Name: Juxtasomal Biocitina Etiquetado para estudiar la estructura-función de la relación de un individuo neuronas corticales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Aprende el etiquetado juxtasomal con biocitina para vincular la actividad eléctrica con la morfología neuronal en la corteza sensorial de ratas. Este método permite reconstruir la estructura tridimensional de neuronas individuales.

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Nos gustaría dar las gracias a los Profs. Huibert Mansvelder y Bert Sakmann de amplio apoyo, el Dr. Marcel Oberlaender para un debate fructífero y proporcionar rastreo neuronal, y Brendan Lodder para la asistencia técnica. Los datos fueron adquiridos utilizando el ntrode VI para LabVIEW, generosamente proporcionado por R. Bruno (Columbia Univ., NY, EE.UU.). Esta investigación fue apoyada por la Sociedad Max Planck y el Centro Bernstein para la Neurociencia Computacional, Tubinga (financiado por el Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (BMBF; FKZ: 01GQ1002)) (RTN), Centro de Investigación Cognitiva y Neurogenomics (CNCR) , Campus de Neurociencias Amsterdam (NCA), la financiación de CPJdK (NWO-ALW # 822.02.013 y ENC-red # p3-c3) y la Universidad VU de Amsterdam.

1. Preparación del animal Todos los procedimientos experimentales se llevan a cabo de conformidad con la ley holandesa y después de una evaluación por un comité de ética local de la Universidad VU de Amsterdam, Países Bajos. <ol><li> Anestesiar a un rata Wistar (P25-P45, ♂ / ♀) con isoflurano (2-3% en oxígeno) y, posteriormente, con uretano (20% en 0,9% de NaCl, 1.6 hasta 1.7 g / kg) por inyección intraperitoneal. Evaluar la profundidad de la anestesia mediante la supervisión de la retirada pellizco, los reflejos palpebrales, y los movimientos de vibrisas. </li><li> Administrar una dosis adicional de uretano (10% de la dosis inicial) en caso de que el animal no llega a suficiente profundidad de la anestesia o cuando se observan espasmos vibrisas durante el curso del experimento. </li><li> Colocar el animal anestesiado en el marco estereotáxico equipado con una almohadilla eléctrica, inserte la sonda de temperatura rectal y mantener la temperatura corporal del animal a 37,5 ± 0,5 ° C por una almohadilla térmica. </li><li&gt; posición de la cabeza del animal en el marco estereotáxico; cortar el pelo en la parte superior de la cabeza con unas tijeras para hacer que la piel visible. </li><li> Inyectar 100 l 1% de lidocaína (en 0,9% de NaCl) por vía subcutánea para la anestesia local en el sitio de operación y esperar 3-5 minutos. Retire la piel que cubre la superficie del cráneo por el corte en la dirección-caudal a rostral y limpiar el tejido restante. </li><li> Limpiar el cráneo extensamente con 0,9% de NaCl y hisopos absorbentes. </li><li> Determinar las coordenadas de la zona de destino en el hemisferio izquierdo (para la corteza somatosensorial primaria (S1): 2,5 mm posterior y 5,5 mm lateral al bregma). Marque la ubicación en el cráneo con un rotulador quirúrgico de la piel. </li><li> Raspar el hueso suavemente por un taladro dental de la región de interés hasta que el hueso se vuelve transparente y los vasos sanguíneos son claramente visibles. </li><li> Hacer un 0,5 mm x 0,5 mm craneotomía mediante la reducción de una ventana en el cráneo adelgazada con un escalpelo (# 11), evitando daños a la duramadrey los vasos sanguíneos. Opcional: marca los