Un método eficaz para Cuantitativo, Análisis de celda única de la cromatina modificación y Arquitectura Nuclear en Todo el montaje en Óvulos Arabidopsis

El objetivo general de este procedimiento es preparar Arabidopsis Vues para la hibridación de montaje completo y la inmunotinción. Esto se logra fijando primero los botones florales frescos en la solución fijadora. El segundo paso consiste en diseccionar e incrustar cuidadosamente vues en almohadillas de acrilamida en miniatura directamente en portaobjetos de microscopía.

El procesamiento de tejidos Next permite la clarificación y permeación de tejidos. El paso final es incubar las muestras tratadas con una solución de anticuerpos para la tinción inmunológica o una sonda marcada para la hibridación fluorescente en C dos. En última instancia, las imágenes confocales de alta resolución seguidas de la reconstrucción tridimensional permiten el análisis cuantitativo en la montura completa a nivel de una sola célula.

Este método se empleó inicialmente para proporcionar información sobre la organización de la TC en la vista, pero también podría aplicarse para analizar otros compartimentos celulares en otros tejidos de la inmersión y en otros organismos modelo. En tubos de micro fuga llenos de tampón BBO recién hecho enfriado en hielo a 20 a 30 carpales por tubo, coloque los tubos para que se balanceen suavemente a temperatura ambiente durante media hora. A continuación, gire los tubos durante un minuto a 400 Gs. Luego aspire cuidadosamente los sobrenadantes, deséchelos y agregue un mililitro de PBT a los carpos. Coloque los tubos en hielo para que se monte cada tubo de carpos.

Se han preparado en hielo. Cinco tubos que contienen 200 microlitros. Una mezcla de acrilamida al 5% recién hecha.

Cinco diapositivas limpias de súper escarcha etiquetadas con un lápiz, un pensamiento Eloqua de 20%a PS y un pensamiento Eloqua de 20%NAPS de un tubo de carpos. Tome cuatro o cinco con una punta cortada y colóquelos cada uno en un portaobjetos. Retire el exceso de líquido pipeteando cuidadosamente con agujas finas.

Hacer cortes longitudinales en los carpos y quitar las paredes del carpo para liberar las hileras de vues. Este paso llevará práctica. Evite que los vues se sequen agregando hasta 10 microlitros de PBS, luego a un tubo de micro fuga que contiene la mezcla de acrilamida.

Agregue rápidamente 12 microlitros de NAPS y 12 microlitros de PS. Mezcle bien la solución con el pipeteo y agregue rápidamente 30 microlitros de esta acrilamida activada. Mézclalo en un portaobjetos con vues disecados. Coloque suavemente un pequeño cubreobjetos sobre la preparación y deje que la solución se polimerice a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora.

Prepare cada diapositiva de esta manera más tarde. Usa una cuchilla de afeitar para cortar los cubreobjetos. Las muestras se pueden almacenar durante la noche a cuatro grados centígrados en un frasco de coplan con PBS o proceder directamente con el procesamiento.

Generalmente, el procesamiento debe realizarse en frascos coplan con 80 mililitros de solución. Y bajo la campana extractora. Comience aclarando los tejidos a través de la incubación en una serie de soluciones de etanol etanol, una solución de etanol y xileno uno a uno, y nuevamente en etanol y luego metanol.

Cada baño dura cinco o 30 minutos. Consulte el protocolo de texto. A continuación, utilice una solución de metanol PBT uno a uno con 2,5% de formaldehído durante 15 minutos.

A continuación, enjuague el pañuelo en PBT dos veces durante 10 minutos por baño. Después de esto, los portaobjetos se pueden almacenar durante la noche a cuatro grados centígrados si es necesario. A continuación, tome hasta seis portaobjetos del frasco y escurra el exceso de líquido.

Colóquelos sobre un papel de seda y agregue rápidamente 100 microlitros de una enzima de digestión de la pared celular enfriada. Mezcle sobre las almohadillas. A continuación, cubra los portaobjetos con cubreobjetos grandes.

