Name: Un método eficaz para Cuantitativo, Análisis de celda única de la cromatina modificación y Arquitectura Nuclear en Todo el montaje en Óvulos Arabidopsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Aprende un protocolo eficaz de inmunotinción y FISH en óvulos de Arabidopsis thaliana para analizar modificaciones de cromatina y arquitectura nuclear mediante imagen confocal de alta resolución.

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Agradecemos a Ueli Grossniklaus (Universidad de Zúrich) por su apoyo técnico y financiero. Agradecemos a Valeria Gagliardini, Christof Eichenberger, Arturo Bolaños y Peter Kopf por el apoyo general del laboratorio. Esta investigación fue financiada por la Universidad de Zúrich, becas de la Fundación Nacional Suiza a CB (31003A_130722) y Ueli Grossniklaus (31003A_141245 y 31003AB-126006), y la Agence Nationale de la Recherche a DG (Programa ANR-BLANC-2012).

El procedimiento se describe en el flujo de trabajo en la Figura 1, y la configuración para la disección y la incrustación de tejidos se presentan en la Figura 2. 1. Fijación del tejido <ol><li> Recoger 20-30 carpelos en un tubo de microcentrífuga que contiene recién hecho tampón fijador BVO en hielo. </li><li> Fijar el tejido 30 min con agitación suave a temperatura ambiente. </li><li> Haga girar los tubos que contienen los carpelos en fijador en una microcentrífuga de sobremesa 1 min a 400 x g. </li><li> Retire con cuidado el tampón fijador y agregar 1 ml de PBT, coloque los tubos en hielo. </li></ol> 2. Disección e incrustación <ol><li> Preparar cinco tubos Eppendorf con cada 200 l de una recién hecha, 5% de mezcla de acrilamida. </li><li> Preparar cinco portaobjetos Superfrost pre-limpiados con etanol al 70% y se marcaron con un lápiz. </li><li> Descongelar una alícuota de 20% y 20% de APS NaPS cada uno, en el hielo. </li><li> Tome 4-5 carpelos con una punta de corte final, el lugarsobre una lámina limpia, eliminar el exceso de líquido. </li><li> Haga cortes longitudinales con una aguja fina y separar las paredes carpelo para liberar filas de óvulos como se muestra la Figura 2, evitar el secado, cubriendo con PBS (no más de 10 l). </li><li> Añadir rápidamente y mezclar 12 NaPS mu l, 12 APS mu l con una alícuota de 200 l de mezcla de acrilamida. </li><li> Añadir 30 l de la acrilamida activado en los óvulos disecados. </li><li> Tapar con un cubreobjetos mm 20 x 20, por no polimeriza a temperatura ambiente, 45 a 60 min. </li><li> Retire el cubreobjetos usando una cuchilla de afeitar. En esta etapa, las muestras se pueden mantener durante la noche a 4 ° C en un vaso de Coplin que contenía PBS. </li></ol> 3. Procesamiento de tejido NOTA: Todos los pasos, excepto 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 y 3.4.3 se llevan a cabo en frascos de Coplin con 80 ml de solución bajo el capó química a temperatura ambiente. Las diapositivas se transfieren con una pinza de punta plana. <ol><li> Clarificación de tejidos yfijación: <ol><li> Incubar 5 min en metanol. </li><li> Incubar 5 min en etanol. </li><li> Incubar 30 min en etanol: xileno (1:1). </li><li> Incubar 5 min en etanol. </li><li> Incubar 5 min en metanol. </li><li> Incubar 15 min en metanol y PBT (01:01), complementado con 2,5% de formaldehído. </li><li> Enjuague 2 x 10 min en PBT. En esta etapa, las diapositivas se pueden mantener durante la noche a 4 ° C. </li></ol></li><li> La digestión de la pared celular: <ol><li> Descongelar una alícuota de la mezcla de la digestión de la pared celular en hielo. </li><li> Tome un portaobjetos del frasco de Coplin, drenar el exceso de líquido, colocándolo en posición vertical sobre una toalla de papel. </li><li> Añadir 100 l de mezcla de digestión de la pared celular sobre la almohadilla de acrilamida y cubrir con un cubreobjetos 23 mm x 46. Repita el procedimiento para las otras diapositivas. Incubar durante 2 horas a 37 ° C en una cámara húmeda (se