Visualizar la interacción entre la proteína marcada Qdot y λ Site-specifically modificada de ADN en el nivel de molécula única

Este método puede ayudar a responder a las preguntas clave en el campo de la obtención de imágenes de moléculas individuales de las interacciones entre las proteínas del ADN, como la replicación del ADN, la reparación de genes y el mantenimiento de la estructura de los cromosomas. La principal ventaja de esta técnica es que se puede obtener ADN lambda modificado con alto contenido de colágeno y luego curar rápidamente las proteínas marcadas. La demostración visual de este método es fundamental porque los pasos de ensamblaje de la celda de flujo son difíciles de aprender.

Para limpiar los cubreobjetos, coloque 20 cubreobjetos en cuatro frascos de tinción, vierta etanol en ellos y sonique durante 30 minutos en etanol. A continuación, enjuague los cubreobjetos con agua ultrapura tres veces. A continuación, sonique los cubreobjetos con un molar de hidróxido de potasio durante 30 minutos y enjuague los cubreobjetos con agua ultrapura tres veces.

A continuación, repita la sonicación con etanol e hidróxido de potasio una vez. Sonicar los cubreobjetos con acetona durante 30 minutos y luego enjuagar bien con agua ultrapura. Ahora coloque los cubreobjetos en la solución de piraña e incube a 95 grados centígrados durante una hora.

Después de la incubación, enjuague los cubreobjetos con agua ultrapura cinco veces. A continuación, lave abundantemente cada cubreobjetos con agua ultrapura. Use papel para secar el cubreobjetos desde su borde y colóquelo en un frasco para teñir.

Seque completamente el cubreobjetos en un horno a 110 grados centígrados. Ahora enjuague el cubreobjetos con metanol y luego vuelva a colocar el frasco de tinción en el horno a 110 grados centígrados para secar el cubreobjetos. Para realizar la funcionalización del cubreobjetos, agregue 70 mililitros de solución de silano en cada frasco, enrosque la tapa y deje el frasco a temperatura ambiente durante la noche.

Lave los cubreobjetos con tres vasos de precipitados llenos de agua ultrapura. Seque bien los cubreobjetos con gas nitrógeno. Disuelva 150 miligramos de metoxi-PEG y seis miligramos de biotina-PEG en un mililitro de bicarbonato de sodio 0,1 molar recién preparado.

Centrifugar a 17.000 veces g durante un minuto para eliminar los PEG insolubles. Ahora pipetee 100 microlitros de solución de PEG en el centro del cubreobjetos silanizados y coloque otro cubreobjetos silanizado en la parte superior. Incube los cubreobjetos con solución de PEG durante al menos tres horas en la oscuridad.

Separe los pares de cubreobjetos y mantenga la superficie funcionalizada hacia arriba. Enjuague abundantemente los cubreobjetos con agua ultrapura y séquelos con gas nitrógeno. Ahora marque el lado funcionalizado de los cubreobjetos en una de las esquinas con un rotulador.

Coloque un cubreobjetos en un tubo de 50 mililitros perforado con un orificio en su tapa. Coloque el tubo en una bolsa de plástico, selle la bolsa con un sellador al vacío y guárdela a menos 20 grados centígrados. Para ensamblar la celda de flujo, corte un canal en el centro de un trozo de cinta adhesiva de doble cara con un perforador.

Despega el lado del papel de la cinta adhesiva de doble cara y pégala en un lado de vidrio con dos agujeros. Es más fácil eliminar las burbujas de aire despegando el lado del papel que el lado de plástico de la cinta adhesiva de doble cara. Presione la cinta para eliminar las burbujas de aire.

A continuación, corte un cubreobjetos funcionalizado en cuatro piezas con un trazador de vidrio con punta de diamante y retire los residuos con gas nitrógeno manteniendo el lado funcionalizado hacia arriba. Retire el lado de plástico de la cinta adhesiva de doble cara y pegue la corredera en el cubreobjetos funcionalizado. Presione suavemente para eliminar las burbujas de aire entre el cubreobjetos y la cinta.

La eliminación completa de las burbujas de aire puede proteger la celda de flujo de fugas mientras se bombean tampones hacia ella. Ahora inserte el tubo de entrada en el orificio pequeño e inserte el tubo de salida en el orificio grande. Fije el tubo con epoxi.

bombee manualmente 20 microlitros de estreptavidina de 0,2 miligramos por mililitro a la celda de flujo con una jeringa e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego, bombee el tampón de bloqueo a la celda de flujo para reemplazar la estreptavidina y mantenerla a temperatura ambiente. Obtenga la alineación focal del rojo y el rojo lejano con A5 en el portaobjetos de prueba de microscopio de fluorescencia número uno mediante excitación simultánea utilizando un láser de 532 nanómetros y un láser de 640 nanómetros.

Produzca imágenes de doble longitud de onda con óptica de división. Coloque la celda de flujo en el microscopio y conecte su tubo de salida a un tubo más largo que esté conectado a un resorte de 10 mililitros instalado en una bomba programable de extracción de infusión automatizada. Elimine las burbujas de aire en la celda de flujo inyectando un tampón de bloqueo y volteando el tubo de salida.

Añadir 0,5 microlitros de ADN lambda-ARS317 biotinilado en 80 microlitros de tampón de bloqueo. Bombee la mezcla preparada a la celda de flujo a 25 microlitros por minuto durante dos minutos. A continuación, enjuague el ADN lambda-ARS317 utilizando 200 microlitros de tampón de bloqueo a una velocidad de 50 microlitros por minuto.

Ahora bombee 200 microlitros de tampón aglutinante a una velocidad de 50 microlitros por minuto para eliminar el tampón de bloqueo en la celda de flujo. A continuación, agregue dos microlitros de ORC-Qdot705, un microlitro de DTT y un microlitro de ATP en 96 microlitros de tampón de unión. La concentración final de ORC-Qdot705 es de 0,2 nanomolares.

Después de bombear el tampón de unión como se detalla en el protocolo de texto, bombee 20 microlitros de la solución ORC-Qdot705 preparada a una velocidad de 10 microlitros por minuto en la celda de flujo. Elimine el exceso de ORC-Qdot705 con 200 microlitros de tampón aglutinante a una velocidad de 100 microlitros por minuto. A continuación, bombee el tampón de unión con 30 nanomolares SYTOX Orange en la celda de flujo para teñir los sustratos de ADN a una velocidad de 100 microlitros por minuto.

Por último, excite la señal ORC-Qdot705 con un láser de 405 nanómetros y excite la señal de ADN teñida de naranja SYTOX con un láser de 532 nanómetros. Observe las señales simultáneamente con un flujo de 100 microlitros por minuto utilizando un filtro de paso de banda cuádruple. Grabe las imágenes por EMCCD con 100 milisegundos por fotograma.

Aquí se muestra la ilustración del sustrato de ADN lambda-ARS317. El ORC marcado con Qdot705 fue excitado por un láser de 405 nanómetros. El ADN teñido de naranja SYTOX fue excitado por un láser de 532 nanómetros.

El resultado combinado sugiere que el ORC etiquetado con Qdot705 se enlaza en ARS317. El resultado de la distribución de la unión de ORC en el ADN lambda-ARS317 muestra que ORC se une a ARS317 con una alta abundancia. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el FRET de molécula única, para responder preguntas adicionales sobre las interacciones proteína-proteína y la dinámica de las proteínas.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la imagen fluorescente de una sola molécula exploraran las interacciones de las proteínas del ADN en sistemas reconstituidos de replicación y reparación del ADN in vitro. No olvide que trabajar con la solución Piranha puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de máscaras faciales protectoras, mientras se realiza este procedimiento.