Incubar los portaobjetos durante dos horas a 37 grados centígrados en una cámara húmeda. Es importante optimizar la temperatura de digestión del CO para cada nueva solución enzimática porque este paso es fundamental para una tinción homogénea posterior. Lave los portaobjetos dos veces con PBT durante cinco minutos por lavado.

A continuación, drene los portaobjetos ahora a cada portaobjetos. Añadir 100 microlitros de ARNs A en PBS completado con 1%tween e incubar los portaobjetos durante una hora a 37 grados centígrados en una cámara húmeda después de la incubación, lavar los portaobjetos dos veces con PBT como antes, y luego fijar de nuevo el tejido incubando los portaobjetos en un baño de PBTF recién hecho durante 20 minutos. Enjuague el PBTF con un lavado en PBT durante 10 minutos.

A continuación, se procede a la permeación de los tejidos incubando los portaobjetos en PBS con 2%tween durante dos horas a cuatro grados centígrados. Use dos lavados en PBT cada uno de cinco minutos para eliminar la solución permeable. A continuación, proceda con la inmunotinción.

Comience incubando los portaobjetos en el anticuerpo primario de interés. Aplicar 100 microlitros de alícuotas del anticuerpo diluido en PBS y con 0,2% entre cada portaobjetos. Transfiera los portaobjetos a una cámara húmeda e incubelos a cuatro grados centígrados durante 12 a 24 horas.

Lave los portaobjetos en un baño de PBT durante dos a cuatro horas con un balanceo suave a temperatura ambiente. A continuación, añadir 100 microlitros de anticuerpo secundario diluido de uno a 200 en PBS con 0,2% entre 20 e incubar los portaobjetos durante 24 horas a cuatro grados centígrados. Un baño de una hora en PBT con un balanceo suave es suficiente para lavar los portaobjetos de anticuerpo secundario no unido.

A continuación, contratiñir el ADN con una solución de 10 microgramos por mililitro de yoduro de propidio en PBS. Deje que la mancha continúe durante 15 minutos y luego lave los portaobjetos con PBT balanceando suavemente durante 15 minutos a temperatura ambiente. Ahora monte los portaobjetos con un medio antidecoloración complementado con 10 microgramos por mililitro de yoduro de propidio.

Después de dejar reposar durante una hora, tome una imagen de los portaobjetos en un microscopio confocal utilizando una lente de inmersión en glicerol de 63 aumentos. Por lo tanto, durante la adquisición de imágenes, es fundamental mantener los ajustes de escaneo idénticos entre las muestras para permitir la cuantificación comparativa y utilizar un modo de detección lineal. Posteriormente, reconstruya las imágenes en serie en estructuras tridimensionales, segmente cada núcleo de interés y utilice software de procesamiento de imágenes 3D para cuantificar las señales.

Utilizando este robusto protocolo de preparación a gran escala, los Montes Vues completos conservarán su estructura tridimensional. Las estructuras subcelulares se vuelven visibles con gran detalle, como se ve con la cromatina. Al teñir el ADN, la heterocromatina aparece como un foco brillante y bien definido sin necesidad de aplicar deconvolución.

Este protocolo permite la tinción inmunológica paralela con varios anticuerpos en una ronda. Por ejemplo, el marcador permisivo asociado a la cromatina U, H tres trimm lisina metilada cuatro, y el marcador asociado a heterocromatina H tres lisina monometil 27 se detectaron en un experimento en distintos portaobjetos replicados para analizar la dinámica de la cromatina. Otra técnica compatible es la hibridación fluorescente C dos o peces a 45 s.Ribosomal.

Las repeticiones de ADN se utilizaron para definir las regiones de organización nuclear. La sonda se marcó directamente con Alexa 4 88, y el ADN se tiñó con contadores Para el análisis de la ificación, es muy importante probar diferentes diluciones y tiempos de incubación para identificar las condiciones que dan una señal robusta y homogénea con la menor cantidad posible. Y la contrición corporal.

Dado que este método logra una excelente conservación del tejido y una permeación óptima para el análisis de la organización de la cromatina en una sola célula, allana el camino para que los científicos en el campo de la biología celular de las plantas o la epigenética de las plantas investiguen la organización nuclear o subcelular a nivel de una sola célula y en todo el contexto del hombre.