Name: Un método eficaz para Cuantitativo, Análisis de celda única de la cromatina modificación y Arquitectura Nuclear en Todo el montaje en Óvulos Arabidopsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Aprende un protocolo eficaz de inmunotinción y FISH en óvulos de Arabidopsis thaliana para analizar modificaciones de cromatina y arquitectura nuclear mediante imagen confocal de alta resolución.

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Agradecemos a Ueli Grossniklaus (Universidad de Zúrich) por su apoyo técnico y financiero. Agradecemos a Valeria Gagliardini, Christof Eichenberger, Arturo Bolaños y Peter Kopf por el apoyo general del laboratorio. Esta investigación fue financiada por la Universidad de Zúrich, becas de la Fundación Nacional Suiza a CB (31003A_130722) y Ueli Grossniklaus (31003A_141245 y 31003AB-126006), y la Agence Nationale de la Recherche a DG (Programa ANR-BLANC-2012).

El procedimiento se describe en el flujo de trabajo en la Figura 1, y la configuración para la disección y la incrustación de tejidos se presentan en la Figura 2. 1. Fijación del tejido <ol><li> Recoger 20-30 carpelos en un tubo de microcentrífuga que contiene recién hecho tampón fijador BVO en hielo. </li><li> Fijar el tejido 30 min con agitación suave a temperatura ambiente. </li><li> Haga girar los tubos que contienen los carpelos en fijador en una microcentrífuga de sobremesa 1 min a 400 x g. </li><li> Retire con cuidado el tampón fijador y agregar 1 ml de PBT, coloque los tubos en hielo. </li></ol> 2. Disección e incrustación <ol><li> Preparar cinco tubos Eppendorf con cada 200 l de una recién hecha, 5% de mezcla de acrilamida. </li><li> Preparar cinco portaobjetos Superfrost pre-limpiados con etanol al 70% y se marcaron con un lápiz. </li><li> Descongelar una alícuota de 20% y 20% de APS NaPS cada uno, en el hielo. </li><li> Tome 4-5 carpelos con una punta de corte final, el lugarsobre una lámina limpia, eliminar el exceso de líquido. </li><li> Haga cortes longitudinales con una aguja fina y separar las paredes carpelo para liberar filas de óvulos como se muestra la Figura 2, evitar el secado, cubriendo con PBS (no más de 10 l). </li><li> Añadir rápidamente y mezclar 12 NaPS mu l, 12 APS mu l con una alícuota de 200 l de mezcla de acrilamida. </li><li> Añadir 30 l de la acrilamida activado en los óvulos disecados. </li><li> Tapar con un cubreobjetos mm 20 x 20, por no polimeriza a temperatura ambiente, 45 a 60 min. </li><li> Retire el cubreobjetos usando una cuchilla de afeitar. En esta etapa, las muestras se pueden mantener durante la noche a 4 ° C en un vaso de Coplin que contenía PBS. </li></ol> 3. Procesamiento de tejido NOTA: Todos los pasos, excepto 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 y 3.4.3 se llevan a cabo en frascos de Coplin con 80 ml de solución bajo el capó química a temperatura ambiente. Las diapositivas se transfieren con una pinza de punta plana. <ol><li> Clarificación de tejidos yfijación: <ol><li> Incubar 5 min en metanol. </li><li> Incubar 5 min en etanol. </li><li> Incubar 30 min en etanol: xileno (1:1). </li><li> Incubar 5 min en etanol. </li><li> Incubar 5 min en metanol. </li><li> Incubar 15 min en metanol y PBT (01:01), complementado con 2,5% de formaldehído. </li><li> Enjuague 2 x 10 min en PBT. En esta etapa, las diapositivas se pueden mantener durante la noche a 4 ° C. </li></ol></li><li> La digestión de la pared celular: <ol><li> Descongelar una alícuota de la mezcla de la digestión de la pared celular en hielo. </li><li> Tome un portaobjetos del frasco de Coplin, drenar el exceso de líquido, colocándolo en posición vertical sobre una toalla de papel. </li><li> Añadir 100 l de mezcla de digestión de la pared celular sobre la almohadilla de acrilamida y cubrir con un cubreobjetos 23 mm x 46. Repita el procedimiento para las otras diapositivas. Incubar durante 2 horas a 37 ° C en una cámara húmeda (se describe en Materiales). </li><li> Lavar el portaobjetos 2 x 5 min en PBT. </li></ol></li><li> RNasa A de tratamiento: <ol><li> Tome un portaobjetos del frasco de Coplin, drene ªe exceso de líquido como antes. </li><li> Incubar cada portaobjetos con 100 l de ARNasa A a 100 g / ml en PBS con 1% de Tween-20 durante 1 hora a 37 ° C en una cámara húmeda. </li><li> Lavar los portaobjetos durante 2 x 5 min en PBT. </li></ol></li><li> Posteriores a la fijación y permeabilización: <ol><li> Post-fijar