantes.
- Lucifer Yellow sirve como una herramienta útil para la visualización.
- Los hallazgos contribuyen a la comprensión de la comunicación celular en sistemas vivos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Single-cell microinjection enables direct assessment of gap junction functionality, a key mechanism in cellular communication relevant to drug target validation in neuroscience, immunology, and tissue engineering. By visualizing real-time dye diffusion, researchers can evaluate compound effects on intercellular coupling, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides quantitative, functional readouts that improve target confidence and inform go/no-go decisions in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether a target modulates gap junction-mediated communication.
- Operational Value: Enables functional validation of connexin or hemichannel targets in live cells.
- Predictive Value: Supports pathway clarification and biological de-risking through direct observation of dye transfer.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated cellular systems for compound screening by establishing baseline coupling.
- Quantitative Output: Measures diffusion kinetics as a functional readout for assay standardization.
- Scalability: Adaptable to high-content imaging platforms for multi-condition comparison.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models physiological processes like synaptic transmission and heart contraction where gap junctions are implicated.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to preclinical models by confirming functional coupling in relevant cell types.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement based on evidence of target engagement in cellular networks.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to assess target effects on cellular communication before progressing to phenotypic screening or lead optimization.
- Discovery Biology: Tests hypothesis that a compound or genetic modulator alters intercellular signaling via gap junctions.
- Screening: Generates reproducible, quantitative fluorescence data to compare treatment conditions.
- Analytics: Provides measurable diffusion metrics that enable statistical comparison of coupling efficiency.
- Translational Research: Uses epithelial and immune-relevant cell lines to model tissue-level communication.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating connexin-targeting compounds across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by confirming functional target modulation in a native cellular context.
- Operational Value: Standardizes microinjection and imaging protocols for reproducible results across labs.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by identifying ineffective modulators of cellular coupling early.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of compounds demonstrating gap junction modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, fluorescence microscopy, and dye handling.
- Depends on micromanipulator stability, electrode preparation, and intracellular injection precision.
- Necessitates standardized cell preparation and bath conditions to ensure consistent results.
- Must account for cell type variability in connexin expression and baseline coupling.
- Limited to dyes under ~1,000 Da that can pass through gap junctions, as larger molecules remain cell-autonomous.
