Juxtasomal Biocitina Etiquetado para estudiar la estructura-función de la relación de un individuo neuronas corticales

El objetivo general de este procedimiento es vincular la actividad de disparo de potenciales de acción específicos del tipo celular en la corteza sensorial durante el procesamiento de la información con la identidad morfológica de las neuronas registradas. Esto se logra primero mediante la preparación quirúrgica de la rata para registros juxtasomáticos. Una vez preparada, un electrodo registra la actividad espontánea y evocada por estímulos sensoriales, y la neurona registrada se carga con biocidina mediante corriente e inyecciones.

Posteriormente, el cerebro se procesa para la tinción con biotina. Finalmente, la neurona rellenada con biotina se reconstruye digitalmente a partir de cortes sucesivos para la clasificación del tipo celular. En última instancia, los registros juxtasomáticos de neuronas individuales permiten el estudio del procesamiento sensorial y de la información estructural dentro de la red cortical.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en neurociencia, como ¿cuál es el papel de los tipos celulares individuales y de las capas durante el procesamiento sensorial? En general, las personas que necesitan este método tendrán dificultades porque es muy fácil matar neuronas durante el procedimiento de llenado. Las probabilidades de un llenado exitoso con biocidina aumentan al preparar pipetas de calidad óptima, y adicionalmente, se requiere un ojo entrenado para controlar las inyecciones de corriente de banda estrecha.

Por lo tanto, se requiere experiencia para aumentar la tasa de éxito en la recuperación de neuronas bien llenas. Para comenzar, coloque una rata Wistar anestesiada sobre un marco estereotáxico equipado con una almohadilla calefactora. Confirme la profundidad de la sedación probando el reflejo de pellizco en el dedo del pie.

Luego inserte una sonda rectal para mantener la temperatura corporal adecuada. Sujete la cabeza del animal y elimine el pelo del sitio quirúrgico. Aplique ungüento en los ojos para prevenir la sequedad.

Espere de tres a cinco minutos después de inyectar lidocaína en el sitio de la operación y retire la piel que cubre la superficie del cráneo. A continuación, elimine cualquier tejido restante y limpie minuciosamente el cráneo con cloruro de sodio al 0,9%. Determine las coordenadas de la corteza somatosensorial primaria en el hemisferio izquierdo y marque la ubicación en el cráneo con un bolígrafo marcador quirúrgico para piel.

Utilice una fresa dental para raspar el hueso de la región de interés. Continúe raspando el hueso hasta que se vuelva transparente y los vasos sanguíneos sean claramente visibles. A continuación, corte una pequeña ventana en el cráneo delgado con un escalpelo.

Teniendo cuidado de no dañar la duramadre ni los vasos sanguíneos. Marque los bordes de la craneotomía utilizando un bolígrafo marcador quirúrgico para piel. Para mejorar la visibilidad, aplique una capa fina de pegamento instantáneo sobre el cráneo seco y luego cemento dental para construir un baño.

Al cerrar la craneotomía, corte los bigotes en el lado contralateral hasta exactamente cinco milímetros para facilitar su visibilidad. Resalte los bigotes recortados con rímel negro antes de comenzar las grabaciones; prepare pipetas de registro a partir de vidrio borosilicatado. La morfología ideal de la pipeta es una punta esbelta con una transición gradual, un ángulo cónico bajo y un diámetro interno de la punta de aproximadamente un micrómetro.

Cargue la pipeta de registro con ringer rad normal, suplementado con biotina al 2 %, y monte la pipeta de registro en un porta-pipetas fijado a una etapa de cabeza y conectado a un micromanipulador. Para dirigirse específicamente a la columna D dos de la S uno de rata, ajuste el ángulo del porta-electrodo a 34 grados con respecto al plano sagital. A continuación, coloque la pipeta de registro en proximidad cercana a la craneotomía.

Llene el baño con cloruro de sodio al 0,9 %. Con el amplificador en modo puente, aplique pulsos cuadrados con inyección de corriente positiva para determinar la resistencia del electrodo. La resistencia óptima del electrodo se encuentra entre tres y cinco megaohmios.

Establezca una sobre presión de 100 a 150 milibares y avance la pipeta de registro en pasos de un micrón mientras aplica una corriente positiva en forma de pulsos cuadrados. Monitoree el cambio robusto en la resistencia al establecer contacto con la duramadre. En este momento, ajuste las coordenadas del micromanipulador a cero para permitir mediciones precisas de profundidad.