durante 20 minutos en recién hecha PBT-F. </li><li> Enjuagar los portaobjetos durante 10 minutos en PBT. </li><li> Permeabilizar durante 2 horas en PBS con 2% de Tween-20 a 4 ° C. </li><li> Enjuagar los portaobjetos durante 2 x 5 min en PBT. </li></ol></li></ol> 4. Inmunotinción NOTA: Para este paso, la concentración óptima del anticuerpo primario tiene que ser probado mediante el uso de diferentes diluciones (1:200, 1:500, 1:1000) de los anticuerpos. <ol><li> Incubar cada portaobjetos con 100 l de anticuerpo primario diluido en PBS con 0,2% de Tween-20 durante 12-24 horas a 4 ° C. </li><li> Lavar los portaobjetos en PBT durante 2-4 horas a temperatura ambiente bajo agitación suave. </li><li> Aplicar la1:200 de anticuerpo secundario en PBS + 0,2% de Tween-20 durante 24 horas a 4 ° C. </li><li> Lavar los portaobjetos en PBT durante 1 hora a temperatura ambiente bajo agitación suave. </li><li> Contratinción con 10 g / ml de yoduro de propidio en PBS durante 15 min, luego enjuague 15 min en PBS bajo agitación suave, a temperatura ambiente. </li><li> Monte en anti-fading medio de montaje líquido suplementado con 10 mg / ml de yoduro de propidio. Deje que el medio de montaje se endurezca durante 1 hora antes de la adquisición de imágenes por CLSM. </li></ol> 5. Imagen Cuantitativa <ol><li> La adquisición de imágenes: <ol><li> Adquirir imágenes de alta resolución utilizando CLSM, idealmente utilizando un modo de escaneo de resonancia, lo que permite una mejor conservación de las señales fluorescentes más prolongado de formación de imágenes 23, y una lente de inmersión 63X glicerol. </li><li> Compruebe los parámetros de adquisición, tales como la intensidad del láser, la ganancia, pinhole, tamaño de voxel y el factor de zoom al inicio del experimento para definir un procedimiento de adquisición estándar a seguir estrictamente lo largotodas las diapositivas para las mediciones cuantitativas consistentes. </li><li> Verificar la ausencia de interferencia entre fluorocromos. Si está presente, establecer una exploración secuencial. Adquirir imágenes de transmisión por separado y no simultáneamente. </li><li> Lleve a cabo la adquisición de imágenes en serie, en tres dimensiones con la resolución más alta posible en las dimensiones X e Y, y con sobremuestreo 2x en la dimensión z (la regla de Nyquist). </li></ol></li><li> Tratamiento de la imagen: <ol><li> Reconstruir imágenes en serie en tres dimensiones utilizando software comercial o de código abierto. </li><li> Definir las superficies de contorno alrededor de cada núcleo (o célula) de interés en 3D. </li><li> Cuantificar la fluorescencia en cada canal como la suma de intensidades de los píxeles en cada objeto. </li><li> Exportar los datos a Excel para su análisis estadístico. Normalizar las señales de anticuerpos contra las señales de tinción por ejemplo ADN. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Maheshwari, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaheshwari%2C+P+%22An+introduction+to+the+embryology+of+angiosperms%22">An introduction to the embryology of angiosperms</a>. , McGraw-Hill. New York. (1950).</li>
<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+the+Arabidopsis+megaspore+mother+cell+uncovers+the+importance+of+RNA+helicases+for+plant+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germline development.</a> PLoS Biol. 9 (9), (2011).</li>
<li>Schmidt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+powerful+method+for+transcriptional+profiling+of+specific+cell+types+in+eukaryotes%3A+laser-assisted+microdissection+and+RNA+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA Sequencing.</a> PLoS One. 7 (1), (2012).</li>
<li>Wuest, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+female+gametophyte+gene+expression+map+reveals+similarities+between+plant+and+animal+gametes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes.</a> Curr Biol. 20 (6), 506-512 (2010).</li>
<li>Koornneef, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+tools+for+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic tools for Arabidopsis thaliana.</a> Chromosome Res. 11 (3), 183-194 (2003).</li>
<li>Oliver, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+histone+H3+modifications+is+species-specific+in+plant+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">The dynamics of histone H3 modifications is species-specific in plant meiosis.</a> Planta. 238 (1), 23-33 (2013).</li>