bordes de la craneotomía utilizando un rotulador quirúrgico de la piel para mejorar la visibilidad. </li><li> Aplicar una capa delgada de pegamento en el cráneo seco y luego cemento dental para construir un baño (es decir, cámara de registro) que encierra la craneotomía. </li><li> Recorte los bigotes en el lado contralateral a exactamente 5 mm desde el folículo bigote. Opcional: poner de relieve los bigotes cortados con rímel negro. </li></ol> 2. Juxtasomal Grabaciones y Biocitina Etiquetado <ol><li> Hacer pipetas de parche de vidrio de borosilicato con diámetro de la punta dentro de ~ 1 m para obtener electrodos con 3-5 MΩ de resistencia. Nota: La morfología de la pipeta ideal para la grabación juxtasomal es una reducción gradual esbelto, un ángulo de cono y un ~ 1 m de la punta (Figura 1). </li><li> Dependiendo de la profundidad de grabación (con respecto a la superficie de la pía madre), las dimensiones de la forma cónica del electrodo de registro se deben ajustar. Es de importancia crítica es que tque se estrechan diámetro debe ser inferior a 75 micras, con punto de entrada en el cerebro para evitar daños mecánicos o estrés en el área de grabación. Esto indica que para las grabaciones corticales superficiales, se requiere una conicidad de 300-500 micras con un diámetro exterior máximo de 75 micras (Figura 1A), mientras que las grabaciones de relativamente profundas capas corticales requieren una conicidad más largo de 1.500-1.800 m, de nuevo con máxima externa diámetro de 75 micras (a 1.800 m de la punta del electrodo). </li><li> Cargue el parche pipeta con el timbre de la rata normal (NRR), complementado con un 2% biocitina (véase la Tabla 1 para las soluciones y reactivos) y montar el parche pipeta en una etapa de la cabeza fija a un micromanipulador. </li><li> Ajuste el ángulo del soporte de electrodo a 34 ° con respecto al plano sagital para dirigirse específicamente a la columna de la D2 de S1 de rata. </li><li> Conecte la etapa de la cabeza a un amplificador en modo puente (es decir, la pinza de corriente). </li><li> Coloque el parchepipetear en estrecha proximidad a la craneotomía. Llene la bañera con 0,9% de NaCl y determinar la resistencia del electrodo que debe estar entre 3-5 MΩ, evaluada mediante la aplicación de un pulso cuadrado con inyección de corriente positiva (1 nA, 200 msec on / off). </li><li> Establecer sobrepresión de 100 a 150 mbar y avanzar en la pipeta de parche en 1 m pasos mientras se aplica corriente positiva en forma de pulsos cuadrados (1 nA, 200 msec on / off). Monitorear el cambio de resistencia robusta al establecer contacto con la duramadre. En este punto, establecer las coordenadas del micromanipulador para &quot;cero&quot; para permitir mediciones precisas de la profundidad. </li><li> Avanzar en 1 m en modo paso hasta que el parche pipeta penetra la duramadre se indica por un descenso brusco de la resistencia del electrodo. Quite la presión de mantenimiento de la pipeta. </li><li> Búsqueda de unidades individuales mientras se avanza en 1 m pasos. Vigilar la resistencia del electrodo de forma continua mediante la aplicación de 200 ms on / off pulsos. Un aumento de la resistencia del electrodo typicaliado indica la proximidad de una sola neurona. Haga avanzar el electrodo hasta que el potencial de acción positiva (AP) formas de onda de ~ 2 mV se registran (Figuras 2A y 2B). </li><li> Opcional: grabar el patrón Rematar espontánea de la neurona y determinar bigote-evocado clavar por, por ejemplo, desviando caudalmente barbas individuales para 200 mseg en un ángulo de 3,3 ° utilizando un dispositivo piezoeléctrico 18. </li><li> Haga avanzar el electrodo hasta que la resistencia es 25-35 MΩ y picos tienen amplitudes de 3-8 mV para obtener condiciones óptimas de llenado juxtasomal. Inicie el llenado juxtasomal aplicando pulsos cuadrados de corriente positiva (1 nA, 200 ms on / off). Poco a poco y gradualmente aumentar la corriente por pasos de 0,1 nA mientras que el control de la forma de onda de AP y la frecuencia (Figuras 2A y 2B). </li><li> Supervisar la apertura de la membrana como un claro aumento en la frecuencia de AP durante la fase en el pulso de bloque (Figura 2C </strong&gt;). La forma de onda de pico durante el llenado muestra un aumento de la anchura y la reducida (Figuras 2C y 2D) post-hiperpolarización. Parámetros adicionales incluyen el aumento de ruido o una pequeña (1-5 mV) cambio negativo de CC. </li><li> Aumenta o disminuye la corriente (1 nA) durante el llenado para mantener la infusión biocitina estable. Reducir o detener los impulsos de corriente en aumento repentino de la frecuencia AP para evitar la toxicidad por el exceso de afluencia de iones extracelulares, tales como iones de sodio. Nota: cada neurona responde de manera diferente a la inyección de corriente y juxtasomal parámetros de etiquetado deben ser ajustados en función de las condiciones de grabación individuales. </li><li> Seguir de cerca la señal después de detener la inyección de corriente. La forma de onda pico después de una sesión de relleno se suele ampliarse y muestra una fuerte reducción después de hiperpolarización. Esperar a que la recuperación de la neurona, que es evidente cuando la forma de onda de pico vuelve a sus propiedades originales (es decir, presencia denormal, la figura post-hiperpolarización 2). </li><li> Repita biocitina llenar sesiones después de la recuperación completa de la neurona para aumentar la carga biocitina para mejorar la calidad de la tinción. </li><li> Retraer la pipeta de parche en pasos de 1 m hasta que la amplitud pico disminuye para reducir cualquier tensión mecánica a la célula. Espere por lo menos 1 hora para la biocitina para difundir de forma intracelular, mientras que de cerca el seguimiento de la temperatura corporal del animal y de la respiración. </li></ol> 3. Perfusión del animal y extracción del cerebro <ol><li> Preparar la configuración de la perfusión, enjuague y precargar el tubo con 0,9% de NaCl. </li><li> Coloque el animal sobre una bandeja quirúrgica y asegurar con cinta de etiquetado estándar. Asegurar suficiente profundidad de la anestesia; pizca pie y los reflejos de los párpados deben estar ausentes. </li><li> Hacer una incisión medial a lateral (5-6 cm) a través de la pared abdominal justo debajo de la caja torácica y proceder en la dirección posterior-anterior para exponer el esternón.Tire del esternón por delante y separar cuidadosamente el hígado desde el diafragma. </li><li> Hacer una pequeña incisión en el diafragma, cortar a través de las costillas inferiores y continuar la incisión a lo largo de toda la longitud de la cavidad abdominal para exponer el corazón. </li><li> Retire el pericardio. </li><li> Inserte la aguja en el ventrículo izquierdo y hacer una incisión en la aurícula derecha. Perfundir con 0,9% de NaCl (~ 8 ml / min) hasta la decoloración del hígado