Seguimiento de cambios inducidos por fármacos en los receptores post-internalización Trata de Análisis Colocalizational

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar cuantitativamente la colocalización espacial de pares de objetivos, en este caso, examinando el tráfico de receptores inducido por fármacos. Esto se logra tratando células cultivadas vivas con un fármaco para inducir un tráfico alterado de receptores. Como segundo paso, la doble marcación inmunológica de los receptores diana y los compartimentos intracelulares de tráfico permite la localización espacial de los pares de objetivos mediante microscopía confocal multicanal a continuación.

El análisis cuantitativo de colocalización se utiliza para medir la tendencia de los receptores diana y los compartimentos a encontrarse en el mismo lugar. Los resultados muestran cambios en el tráfico de receptores tras el tratamiento con fármacos, basados en la colocalización de receptores y compartimentos de tráfico intracelular. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la colocalización por superposición es que proporciona medidas cuantificadas de colocalización, lo que permite análisis mucho más potentes y diseños experimentales complejos.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el tráfico de receptores, también puede aplicarse para analizar cambios en la colocalización espacial de prácticamente dos proteínas cualesquiera en células cultivadas. Para comenzar este procedimiento, retire el medio de crecimiento original y sustitúyalo por medio que contenga el fármaco de interés en la concentración elegida. A continuación, incube las células en las condiciones de crecimiento originales durante el tiempo de tratamiento seleccionado.

Después de la incubación, lave suavemente las células con un mililitro de tampón de lavado cada vez, durante tres veces. Fije las células con 300 microlitros de paraformaldehído al 4 % en PBS 0,1 molar durante 10 minutos a 37 grados Celsius. Luego, lave nuevamente las células con un mililitro de tampón de lavado cada vez, durante tres veces.

Posteriormente, incubar las células en 300 microlitros de tampón de bloqueo durante dos horas a temperatura ambiente. Después, incubar las células con el anticuerpo primario en 300 microlitros de diluyente de anticuerpos durante 48 horas a cuatro grados Celsius. A continuación, lavar las células suavemente con un mililitro de tampón de lavado cada vez, durante tres veces.

A continuación, incubar las células con el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo en 300 microlitros de diluyente para anticuerpos durante una hora a temperatura ambiente, protegiendo las células de la luz. Tras una hora, lavar las células suavemente con un mililitro de tampón de lavado cada vez, durante tres veces. Para retirar la cubeta de la placa de 24 pocillos, sostener la placa a 45 grados.

Coloque la punta de un par de pinzas finas en el borde superior del cubreobjetos, donde este entra en contacto con el fondo del pocillo. Luego, incline suavemente el cubreobjetos en el tampón de lavado alejándolo del fondo del pocillo. El cubreobjetos quedará apoyado contra la pared del pocillo, donde podrá retirarse fácilmente con las pinzas.

Luego, monte las laminillas con las células hacia abajo sobre portaobjetos con medio de montaje antidesvanecimiento utilizando un objetivo de alta magnificación de 100 x. Primero, localice una célula representativa que se va a imaginar usando fluorescencia epiluminiscente. A continuación, configure los ajustes de captura de imagen. Registre imágenes tiff sin comprimir de ocho bits de cada canal marcado para imaginar cada canal secuencialmente y promedie entre cuatro y seis escaneos para la imagen final.

Luego cambie al recorrido de imagen confocal y enfoque en un plano Z que atraviese el centro de la célula. Optimice la potencia del láser del diafragma, así como el voltaje y el desplazamiento del tubo fotomultiplicador para cada canal. Registre estos ajustes y utilice los mismos para la adquisición de imágenes de todas las células marcadas para cualquier par de objetivos determinado.

En el mismo replicado, localice las células siguientes que se van a imaginar con un objetivo de alto aumento. Utilizando fluorescencia epiescopia, cambie al recorrido de imagen confocal y enfoque en un plano Z que atraviese el centro de la célula, si está disponible. Use la función de recorte de zoom del software para restringir el área de escaneo a la célula de interés. Posteriormente.

Capture imágenes para cada canal marcado utilizando los ajustes establecidos previamente, y repita los procedimientos para obtener imágenes de 15 o más células por condición y por réplica. Para garantizar una recolección suficiente de muestras. En este procedimiento, abra el par de imágenes de una célula en ImageJ. Utilice el comando de combinación de canales de color de la imagen para generar una imagen RGB.

Luego, dibuje alrededor de la célula de interés. Utilice el complemento ImageJ SC Colocalization para cuantificar la colocalización de los objetivos en la célula seleccionada. Registre la medida de colocalización deseada y repita el procedimiento para cada célula de la imagen.

A continuación, calcule la media de los valores de colocalización registrados de las condiciones de control comunes de cada réplica de cada condición de marcado. Multiplique las medias por menos uno para obtener el desplazamiento para cada réplica en cada condición de marcado. Luego, sume el desplazamiento de cada réplica en cada condición de marcado a cada valor de colocalización en dicha réplica.

Esto normalizará los datos de manera que la medida media de colocalización para la condición de control común sea cero en cada réplica de cada condición de marcado. Después de eso, todos los datos de todas las réplicas de cada condición de marcado permitirán el análisis de los cambios en la colocalización a través de las réplicas. Aquí se muestran cultivos primarios de neuronas sensoriales de ganglios de la raíz dorsal que fueron expuestos a tratamientos prolongados y agudos con fármacos. Las células fueron luego marcadas inmunológicamente para receptores de opioides delta y un marcador de endosomas de reciclaje con pares distintos de anticuerpos primarios y secundarios, y se imaginarón mediante microscopía confocal secuencial de dos canales.

Además del posterior análisis y cuantificación de la colocalización, estas imágenes representativas se procesaron para generar mapas de colocalización en falso color que se muestran aquí. Se comparan las puntuaciones medias de colocalización de los receptores delta de opioides y los marcadores de endosomas tempranos, endosomas de reciclaje y lisosomas —la colocalización del receptor con cada compartimento— entre grupos que recibieron diferentes tratamientos agudos con fármacos, y se observan los cambios inducidos por los fármacos en el tráfico del receptor. Al realizar este procedimiento, es importante recordar obtener micrografías de alta calidad y consistentes para permitir un análisis cuantitativo válido.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un análisis cuantitativo de colocalización.