<li>Ravi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis-specific+loading+of+the+centromere-specific+histone+CENH3+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Meiosis-specific loading of the centromere-specific histone CENH3 in Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Genet. 7 (6), (2011).</li>
<li>Borges, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+the+epigenome+in+Arabidopsis+pollen%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Reprogramming the epigenome in Arabidopsis pollen.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 77, 1-5 (2012).</li>
<li>Pandey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+alterations+during+pollen+development+in+Hordeum+vulgare%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Chromatin alterations during pollen development in Hordeum vulgare.</a> Cytogenet Genome Res. 141 (1), 50-57 (2013).</li>
<li>Schoft, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+RNA-directed+DNA+methylation+upon+decondensation+of+constitutive+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Induction of RNA-directed DNA methylation upon decondensation of constitutive heterochromatin.</a> EMBO Rep. 10 (9), 1015-1021 (2009).</li>
<li>Barrell, P. J., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy+of+whole+ovules+for+analysis+of+reproductive+development%3A+the+elongate1+mutant+affects+meiosis+II%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy of whole ovules for analysis of reproductive development: the elongate1 mutant affects meiosis II.</a> Plant J. 43 (2), 309-320 (2005).</li>
<li>Braselton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feulgen+staining+of+intact+plant+tissues+for+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Histochem%22%5BJournal%5D)">Feulgen staining of intact plant tissues for confocal microscopy.</a> Biotech. Histochem. 71, 84-87 (1996).</li>
<li>Scott, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parent-of-origin+effects+on+seed+development+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Parent-of-origin effects on seed development in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 125, 3329-3341 (1998).</li>
<li>Armstrong, S. J., Jones, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+meiosis+in+wild-type+Arabidopsis+thaliana+and+in+two+meiotic+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Sex+Plant+Reprod%22%5BJournal%5D)">Female meiosis in wild-type Arabidopsis thaliana and in two meiotic mutants.</a> Sex Plant Reprod. 13, 177-183 (2001).</li>
<li>Grimanelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochronic+expression+of+sexual+reproductive+programs+during+apomictic+development+in+Tripsacum%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Heterochronic expression of sexual reproductive programs during apomictic development in Tripsacum.</a> Genetics. 165, 1521-1531 (2003).</li>
<li>Gutierrez-Marcos, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+gametophytic+baseless1+is+required+for+development+of+the+central+cell+and+early+endosperm+patterning+in+maize+%28Zea+mays%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Maternal gametophytic baseless1 is required for development of the central cell and early endosperm patterning in maize (Zea mays).</a> Genetics. 174 (1), 317-329 (2006).</li>
<li>Niedojadło, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+RNA+of+Hyacinthus+orientalis+L.+female+gametophyte+cells+before+and+after+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Ribosomal RNA of Hyacinthus orientalis L. female gametophyte cells before and after fertilization.</a> Planta. 236, 171-184 (2012).</li>
<li>Williams, J. H., Friedman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+four-celled+female+gametophyte+of+Illicium+%28Illiciaceae%3B+Austrobaileyales%29%3A+Implications+for+understanding+the+origin+and+early+evolution+of+monocots%2C+eumagnoliids%2C+and+eudicots%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Bot%22%5BJournal%5D)">The four-celled female gametophyte of Illicium (Illiciaceae; Austrobaileyales): Implications for understanding the origin and early evolution of monocots, eumagnoliids, and eudicots.</a> Am J Bot. 91 (3), 332-351 (2004).</li>
<li>Bass, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+cluster+de+novo+before+the+initiation+of+synapsis%3A+a+three-dimensional+spatial+analysis+of+telomere+positions+before+and+during+meiotic+prophase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Telomeres cluster de novo before the initiation of synapsis: a three-dimensional spatial analysis of telomere positions before and during meiotic prophase.</a> J Cell Biol. 137 (1), 5-18 (1997).</li>
<li>Howe, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+acrylamide+fluorescence+in+situ+hybridization+for+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells.</a> Methods Mol Biol. 990, 53-66 (2013).</li>
<li>She, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+reprogramming+during+the+somatic-to-reproductive+cell+fate+transition+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Chromatin reprogramming during the somatic-to-reproductive cell fate transition in plants.</a> Development. 140 (19), 4008-4019 (2013).</li>
<li>Pillot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+and+endosperm+inherit+distinct+chromatin+and+transcriptional+states+from+the+female+gametes+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Embryo and endosperm inherit distinct chromatin and transcriptional states from the female gametes in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 22 (2), 307-320 (2010).</li>
<li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRT+letter%3A+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching.</a> Microsc Res Tech. 69 (9), 689-692 (2006).</li>
<li>Autran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+epigenetic+pathways+control+parental+contributions+to+Arabidopsis+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis.</a> Cell. 145 (5), 707-719 (2011).</li>
<li>Fransz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interphase+chromosomes+in+Arabidopsis+are+organized+as+well+defined+chromocenters+from+which+euchromatin+loops+emanate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 99 (22), 14584-14589 (2002).</li>
<li>Cox, W. G., Singer, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+DNA+hybridization+probe+preparation+using+amine+modification+and+reactive+dye+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Fluorescent DNA hybridization probe preparation using amine modification and reactive dye coupling.</a> BioTechniques. 36 (1), 114-122 (2004).</li>
<li>Lysak, M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLysak%2C+M+%22Cytogenetic+analyses+of+Arabidopsis+In+Arabidopsis+Protocols%3A+Methods+in+Molecular+Biology%2C+2nd+ed%22">Cytogenetic analyses of Arabidopsis In Arabidopsis Protocols: Methods in Molecular Biology, 2nd ed</a>. Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. , Humana Press. Totowa, NJ. 173-186 (2006).</li>
<li>Chieco, P., Derenzini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Feulgen+reaction+75+years+on%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Feulgen reaction 75 years on.</a> Histochem Cell Biol. 111 (5), 345-358 (1999).</li>
<li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+staining+for+fluorescence+and+laser+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy.</a> J Histochem Cytochem. 45 (1), 49-53 (1997).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Bauwens, S., Oostveldt, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+of+repetitive+DNA+sequences+on+interphase+nuclei+of+the+small+cruciferous+plant+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Procedures+for+In+Situ+Hybridization+to+Chromosomes%2C+Cells%2C+and+Tissue+Sections.+Nonradioactive+in+situ+hybridization+application+manual%22%5BJournal%5D)">Whole mount fluorescence in situ hybridization (FISH) of repetitive DNA sequences on interphase nuclei of the small cruciferous plant Arabidopsis thaliana.</a> Procedures for In Situ Hybridization to Chromosomes, Cells, and Tissue Sections. Nonradioactive in situ hybridization application manual. , 165-171 (1996).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

En las plantas con flores, el linaje reproductivo femenino está rodeado por varias capas de células incluyendo la nucela y los tegumentos de óvulos, haciendo así la tinción citológica en todo el montaje técnicamente difícil. Aquí presentamos un protocolo eficiente que permite la preparación y elaboración de un gran número de óvulos adecuados para la tinción citológica como inmunotinción, la tinción de ADN y la hibridación fluorescente in situ en todo el montaje. Se utilizó con éxito para el análisis de...

En las plantas con flores, el establecimiento de linajes reproductiva comienza con la diferenciación de las SMC, MMC hembra y de células madre de microsporas masculino. El MMC se desarrolla a partir de una célula nucellar sub-epidérmica en el extremo distal del primordio óvulo y la célula madre de microsporas se desarrolla a partir de tejido esporógena en la antera lóculo, que se encuentran en el interior de los órganos florales 1. CML sufren meiosis para producir esporas haploides, que luego dan lugar a los gametofitos sobre la mitosis. El gametofito femenino o saco embrionario, se compone de un óvulo, una célula central, dos y tres sinérgidas antípodas. El gametofito masculino, o el polen, se compone de una célula vegetal y dos espermatozoides. Mientras que el gametofito masculino sigue siendo un objeto de estudio-de-relativamente accesible, el gametofito femenino está incrustado dentro del óvulo, en sí encerrado en el carpelo flor, y por lo tanto plantea retos específicos para los análisis moleculares y citológicos. Recientemente, sin embargo, con ayuda de lásermicrodisección ofrece una solución elegante que permite transcriptómica analiza en el MMC y células gametofítico femeninos 2-4. Además de la expresión del gen candidato análisis, usando, por ejemplo ARN hibridación in situ o ensayos de gen reportero, análisis citológicos permite la investigación de la dinámica de los componentes celulares endógenos utilizando tinción celular directo específico o inmunotinción indirecta. En particular, la tinción citogenético mediante FISH y la tinción de ADN, junto con la inmunotinción de modificaciones de la cromatina o componentes de la cromatina son los enfoques centrales para dilucidar la dinámica de la cromatina y la organización nuclear de Arabidopsis 5. Habitualmente, la meiosis implica dinámica de los cromosomas específicos que ha sido bien investigados en planta macho meiocytes 6,7; además de gran escala, la reorganización de la cromatina de células específicos, reflejando probablemente la reprogramación epigenética dinámica ha sido descrita durante el desarrollo del polen 8-10. Por el contrario, debidoa la relativa inaccesibilidad de la meiocyte hembra y gametofito, estas investigaciones siguen siendo técnicamente difíciles de aplicar, y a menudo requieren la disección de seccionamiento o manual y la digestión enzimática (ver más abajo). Además, la frecuente falta de claridad óptica en todo el montaje es un obstáculo para imágenes de alta resolución de las células reproductoras en óvulos intactos. Un método clásico para el análisis citológico de organización de los cromosomas en óvulos de todo el montaje utiliza la tinción de Feulgen 11-13. Se trata de la hidrólisis ácida (usando ácido hipocloroso) del ADN que resulta en desnaturalización de la proteína y por lo tanto causa la destrucción de la estructura de la cromatina. Alternativamente, organización de los cromosomas en meiocytes femeninas y células gametofítico se puede observar mediante DAPI y la inmunotinción de las secciones semi-delgadas o sacos embrionarios disecados y MMC (por ejemplo, ver 14-18). Claramente, sin embargo, la disección manual y de corte pueden ser mano de obra intensiva yimpide en el análisis cualitativo y cuantitativo de un gran número de epítopos de la cromatina. Aquí les ofrecemos un protocolo eficiente para preparar un gran número de óvulos Arabidopsis adecuados para una variedad de tinción citológica aguas abajo en todo el montaje. En breve, los brotes de flor se incuban en una solución de fijación, las filas de óvulos se disecan de la carpelo y embebidos en acrilamida en la diapositiva como se hizo para meiocitos polen 19,20. Los óvulos incrustados se borrarán y se fijaron en metanol, etanol, y xileno antes de la digestión de la pared celular y permeabilización. Se discuten las posibles variaciones de estos pasos. Las muestras luego se pueden utilizar para la tinción de ADN, inmunotinción, y FISH. El modo de preparación es eficiente y permite paralelo experimental (hasta 16 diapositivas se pueden preparar en un día diferente para el análisis de aguas abajo). Los tratamientos descritos permiten señales homogéneas en todo el montaje e histológico, celular bien conservados,y la organización nuclear en las células reproductoras y las células circundantes que se benefician nucelar comparaciones cualitativas y cuantitativas entre los tipos de células. Calibrado, imágenes basadas en CLSM de alta resolución seguida de reconstrucción en 3 dimensiones permite mediciones cuantitativas significativas de señales fluorescentes. Hemos utilizado con éxito este procedimiento para analizar la dinámica de la cromatina en el MMC diferenciador 21 y desarrollando gametofito femenino 22; Presentamos aquí los resultados representativos de análisis heterocromatina, inmunotinción cromatina, la inmunotinción GFP y FISH en todo el montaje óvulos. Además, creemos que nuestro protocolo será adecuado para otros tejidos y especies de plantas.

<table><tbody><tr><td>Soluciones</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fijación BVO (basado en32)</td><td></td><td></td><td>2 mM EGTA, pH 7,5, 1% (v/v) formaldehído, 10% DMSO, 1x PBS, 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td>, 1x PBS, 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>PBT-F</td><td></td><td></td><td>1x PBT, 2,5% (v/v) formaldehído</td></tr><tr><td>30% acrilamida:bisacrilamida</td><td></td><td></td><td>3 g de acrilamida, 0,33 g de bisacrilamida, 1x PBS (preparar 10 ml, almacenar a 4 & deg; C)</td></tr> <tr><td>200 ml de mezcla de acrilamida al 5% en PBS</td><td></td><td></td><td>34 ml 30% acrilamida:bisacrilamida, 166 ml 1x PBS (hacer fresco con 30% de caldo)</td></tr><tr><td>20% de persulfto de amonio</td> 0,2 g de persulfto <td></td><td></td> de <td>amonio, 1 ml de agua estéril (preparar alícuotas con 1 ml y almacenar a -20 &deg; C)</td></tr> <tr><td>20% de sulfito</td><td></td><td></td> de sodio<td>, 0,2 g de sulfito de sodio, 1 ml de agua estéril (prepare alícuotas con 1 ml y almacene a -20 & grados; C)</td></tr> <tr>Mezcla <td></td><td></td> de <td>enzimas de la pared celular</td><td>0,5% (p/v) de celulasa, 1% (p/v) de driselasa, 0,5% (p/v) de pectoliasa</td></tr><tr><td>Reactivos y materiales</td> Formaldehído <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amaresco</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Schaurlau</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Schaurlau ME03062500</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>ROTH</td><td>4436.1</td><td></td></tr><tr><td>Celulasa</td><td>Sigma</td><td>1794</td><td></td></tr><tr><td>Driselase</td><td>Sigma</td><td>D8037</td><td></td></tr><tr><td>pectolyase</td><td>Sigma</td><td>P5936</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 Merck</td><td></td><td>8.22184.0500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>acrilamida</td><td>Sigma</td><td>A-3553</td><td></td></tr><tr><td>bisacrilamida</td><td>Sigma</td><td>M2022</td><td></td></tr><tr><td>persulfato de amonio</td> tóxico <td>Sigma</td><td>A9164</td><td></td></tr><tr><td>Sulfito de sodio</td><td>Fluka</td><td>71988</td><td></td></tr><tr><td>Anti-trimetil-histona H3 (Lys4)</td><td>Upstate</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>Anti-monometil-histona H3 (Lys27)</td><td>Upstate</td><td>07-448</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ~ cabra ~ anti ~conejo (H + L)</td> <td>Sonda molecular</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>ProlongGold</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Yoduro de propidio</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td>tóxico</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>tóxico ARNasa A</td><td>Roche</td><td>10109169001</td><td></td></tr><tr><td>frasco Coplin</td><td>Huber & CO</td><td>10.055</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>DUMONT BIOLOGY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Heidolph</td><td>543-12310-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Cámara húmeda</td><td></td><td></td><td>Una caja de plástico con una toalla de papel húmeda en su interior, se coloca un soporte de plástico en la caja para apoyar los toboganes y mantener los toboganes alejados del agua.</td></tr><tr><td>Corredera Superfrost Plus</td><td>Thermo Fisher</td><td>J1800AMNZ</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td></tr><tr><td>FISH Tag DNA KIt</td><td>Invitrogen</td><td>F32947</td><td></td></tr><tr><td>GFP booster</td><td>Chromotek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un método eficaz para cuantitativo, análisis de celda única de la cromatina modificación y arquitectura nuclear en todo el montaje en Óvulos<em&gt; arabidopsis</em

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

En las plantas con flores, la transición destino de la célula somática-a-reproductiva está marcada por la especificación de las células madre de esporas (CML) en los órganos florales de la planta adulta. El SMC macho (célula madre megaspore, MMC) diferencia en el primordio óvulo y sufre meiosis. El megáspora haploide seleccionado a continuación, se somete a la mitosis para formar el gametofito multicelular hembra, lo que dará lugar a los gametos, la célula del huevo y célula central, junto con las células accesorias. La accesibilidad limitada de la MMC, meiocyte y gametofito femenino dentro del óvulo es técnicamente difícil para citológico y citogenético analiza a nivel de células individuales. En particular, la inmunodetección directa o indirecta de los epítopos celulares o nucleares se deteriora por la falta de penetración de los reactivos dentro de la imagen de células de plantas y de una sola célula es arrendada por la falta de claridad óptica en todo el montaje en los tejidos. Por lo tanto, hemos desarrollado un método eficiente para analizar los nuclorganización del oído y la modificación de la cromatina en alta resolución de una de las células de todo el montaje óvulos Arabidopsis embebidos. Se basa en la disección y la incrustación de óvulos fijos en una capa delgada de gel de acrilamida en un portaobjetos de microscopio. Los óvulos incrustados son sometidos a los tratamientos químicos y enzimáticos destinados a mejorar la claridad del tejido y la permeabilidad a los reactivos de inmunotinción. Esos tratamientos preservar la organización, de ADN y de proteínas epítopos celulares y la cromatina. Las muestras se pueden utilizar para diferentes análisis citológicos aguas abajo, incluyendo la inmunotinción de la cromatina, hibridación in situ fluorescente (FISH), y la tinción de ADN para el análisis de la heterocromatina. Microscopía láser confocal (CLSM) de imágenes con alta resolución, seguida de reconstrucción 3D permite mediciones cuantitativas en la resolución de una sola célula.

Proporcionamos un protocolo robusto para la preparación a gran escala y el procesamiento de óvulos Arabidopsis adecuados para la tinción citológica en todo el montaje. Gracias a la incrustación, los óvulos conservan una estructura de 3 dimensiones (Figura 3). Además, el procesamiento de tejido incluyendo la clarificación óptica permite estructuras subcelulares de formación de imágenes en alta resolución. