Seguimiento de cambios inducidos por fármacos en los receptores post-internalización Trata de Análisis Colocalizational

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar cuantitativamente la colocalización espacial de los pares de diana, en este caso, examinando el tráfico de receptores inducido por fármacos. Esto se logra mediante el tratamiento de células vivas cultivadas con fármaco para inducir el tráfico de receptores alterados. Como segundo paso, el doble marcaje inmunológico de los receptores diana y los compartimentos de tráfico intracelular permiten la localización espacial de los pares diana mediante microscopía confocal multicanal.

El análisis cuantitativo de colocalización se utiliza para medir la tendencia de los receptores y compartimentos diana a encontrarse en el mismo lugar. Los resultados muestran cambios en el tráfico de receptores después del tratamiento farmacológico basados en la colocalización de los compartimentos de receptores y tráfico intracelular. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la colocalización por superposición, es que proporciona medidas cuantificadas de colocalización, lo que permite análisis mucho más potentes y diseños experimentales complejos.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el tráfico de receptores, también se puede aplicar a los cambios en la colocalización espacial de casi dos proteínas cualesquiera en células cultivadas. Para comenzar este procedimiento, retire el medio de crecimiento original y reemplácelo con un medio que contenga el medicamento de interés en la concentración elegida. A continuación, incube las células en las condiciones de crecimiento originales durante la duración del tratamiento elegida.

Después de la incubación, lave las células suavemente con un mililitro de tampón de lavado cada vez durante tres veces. Fije las celdas con 300 microlitros de formaldehído al 4% en PBS 0.1 molar durante 10 minutos a 37 grados Celsius. A continuación, vuelva a lavar las células con un mililitro de tampón de lavado cada vez tres veces.

Posteriormente, incubar las células en 300 microlitros de tampón de bloqueo durante dos horas a temperatura ambiente. A continuación, incubar las células con anticuerpo primario en 300 microlitros de diluyente de anticuerpos durante 48 horas a cuatro grados centígrados. A continuación, lave las células suavemente con un mililitro de tampón de lavado cada vez durante tres veces.

A continuación, incubar las células con anticuerpo secundario conjugado con flúor en 300 microlitros de diluyente de anticuerpos durante una hora a temperatura ambiente y proteger las células de la luz. Después de una hora, lave las células suavemente con un mililitro de tampón de lavado cada vez durante tres veces. Para quitar el deslizamiento de la cubierta de la placa de 24 pocillos, sostenga la placa a 45 grados.

Coloque la punta de un par de pinzas finas en el borde superior del cubreobjetos donde se encuentra con el piso del pozo. A continuación, incline suavemente el cubreobjetos del tampón de lavado lejos del suelo del pozo. El cubreobjetos se apoyará contra la pared del pocillo, donde se puede quitar fácilmente con pinzas.

A continuación, monte los cubreobjetos con las células hacia abajo sobre portaobjetos de microscopio con medio de montaje antidecoloración utilizando un objetivo de aumento de 100 aumentos. En primer lugar, localice una célula representativa para obtener imágenes mediante epifluorescencia. A continuación, configure los ajustes de captura de imágenes Grabe imágenes tiff de ocho bits sin comprimir de cada canal etiquetado para obtener una imagen secuencial de cada canal y para promediar de cuatro a seis escaneos para la imagen final.

A continuación, cambie a la ruta de imagen confocal y enfoque en un plano Z a través del centro de la célula. Optimice la potencia del láser estenopeico y el voltaje y la compensación del tubo fotomultiplicador para cada canal. Registre estos ajustes y utilice los mismos ajustes para obtener imágenes de todas las celdas etiquetadas para cualquier par de objetivos determinado.

En el mismo Replicar las siguientes células del localizador que se van a visualizar con un objetivo de gran aumento. Con la epifluorescencia, cambie a la ruta de imagen confocal y enfoque en un plano Z a través del centro de la celda si está disponible. Utilice la función de recorte de zoom del software para restringir el área de escaneo a la celda de interés. Después.

Capture imágenes para cada canal etiquetado utilizando la configuración establecida anteriormente y repita los procedimientos para crear una imagen de 15 o más celdas por condición por réplica. Para asegurar una recolección suficiente de muestras. En este procedimiento, abra el par de imágenes de una celda en la imagen J.Utilice el comando image color merge channels para generar una imagen RGB.

A continuación, dibuja alrededor de la celda de interés. Utilice el complemento de imagen j de la colocalización SC para cuantificar la colocalización de los objetivos en la celda seleccionada. Registre la medida de colocalización deseada y repita el procedimiento para cada celda de la imagen.

A continuación, calcule la media de los valores de colocalización registrados de las condiciones de control comunes de cada réplica de cada condición de etiquetado. Multiplique las medias por menos uno para obtener el desplazamiento de cada réplica en cada condición de etiquetado. A continuación, agregue el desplazamiento de cada réplica en cada condición de etiquetado a cada valor de colocalización en esa réplica.

Esto normalizará los datos de modo que la medida de colocalización media para la condición de control común sea cero en cada réplica de cada condición de etiquetado. Después de eso, todos los datos de todas las réplicas de cada condición de marcaje permitirán el análisis de los cambios en la colocalización entre las réplicas. Aquí se muestran los cultivos primarios de neuronas sensoriales de los ganglios de la raíz dorsal que fueron expuestos a tratamientos farmacológicos prolongados y agudos. A continuación, las células se marcaron inmunológicamente para los receptores opioides delta y un marcador de endosomas reciclados con distintos pares de anticuerpos secundarios primarios y se obtuvieron imágenes mediante microscopía confocal secuencial de dos canales.

Además de la posterior colocalización y análisis cuantitativo, estas imágenes representativas se procesaron para generar mapas de colocalización de color falso que se muestran aquí. Se comparan las puntuaciones medias de colocalización de los receptores opioides delta y los marcadores de endosomas tempranos, el reciclaje de endosomas y la colocalización de los receptores de lisosomas con cada compartimento entre grupos que reciben diferentes tratamientos farmacológicos agudos y se observan cambios inducidos por fármacos en el tráfico de receptores. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe adquirir micrografías consistentes de alta calidad para permitir un análisis cuantitativo válido.

Después de ver este vídeo, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un análisis de colocalización cuantitativa.