Avance en modo de pasos de un micrón hasta que la pipeta de registro penetre la duramadre, lo cual se indica por una caída repentina en la resistencia del electrodo. Retire la presión de sujeción de la pipeta. A continuación, busque unidades individuales mientras avanza en pasos de un micrón.

Monitoree continuamente la resistencia del electrodo aplicando pulsos de 200 milisegundos encendido-apagado, y un aumento en la resistencia del electrodo generalmente indica la proximidad de una neurona individual; avance el electrodo hasta que se registren formas de onda de potencial de acción positivas con una amplitud de aproximadamente dos milivoltios. Opcionalmente, registre la actividad espontánea de disparos y determine la actividad de disparos relacionada con los bigotes mediante la desviación suave de bigotes individuales usando un dispositivo piezoeléctrico para obtener condiciones óptimas para el relleno juxtasomático.

Avance el electrodo hasta que la resistencia sea de 25 a 35 megaohmios y las puntas tengan amplitudes de tres a ocho milivoltios para iniciar el relleno yuxtasonicular. Aplique pulsos de corriente cuadrados positivos comenzando en un nanoamperio.

Aumente lenta y gradualmente la corriente en pasos de 0,1 nanoamperios mientras monitorea la forma de onda y la frecuencia del potencial de acción. Observe la apertura de la membrana como un aumento claro en la frecuencia del potencial de acción durante la fase de encendido del pulso de bloqueo; la forma de onda del potencial de acción durante la carga muestra un ancho aumentado y una hiperpolarización posterior reducida. Aumente o disminuya la corriente durante la carga para mantener una infusión estable de biotina; reduzca o detenga los pulsos de corriente ante un aumento repentino de la frecuencia del potencial de acción, para evitar la toxicidad por exceso de entrada de iones extracelulares, como los iones de sodio.

Es importante tener en cuenta que cada neurona responderá de manera diferente al procedimiento de llenado. Por lo tanto, los parámetros de etiquetado juxtasomal deben ajustarse según las condiciones de grabación. Supervise cuidadosamente la señal tras detener la inyección de corriente.

La forma de onda del potencial de acción tras una sesión de llenado suele estar ensanchada y muestra una fuerte reducción de la hiperpolarización posterior, esperando la recuperación del neutrón, lo cual es evidente cuando la forma de onda del potencial de acción vuelve a sus propiedades originales para reducir cualquier estrés mecánico en la célula. Retraiga la pipeta de registro en pasos de un micrón hasta que la amplitud del potencial de acción disminuya; espere al menos una hora para que la biotina difunda intracelularmente, vigilando de cerca la temperatura corporal y la respiración del animal. Finalmente, se obtienen y procesan muestras cerebrales para evaluar la calidad del marcado yuxtasomal.

Estas imágenes muestran neuronas rellenadas por juxtaposición en la corteza somatosensorial primaria. Esta vista tangencial de una neurona parametal muestra la diferencia de tamaño entre las dendritas y los axones. En esta reconstrucción digital de una neurona marcada por juxtaposición somalí, se muestra la imagen de proyección neuronal a alta resolución, pero baja magnificación, junto con la reconstrucción digital automatizada, donde el axón aparece superpuesto en azul y la dendrita en rojo, respectivamente.

Aquí, la región del cuadro se amplía para mostrar el botón axonal a lo largo de toda la longitud del axón. En esta animación final, ejemplificamos la tubería de reconstrucción para una neurona parametal gruesa ramificada de la capa cinco de la corteza somatosensorial primaria de rata. La tubería comprende la reconstrucción de la morfología dendrítica y axonal con una ampliación de 100 veces y los contornos del barril con una ampliación de cuatro veces.

El resultado es una reconstrucción 3D completa, que posteriormente se registra en un marco de referencia estandarizado para realizar un análisis cuantitativo de las características morfológicas. Así, la marcación yuxtassomática in vivo permite una calidad de marcado excepcional para la reconstrucción fiable de la morfología 3D completa. Aquí mostramos el método en animales anestesiados con uretano.

Sin embargo, las grabaciones juxtasomáticas también se pueden utilizar en animales despiertos con la cabeza inmovilizada para estudiar el papel de tipos celulares individuales y capas durante la exploración activa del entorno. Después de ver este video, debería tener una mejor comprensión de cómo realizar la etiquetación con Biocidina en neuronas individuales para la identificación posterior a la guerra y la reconstrucción morfológica.