describe en Materiales). </li><li> Lavar el portaobjetos 2 x 5 min en PBT. </li></ol></li><li> RNasa A de tratamiento: <ol><li> Tome un portaobjetos del frasco de Coplin, drene ªe exceso de líquido como antes. </li><li> Incubar cada portaobjetos con 100 l de ARNasa A a 100 g / ml en PBS con 1% de Tween-20 durante 1 hora a 37 ° C en una cámara húmeda. </li><li> Lavar los portaobjetos durante 2 x 5 min en PBT. </li></ol></li><li> Posteriores a la fijación y permeabilización: <ol><li> Post-fijar durante 20 minutos en recién hecha PBT-F. </li><li> Enjuagar los portaobjetos durante 10 minutos en PBT. </li><li> Permeabilizar durante 2 horas en PBS con 2% de Tween-20 a 4 ° C. </li><li> Enjuagar los portaobjetos durante 2 x 5 min en PBT. </li></ol></li></ol> 4. Inmunotinción NOTA: Para este paso, la concentración óptima del anticuerpo primario tiene que ser probado mediante el uso de diferentes diluciones (1:200, 1:500, 1:1000) de los anticuerpos. <ol><li> Incubar cada portaobjetos con 100 l de anticuerpo primario diluido en PBS con 0,2% de Tween-20 durante 12-24 horas a 4 ° C. </li><li> Lavar los portaobjetos en PBT durante 2-4 horas a temperatura ambiente bajo agitación suave. </li><li> Aplicar la1:200 de anticuerpo secundario en PBS + 0,2% de Tween-20 durante 24 horas a 4 ° C. </li><li> Lavar los portaobjetos en PBT durante 1 hora a temperatura ambiente bajo agitación suave. </li><li> Contratinción con 10 g / ml de yoduro de propidio en PBS durante 15 min, luego enjuague 15 min en PBS bajo agitación suave, a temperatura ambiente. </li><li> Monte en anti-fading medio de montaje líquido suplementado con 10 mg / ml de yoduro de propidio. Deje que el medio de montaje se endurezca durante 1 hora antes de la adquisición de imágenes por CLSM. </li></ol> 5. Imagen Cuantitativa <ol><li> La adquisición de imágenes: <ol><li> Adquirir imágenes de alta resolución utilizando CLSM, idealmente utilizando un modo de escaneo de resonancia, lo que permite una mejor conservación de las señales fluorescentes más prolongado de formación de imágenes 23, y una lente de inmersión 63X glicerol. </li><li> Compruebe los parámetros de adquisición, tales como la intensidad del láser, la ganancia, pinhole, tamaño de voxel y el factor de zoom al inicio del experimento para definir un procedimiento de adquisición estándar a seguir estrictamente lo largotodas las diapositivas para las mediciones cuantitativas consistentes. </li><li> Verificar la ausencia de interferencia entre fluorocromos. Si está presente, establecer una exploración secuencial. Adquirir imágenes de transmisión por separado y no simultáneamente. </li><li> Lleve a cabo la adquisición de imágenes en serie, en tres dimensiones con la resolución más alta posible en las dimensiones X e Y, y con sobremuestreo 2x en la dimensión z (la regla de Nyquist). </li></ol></li><li> Tratamiento de la imagen: <ol><li> Reconstruir imágenes en serie en tres dimensiones utilizando software comercial o de código abierto. </li><li> Definir las superficies de contorno alrededor de cada núcleo (o célula) de interés en 3D. </li><li> Cuantificar la fluorescencia en cada canal como la suma de intensidades de los píxeles en cada objeto. </li><li> Exportar los datos a Excel para su análisis estadístico. Normalizar las señales de anticuerpos contra las señales de tinción por ejemplo ADN. </li></ol></li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

En las plantas con flores, el linaje reproductivo femenino está rodeado por varias capas de células incluyendo la nucela y los tegumentos de óvulos, haciendo así la tinción citológica en todo el montaje técnicamente difícil. Aquí presentamos un protocolo eficiente que permite la preparación y elaboración de un gran número de óvulos adecuados para la tinción citológica como inmunotinción, la tinción de ADN y la hibridación fluorescente in situ en todo el montaje. Se utilizó con éxito para el análisis de...

En las plantas con flores, el establecimiento de linajes reproductiva comienza con la diferenciación de las SMC, MMC hembra y de células madre de microsporas masculino. El MMC se desarrolla a partir de una célula nucellar sub-epidérmica en el extremo distal del primordio óvulo y la célula madre de microsporas se desarrolla a partir de tejido esporógena en la antera lóculo, que se encuentran en el interior de los órganos florales 1. CML sufren meiosis para producir esporas haploides, que luego dan lugar a los gametofitos sobre la mitosis. El gametofito femenino o saco embrionario, se compone de un óvulo, una célula central, dos y tres sinérgidas antípodas. El gametofito masculino, o el polen, se compone de una célula vegetal y dos espermatozoides. Mientras que el gametofito masculino sigue siendo un objeto de estudio-de-relativamente accesible, el gametofito femenino está incrustado dentro del óvulo, en sí encerrado en el carpelo flor, y por lo tanto plantea retos específicos para los análisis moleculares y citológicos. Recientemente, sin embargo, con ayuda de lásermicrodisección ofrece una solución elegante que permite transcriptómica analiza en el MMC y células gametofítico femeninos 2-4. Además de la expresión del gen candidato análisis, usando, por ejemplo ARN hibridación in situ o ensayos de gen reportero, análisis citológicos permite la investigación de la dinámica de los componentes celulares endógenos utilizando tinción celular directo específico o inmunotinción indirecta. En particular, la tinción citogenético mediante FISH y la tinción de ADN, junto con la inmunotinción de modificaciones de la cromatina o componentes de la cromatina son los enfoques centrales para dilucidar la dinámica de la cromatina y la organización nuclear de Arabidopsis 5. Habitualmente, la meiosis implica dinámica de los cromosomas específicos que ha sido bien investigados en planta macho meiocytes 6,7; además de gran escala, la reorganización de la cromatina de células específicos, reflejando probablemente la reprogramación epigenética dinámica ha sido descrita durante el desarrollo del polen 8-10. Por el contrario, debidoa la relativa inaccesibilidad de la meiocyte hembra y gametofito, estas investigaciones siguen siendo técnicamente difíciles de aplicar, y a menudo requieren la disección de seccionamiento o manual y la digestión enzimática (ver más abajo). Además, la frecuente falta de claridad óptica en todo el montaje es un obstáculo para imágenes de alta resolución de las células reproductoras en óvulos intactos. Un método clásico para el análisis citológico de organización de los cromosomas en óvulos de todo el montaje utiliza la tinción de Feulgen 11-13. Se trata de la hidrólisis ácida (usando ácido hipocloroso) del ADN que resulta en desnaturalización de la proteína y por lo tanto causa la destrucción de la estructura de la cromatina. Alternativamente, organización de los cromosomas en meiocytes femeninas y células gametofítico se puede observar mediante DAPI y la inmunotinción de las secciones semi-delgadas o sacos embrionarios disecados y MMC (por ejemplo, ver 14-18). Claramente, sin embargo, la disección manual y de corte pueden ser mano de obra intensiva yimpide en el análisis cualitativo y cuantitativo de un gran número de epítopos de la cromatina. Aquí les ofrecemos un protocolo eficiente para preparar un gran número de óvulos Arabidopsis adecuados para una variedad de tinción citológica aguas abajo en todo el montaje. En breve, los brotes de flor se incuban en una solución de fijación, las filas de óvulos se disecan de la carpelo y embebidos en acrilamida en la diapositiva como se hizo para meiocitos polen 19,20. Los óvulos incrustados se borrarán y se fijaron en metanol, etanol, y xileno antes de la digestión de la pared celular y permeabilización. Se discuten las posibles variaciones de estos pasos. Las muestras luego se pueden utilizar para la tinción de ADN, inmunotinción, y FISH. El modo de preparación es eficiente y permite paralelo experimental (hasta 16 diapositivas se pueden preparar en un día diferente para el análisis de aguas abajo). Los tratamientos descritos permiten señales homogéneas en todo el montaje e histológico, celular bien conservados,y la organización nuclear en las células reproductoras y las células circundantes que se benefician nucelar comparaciones cualitativas y cuantitativas entre los tipos de células. Calibrado, imágenes basadas en CLSM de alta resolución seguida de reconstrucción en 3 dimensiones permite mediciones cuantitativas significativas de señales fluorescentes. Hemos utilizado con éxito este procedimiento para analizar la dinámica de la cromatina en el MMC diferenciador 21 y desarrollando gametofito femenino 22; Presentamos aquí los resultados representativos de análisis heterocromatina, inmunotinción cromatina, la inmunotinción GFP y FISH en todo el montaje óvulos. Además, creemos que nuestro protocolo será adecuado para otros tejidos y especies de plantas.

<table><tbody><tr><td>Soluciones</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fijación BVO (basado en32)</td><td></td><td></td><td>2 mM EGTA, pH 7,5, 1% (v/v) formaldehído, 10% DMSO, 1x PBS, 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td>, 1x PBS, 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>PBT-F</td><td></td><td></td><td>1x PBT, 2,5% (v/v) formaldehído</td></tr><tr><td>30% acrilamida:bisacrilamida</td><td></td><td></td><td>3 g de acrilamida, 0,33 g de bisacrilamida, 1x PBS (preparar 10 ml, almacenar a 4 & deg; C)</td></tr> <tr><td>200 ml de mezcla de acrilamida al 5% en PBS</td><td></td><td></td><td>34 ml 30% acrilamida:bisacrilamida, 166 ml 1x PBS (hacer fresco con 30% de caldo)</td></tr><tr><td>20% de persulfto de amonio</td> 0,2 g de persulfto <td></td><td></td> de <td>amonio, 1 ml de agua estéril (preparar alícuotas con 1 ml y almacenar a -20 &deg; C)</td></tr> <tr><td>20% de sulfito</td><td></td><td></td> de sodio<td>, 0,2 g de sulfito de sodio, 1 ml de agua estéril (prepare alícuotas con 1 ml y almacene a -20 & grados; C)</td></tr> <tr>Mezcla <td></td><td></td> de <td>enzimas de la pared celular</td><td>0,5% (p/v) de celulasa, 1% (p/v) de driselasa, 0,5% (p/v) de pectoliasa</td></tr><tr><td>Reactivos y materiales</td> Formaldehído <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amaresco</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Schaurlau</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Schaurlau ME03062500</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>ROTH</td><td>4436.1</td><td></td></tr><tr><td>Celulasa</td><td>Sigma</td><td>1794</td><td></td></tr><tr><td>Driselase</td><td>Sigma</td><td>D8037</td><td></td></tr><tr><td>pectolyase</td><td>Sigma</td><td>P5936</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 Merck</td><td></td><td>8.22184.0500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>acrilamida</td><td>Sigma</td><td>A-3553</td><td></td></tr><tr><td>bisacrilamida</td><td>Sigma</td><td>M2022</td><td></td></tr><tr><td>persulfato de amonio</td> tóxico <td>Sigma</td><td>A9164</td><td></td></tr><tr><td>Sulfito de sodio</td><td>Fluka</td><td>71988</td><td></td></tr><tr><td>Anti-trimetil-histona H3 (Lys4)</td><td>Upstate</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>Anti-monometil-histona H3 (Lys27)</td><td>Upstate</td><td>07-448</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ~ cabra ~ anti ~conejo (H + L)</td> <td>Sonda molecular</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>ProlongGold</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Yoduro de propidio</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td>tóxico</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>tóxico ARNasa A</td><td>Roche</td><td>10109169001</td><td></td></tr><tr><td>frasco Coplin</td><td>Huber & CO</td><td>10.055</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>DUMONT BIOLOGY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Heidolph</td><td>543-12310-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Cámara húmeda</td><td></td><td></td><td>Una caja de plástico con una toalla de papel húmeda en su interior, se coloca un soporte de plástico en la caja para apoyar los toboganes y mantener los toboganes alejados del agua.</td></tr><tr><td>Corredera Superfrost Plus</td><td>Thermo Fisher</td><td>J1800AMNZ</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td></tr><tr><td>FISH Tag DNA KIt</td><td>Invitrogen</td><td>F32947</td><td></td></tr><tr><td>GFP booster</td><td>Chromotek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un método eficaz para cuantitativo, análisis de celda única de la cromatina modificación y arquitectura nuclear en todo el montaje en Óvulos<em&gt; arabidopsis</em

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

En las plantas con flores, la transición destino de la célula somática-a-reproductiva está marcada por la especificación de las células madre de esporas (CML) en los órganos florales de la planta adulta. El SMC macho (célula madre megaspore, MMC) diferencia en el primordio óvulo y sufre meiosis. El megáspora haploide seleccionado a continuación, se somete a la mitosis para formar el gametofito multicelular hembra, lo que dará lugar a los gametos, la célula del huevo y célula central, junto con las células accesorias. La accesibilidad limitada de la MMC, meiocyte y gametofito femenino dentro del óvulo es técnicamente difícil para citológico y citogenético analiza a nivel de células individuales. En particular, la inmunodetección directa o indirecta de los epítopos celulares o nucleares se deteriora por la falta de penetración de los reactivos dentro de la imagen de células de plantas y de una sola célula es arrendada por la falta de claridad óptica en todo el montaje en los tejidos. Por lo tanto, hemos desarrollado un método eficiente para analizar los nuclorganización del oído y la modificación de la cromatina en alta resolución de una de las células de todo el montaje óvulos Arabidopsis embebidos. Se basa en la disección y la incrustación de óvulos fijos en una capa delgada de gel de acrilamida en un portaobjetos de microscopio. Los óvulos incrustados son sometidos a los tratamientos químicos y enzimáticos destinados a mejorar la claridad del tejido y la permeabilidad a los reactivos de inmunotinción. Esos tratamientos preservar la organización, de ADN y de proteínas epítopos celulares y la cromatina. Las muestras se pueden utilizar para diferentes análisis citológicos aguas abajo, incluyendo la inmunotinción de la cromatina, hibridación in situ fluorescente (FISH), y la tinción de ADN para el análisis de la heterocromatina. Microscopía láser confocal (CLSM) de imágenes con alta resolución, seguida de reconstrucción 3D permite mediciones cuantitativas en la resolución de una sola célula.

Proporcionamos un protocolo robusto para la preparación a gran escala y el procesamiento de óvulos Arabidopsis adecuados para la tinción citológica en todo el montaje. Gracias a la incrustación, los óvulos conservan una estructura de 3 dimensiones (Figura 3). Además, el procesamiento de tejido incluyendo la clarificación óptica permite estructuras subcelulares de formación de imágenes en alta resolución. Figura 4 muestra la tinción de ADN en primordios óvulo todo el montaje don...

Ofrecemos aquí un protocolo eficiente y confiable para la inmunotinción, hibridación in situ fluorescente, la tinción de ADN seguido por cuantitativos, imágenes de alta resolución en óvulos de Arabidopsis thaliana todo el montaje. Este método fue utilizado con éxito para analizar modificaciones de la cromatina nuclear y de la arquitectura.

Un método eficaz para Cuantitativo, Análisis de celda única de la cromatina modificación y Arquitectura Nuclear en Todo el montaje en Óvulos<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar vistas de Arabidopsis para hibridación y tinción inmunológica en preparación completa. Esto se logra primero fijando capullos de flores frescos en la solución fijadora. El segundo paso consiste en diseccionar cuidadosamente e incrustar las vistas en almohadillas miniatura de acrilamida directamente sobre portaobjetos para microscopía.El siguiente paso del procesamiento del tejido permite la clarificación y la permeación del tejido. El paso final consiste en incubar las muestras tratadas con una solución de anticuerpos para tinción inmunológica o con una sonda marcada para hibridación fluorescente en C dos. En última instancia, la imagen confocal de alta resolución seguida de la reconstrucción tridimensional permite el análisis cuantitativo en preparaciones completas a nivel de célula individual.Este método se empleó inicialmente para obtener información sobre la organización del CT en la vista, pero también podría aplicarse para analizar otros compartimentos celulares en otros tejidos del espécimen y en otros organismos modelo. En tubos microfuga llenos con tampón BBO recién preparado y enfriado en hielo, coloque de 20 a 30 carp

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se presenta un método eficiente y simple para aislar embriones en las primeras etapas de desarrollo...

Aislamiento eficaz y rápida de los embriones en etapa temprana de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Semillas

Inmunoprecipitación de la cromatina es una técnica poderosa para la identificación de ADN sitios de las proteínas de Arabidopsis unión in vivo. Este procedimiento incluye la cromatina entrecruzamiento y la fragmentación, inmunoprecipitación con anticuerpos selectivos contra la proteína de interés, y el análisis qPCR de ADN unido. Se describe un chip de ensayo sencilla optimizada para plantas de Arabidopsis.

Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina para la Identificación de Arabidopsis proteína-DNA<em&gt; En Vivo</em

Este protocolo describe un método para la observación de embriogénesis en Arabidopsis vía separación de óvulo, seguido por la inspección de la formación de patrones de embrión bajo un microscopio.

Un método para la caracterización de embriogénesis en Arabidopsis

Este manuscrito describe una en vitro óvulo cultivo método que permite la proyección de imagen de células vivas de Arabidopsis cigotos y embriones. Este método se utiliza para visualizar la dinámica intracelular durante la polarización del cigoto y la especificación de destino celular en el desarrollo de embriones.

In Vitro Cultivo de óvulos para la proyección de imagen de cigoto polarización de Live-celular y patrones del embrión en Arabidopsis thaliana

En este protocolo, describimos las técnicas para la adecuada disección de flores de Arabidopsis y silicuas, algunas técnicas de compensación básica y seleccionado procedimientos de observaciones del conjunto de montaje de estructuras reproductivas de tinción.

Whole-mount y coloración de silicuas y órganos flor de Arabidopsis

Demostramos un método para determinar la fertilización exitosa o fallida sobre la base de la morfología nuclear espermática en la fertilización doble de Arabidopsis utilizando un microscopio de epifluorescencia.

Evaluación del Estado de Fertilización mediante el seguimiento de la morfología nuclear de los espermatozoides en la doble fertilización de Arabidopsis

Este protocolo describe la preparación de muestras intactas de la capa de células endospermas en semillas de Arabidopsis thaliana . El método solo requiere equipo de laboratorio común, como una aguja de inyección y pinzas de precisión, y permite obtener imágenes fluorescentes de células vivas de alta resolución de células endospermas tanto en semillas en desarrollo como maduras.

Preparación de tejido intacto para el análisis microscópico de la capa de células endospermas en semillas de Arabidopsis en desarrollo y maduras

El movimiento cromosómico durante la profase meiótica es un fenómeno poco conocido que es fundamental para la formación de esporas. Este protocolo describe un método para adquirir, analizar y cuantificar los movimientos del centrómero durante la profase meiótica en los meiocitos masculinos de Arabidopsis thaliana .

Caracterización por imágenes en vivo de los movimientos del centrómero durante la profase meiótica masculina en Arabidopsis thaliana

Este protocolo presenta un flujo de trabajo eficiente para la microscopía de localización de moléculas individuales de núcleos aislados de Arabidopsis, utilizando aislamiento, fijación y marcaje optimizados para lograr una visualización nanométrica fiable de la cromatina y la ARN polimerasa II. Este enfoque puede adaptarse fácilmente a otras proteínas asociadas a la cromatina o modificaciones de histonas para imágenes de alta resolución.

Un protocolo simplificado para microscopía de localización de molécula única en núcleos de Arabidopsis

Este protocolo de inmunolocalización en los meiocitos de maíz macho mantiene la integridad tridimensional de las células durante la meiosis. Permite el seguimiento dinámico de la localización intracelular de hasta tres anticuerpos independientes en material preservado fijado con paraformaldehído, además de DAPI, que tiñe el ADN.

Inmunolocalización tridimensional en meiocitos de maíz

Este proceso utiliza microscopía confocal junto con un núcleo marcado fluorescentemente y una línea de marcadores de cromatina en Arabidopsis thaliana para registrar simultáneamente la dinámica del núcleo y la cromatina en raíces de Arabidopsis e investigar cambios en estas dinámicas en respuesta a señales de desarrollo y ambientales.

Imagen cuantitativa de células vivas de la forma nuclear y la dinámica de la cromatina durante el desarrollo y el estrés ambiental en la raíz de Arabidopsis thaliana

Aprende un protocolo eficaz de inmunotinción y FISH en óvulos de Arabidopsis thaliana para analizar modificaciones de cromatina y arquitectura nuclear mediante imagen confocal de alta resolución.

Un método eficaz para Cuantitativo, Análisis de celda única de la cromatina modificación y Arquitectura Nuclear en Todo el montaje en Óvulos Arabidopsis (Video) | JoVE Journal

Un método eficaz para Cuantitativo, Análisis de celda única de la cromatina modificación y Arquitectura Nuclear en Todo el montaje en Óvulos

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