es completa. </li><li> Cambie la infusión de 4% de paraformaldehído (PFA), hasta que la rigidez de la pata delantera y la mandíbula inferior es aparente. </li><li> Decapita a la rata con un par de tijeras </li><li> Quitar los músculos del cuello que quedan y exponer el cráneo completo. </li><li> Coloque las tijeras en el tronco cerebral en la parte dorsal y cortar el hueso con cuidado a lo largo de la sutura sagital, el mantenimiento de la posición dorsal. </li><li> Retirar los huesos de ambos lados de la sutura sagital para exponer el cerebro usando fórceps. Retire con cuidado la duramadre para evitar damage. </li><li> Inserte con cuidado una espátula roma para la parte ventral del cerebro y quitar el cerebro suavemente. </li><li> Posterior a arreglar toda la noche a la mañana en el cerebro PFA a 4 ° C. Cambie el cerebro a tampón fosfato 0,05 M (PB) y almacenar a 4 ° C. </li></ol> 4. Cortando el cerebro en las secciones tangenciales <ol><li> Tome el cerebro fuera de la M PB 0.05 y lo puso en un papel de filtro frente anterior. Utilice una hoja de afeitar afilada para cortar el cerebelo a lo largo del plano coronal y separar los hemisferios cortando a lo largo mediados el plano sagital. </li><li> Aplique pegamento en la plataforma de montaje y montar el hemisferio izquierdo en su plano sagital con anterior frente a la derecha. Asegure la plataforma de montaje en un ángulo de 45 ° en un vibratome y sumergir el cerebro en 0,05 M PB. </li><li> Asegure una hoja de afeitar en la vibrátomo y asegurarse de que el primer contacto con la superficie del cerebro se encuentra en el centro del plano anterior-posterior del hemisferio. Cortar 24 100 msecciones y recogerlas en una placa de 24 pocillos que contenía 0,05 M PB. </li></ol> 5. Procedimientos histológicos <ol><li> Realizar protocolos histológicos para la tinción citocromo oxidasa 24 y el método de avidina-biotina-peroxidasa de acuerdo con los métodos descritos previamente 25. Opcional: visualice biocitina utilizando conjugados de avidina fluorescente / estreptavidina-Alexa. Esto permite, además, de doble tinción con técnicas de rastreo retrógrado o anterógrado. </li><li> Secciones de lavado de 5 x 5 min con 0,05 M PB y preparar el tetrahidrocloruro 3,-3&#39;-diaminobencidina (DAB) solución para la tinción de la citocromo oxidasa de visualizar barriles en la capa 4 (L4) de S1-que contiene (véase la Tabla 2 para las soluciones y reactivos). Incubar las secciones 6-12 de la pia en la solución precalentado durante 30 a 45 min a 37 ° C. </li><li> Enjuague secciones con 0,05 M PB de 6 x 5 min y la amortiguación actividad peroxidasa endógena por incubación de todas las secciones en el 3% de H 2 </sub&gt; O 2 en PB 0,05 M durante 20 min a temperatura ambiente (RT). </li><li> Enjuague secciones con 0,05 M PB de 5 x 10 min. Incubar las secciones en ABC-solución (véase la Tabla 3 para las soluciones y reactivos) la noche a 4 ° C. </li><li> Enjuague secciones con 0,05 M PB de 5 x 10 min y preparar la solución de DAB para visualizar la neurona biocitina lleno (véase la Tabla 4 para las soluciones y reactivos). Incubar las secciones en solución filtrada durante 45-60 min a TA. </li><li> Enjuague secciones con 0,05 M PB de 5 x 10 min. Mount secciones sobre portaobjetos de microscopio y cubreobjetos con Mowiol (véase la Tabla 5 para las soluciones y reactivos). </li><li> Determinar la calidad del etiquetado mediante microscopía de luz. </li></ol>

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<li>Boudewijns, Z. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+three-dimensional+reconstructions+of+individual+neurons+reveal+cell+type-specific+circuits+in+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex.</a> Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).</li>
<li>Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+experience+alters+specific+branches+of+individual+corticocortical+axons+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development.</a> J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).</li>
<li>Schubert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+without+disturbing%3A+how+different+cortical+neuron+classes+represent+tactile+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli.</a> J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).</li>
<li>Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+electroporative+delivery+of+drugs+and+genes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochem.+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes).</a> Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).</li>
<li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).</li>
</ol>

Los authros tienen nada que revelar.

El método juxtasomal permite la grabación en vivo de acción potencial enriquecidas a partir de unidades individuales a través de las condiciones de comportamiento (anestesiados, despierto cabeza fija o moviéndose libremente) con la opción de biocitina-etiquetar la neurona registrada en post hoc clasificación de tipos de células y / o reconstrucción 3D. La principal ventaja es obtener parámetros fisiológicos en la configuración extracelular (de este modo no invasivo), sin embargo, ser capaz de etiquetar...

Redes neuronales consisten en múltiples tipos de células, que se caracterizan por propiedades morfológicas y fisiológicas altamente específicos 1-7. Como consecuencia de ello, los tipos de células individuales realizan tareas especializadas dentro de la red (véase, por ejemplo Gentet et al. 8 y Burgalossi et al. 9). Sólo estamos empezando a entender las funciones específicas del tipo de células a través de redes neuronales y queda aún mucho por descubrir. Para este fin, muchos laboratorios están aplicando enfoques experimentales que permiten el análisis de las propiedades morfológicas de la misma población neuronal de la que se han obtenido parámetros fisiológicos 1,10-15. Aquí, se demuestra la técnica de etiquetado juxtasomal 16,17 que implica registros electrofisiológicos usando pipetas de parche convencionales en la configuración extracelular (de este modo no invasivo) en combinación con la electroporación de la neurona registrada con biocitina. Laimportante ventaja de este enfoque es que la naturaleza no invasiva asegura que el potencial de acción Rematar de las neuronas individuales se registra sin alterar (por ejemplo, diálisis) el contenido intracelular de la célula. Seguido por electroporación, el enfoque juxtasomal proporciona la opción de identificación post hoc celular y la reconstrucción de enlace de función (fisiología) a la estructura (morfología). Típicamente, la reconstrucción morfológica consiste en la reconstrucción de la morfología dendrítica y axonal que se puede extender a la cuantificación de la columna vertebral y / o Bouton densidades o incluso la reconstrucción de la morfología neuronal en resolución nanométrica utilizando microscopía electrónica. La técnica de grabación juxtasomal se puede utilizar para las grabaciones en vivo de varios tipos de células a través de las capas corticales o en áreas subcorticales en una gama de especies, aunque la mayoría de los estudios han aplicado la técnica en pequeños roedores tales como ratones o ratas. Nuestra investigación se centra en el registro y etiquetado de las neuronasde rata corteza somatosensorial primaria (S1) e implica la identificación visual de las neuronas registradas 18, reconstrucciones dendríticas en combinación con un registro preciso en un marco de referencia estandarizada para ingeniería inversa redes corticales 4,19 y reconstrucción detallada de la arquitectura axonal caracterizar específica del tipo celular local y proyección a largo plazo dirigido a 20. En comparación con las técnicas de grabación en vivo alternativas (intracelulares o de células enteras), grabaciones juxtasomal son relativamente estables y por lo tanto pueden aplicarse a distintos estados de comportamiento incluyendo anestesiado 21,22, sedados 14, Pista de los animales-fijo 23, o incluso se mueven libremente despiertos 9 . Aquí, mostramos etiquetado juxtasomal en S1 de una rata anestesiada con uretano, aunque hacemos hincapié en la aplicabilidad general de esta técnica para muchas preparaciones de elección.

<table><tbody><tr><td>Sistema de control SM-6</td><td>Luigs Neumann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LN- Mini 23 XYZ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LN- Mini 55 Manipulador Amplificador X2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lynx-8</td><td>Amplificador Neuralynx</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axoclamp-2B</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osada modelo EXL-M40</td><td>Osada, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo piezoeléctrico</td><td>Physik Instrumente</td><td>PL140.10</td><td></td></tr><tr><td>LabView</td><td>National Instruments, Austin, TX, EE. UU.</td><td></td><td>LabView software</td></tr><tr><td>de adquisición Ntrode Virtual Instrument&nbsp;</td><td>R. Bruno, Universidad de Columbia, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hisopos absorbentes Sugi</td><td>Kettenbach</td><td>30601</td><td></td></tr><tr><td>Citocromo C de corazón equino</td><td>Sigma</td><td>C2506</td><td></td></tr><tr><td>Catalasa de hígado bovino</td><td>Sigma</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>DAB</td><td>Sigma</td><td>D5637</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Boom</td><td>7047</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain estándar ABC-kit</td><td>Vector</td><td>PK6100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Uretano</td><td>Sigma</td><td>U2500</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Pharmachemie</td><td>45.112.110</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaína</td><td>Sigma</td><td>L5647</td><td></td></tr><tr><td>Simplex cemento dental rápido</td><td>Kemdent</td><td>ACR308/ACR924</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Molekula</td><td>36219518</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Merck Millipore</td><td>8187151000</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T4661</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol de grado analítico</td><td>Fluka</td><td>49767</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60130</td><td></td></tr><tr><td>CaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22,350-6</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fluka</td><td>63072</td><td></td></tr></tbody></table>

juxtasomal biocitina etiquetado para estudiar la estructura-función de la relación de un individuo neuronas corticales

Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons

La corteza cerebral se caracteriza por múltiples capas y muchos tipos de células diferentes que juntos como una red son responsables de muchas funciones cognitivas superiores, incluyendo la toma de decisiones, el comportamiento sensorial guiada o la memoria. Para entender cómo estas redes neuronales complejas que de tales tareas, un paso crucial es determinar la función (o la actividad eléctrica) de tipos de células individuales dentro de la red, de preferencia cuando el animal está realizando una tarea cognitiva relevante. Además, es igualmente importante para determinar la estructura anatómica de la red y la arquitectura morfológica de las neuronas individuales para permitir la ingeniería inversa de la red cortical. Avances técnicos disponibles en la actualidad permiten el registro de la actividad celular en despierto, comportándose animales con la opción valiosa de post hoc identificar las neuronas registradas. Aquí, nos demuestran la técnica de etiquetado biocitina juxtasomal, que implica la acción de grabación de potenciómetroal clavar en la configuración extracelular (o floja-patch) utilizando pipetas de parche convencionales. La configuración de la grabación juxtasomal es relativamente estable y aplicable a través de condiciones de comportamiento, incluyendo anestesiado, sedado, despierto cabeza fija, e incluso en el animal se mueve libremente. Por lo tanto, este método permite la vinculación de tipo celular específico acción potencial durante Rematar comportamiento de los animales a la reconstrucción de las neuronas individuales y en última instancia, la totalidad de microcircuito cortical. En este manuscrito de vídeo, se muestra cómo las neuronas individuales en la configuración juxtasomal se pueden marcar con biocitina en ratas anestesiadas con uretano para la identificación post hoc y la reconstrucción morfológica.

El conocimiento detallado de la estructura 3D de las neuronas individuales es crucial para elucidar los principios organizativos de las redes neuronales. Nuestro método consiste en una tubería para lograr etiquetado biocitina alta calidad a partir de una preparación in vivo, lo que permite la clasificación de puestos neuronal hoc y la reconstrucción detallada de la arquitectura dendrítica y axonal de las neuronas individuales en alta resolución. Dependiendo de la calidad de etiquetado juxtasom...

Para entender la estructura de las redes neuronales, la caracterización morfológica y funcional de las neuronas individuales es una necesidad. Aquí, nos demuestran etiquetado juxtasomal biocitina, la cual permite que los registros electrofisiológicos en la configuración extracelular, aún mantiene la capacidad de etiquetar de forma intracelular de la neurona para la reconstrucción post hoc de dendríticas y la arquitectura axonal.

Juxtasomal Biocitina Etiquetado para estudiar la estructura-función de la relación de un individuo neuronas corticales

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive ...

El objetivo general de este procedimiento es vincular la actividad de disparo de potenciales de acción específicos del tipo celular en la corteza sensorial durante el procesamiento de la información con la identidad morfológica de las neuronas registradas. Esto se logra primero mediante la preparación quirúrgica de la rata para registros juxtasomáticos. Una vez preparada, un electrodo registra la actividad espontánea y evocada por estímulos sensoriales, y la neurona registrada se carga con biocidina mediante corriente e inyecciones.Posteriormente, el cerebro se procesa para la tinción con biotina. Finalmente, la neurona rellenada con biotina se reconstruye digitalmente a partir de cortes sucesivos para la clasificación del tipo celular. En última instancia, los registros juxtasomáticos de neuronas individuales permiten el estudio del procesamiento sensorial y de la información estructural dentro de la red cortical.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en neurociencia, como ¿cuál es el papel de los tipos celulares individuales y de las capas durante el procesamiento sensorial? En general, las personas que necesitan este método tendrán dificultades porque es muy fácil

juxtasomal-biocytin-labeling-to-study-structure-function-relationship

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Se demuestra el uso de la pistola de genes para introducir tintes fluorescentes, como DII, en las neuronas en secciones de cerebro de los roedores y primates no humanos de diferentes edades. En este caso particular, utilizamos ratones adultos (3-6 meses de edad) y adultos de los monos cynomologus (9-15 años). Esta técnica, descrita originalmente por el laboratorio del Dr. Lichtman...

Etiquetado DiOLISTIC de las neuronas de los roedores y no humanos rodajas de cerebro de los primates

Este video muestra el procedimiento para teñir cortes fijos de cerebro de rata que contienen interneuronas llenas de biocitina. El protocolo incluye la incubación con complejo avidina-biotina (ABC), la tinción con HRP y sustrato cromogénico, la preservación de las estructuras con tetróxido de osmio y la inclusión del tejido en resina para la obtención de imágenes.

Marcaje de interneuronas llenas de biocitina en rodajas de hipocampo de rata para su visualización

Se describe un método para el etiquetado de las neuronas con colorantes fluorescentes en funcional predeterminada micro-dominios del neocórtex. En primer lugar, la imagen de la señal óptica intrínseca se utiliza para obtener un mapa funcional. Luego de dos fotones microscopía se utiliza para etiquetar y neuronas imagen dentro de un dominio de micro del mapa.

Etiquetado dirigida de neuronas en una versión concreta de Micro-funcional de dominio de la neocorteza por combinar la señal intrínseca e Imagen de dos fotones

El tráfico de membrana neuronal controla dinámicamente la membrana plasmática y la disponibilidad de proteína significativamente impactos neurotransmisión. Hasta la fecha, ha sido un desafío para medir el tráfico endocítica neuronal en las neuronas adultas. Aquí se describe un método altamente efectivo, cuantitativa para medir los cambios rápidos en la superficie de la proteína expresión ex vivo en rodajas de cerebro agudas.

Cerebro Slice Biotinilación: Una<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Enfoque medir tráfico de proteínas específicas Región membrana plasmática en adultos las neuronas

Este protocolo describe el diseño y la implantación quirúrgica de un mecanismo de restricción de la cabeza para monitorear la actividad neuronal en las estructuras cerebrales subcorticales en ratas alerta.  Delinea procedimientos para aislar neuronas individuales en la configuración yuxtacelular e identificar eficientemente sus ubicaciones anatómicas.

Monitoreo Juxtacellular y localización de las neuronas individual dentro de las estructuras cerebrales subcorticales de Alerta, ratas Head-restringido

Este protocolo presenta un método para la recuperación morfológica de las neuronas parcheado durante registros electrofisiológicos usando llenado biocitina y posterior procesamiento posterior inmunohistoquímico. Se demuestra que las secciones biocitina llenas de gruesos que se tiñeron y se pueden coverslipped restained con un segundo anticuerpo primario días o meses más tarde.

La inmunotinción de las secciones llenas de Biocitina y se procesaron para neuroquímicos Marcadores

Este protocolo describe un método para la proyección de imagen simultánea de talamocorticales axon ramas y sinapsis formación en organotypic cocultures del tálamo y corteza cerebral. Axones individuales talamocorticales y sus terminales presinápticos se visualizan mediante una técnica de electroporación unicelular con DsRed y synaptophysin tagged GFP.

Visualización de axón talamocorticales ramificación y sinapsis formación en Organotypic Cocultures

Aquí describimos un procedimiento para tejido claro etiquetado fluorescente y a gran escala imagen de tejido de cerebro de ratón que, por lo tanto, permite la visualización de la organización tridimensional de tipos celulares en el neocortex.

Proyección de imagen tridimensional a gran escala de la organización celular en el Neocortex de ratón

Aquí presentamos un protocolo para evaluar la organización de redes astrocytic. El método descrito minimiza el sesgo para proporcionar medidas descriptivas de estas redes como recuento de células, el tamaño, zona y posición dentro de un núcleo. Anisotropía es evaluada con un análisis vectorial.

Analizar el tamaño, forma y direccionalidad de las redes de astrocitos acoplados

El protocolo que aquí describe el análisis de la inmunofluorescencia, recuperación de biocitina y reconstrucciones de alta calidad de interneuronas de CA2 hipocampales siguiendo los registros electrofisiológicos intracelulares in vitro, permitiendo neuronal caracterización y finalmente fina anatomía neuronal para ser estudiado.

Recuperación de biocitina y reconstrucciones 3D de interneuronas lleno Hippocampal CA2

Presentamos un protocolo para preparar rodajas agudas del hipocampo dorsal-intermedio de ratones. Comparamos esta preparación transversal con el corte coronal en términos de calidad de las grabaciones y preservación de las características morfológicas de las neuronas grabadas.

Preparación de rodajas agudas del hipocampo dorsal para la grabación de células enteras y la reconstrucción neuronal en el dentate gyrus de ratones adultos

Aprende el etiquetado juxtasomal con biocitina para vincular la actividad eléctrica con la morfología neuronal en la corteza sensorial de ratas. Este método permite reconstruir la estructura tridimensional de neuronas individuales.

Juxtasomal Biocitina Etiquetado para estudiar la estructura-función de la relación de un individuo neuronas corticales

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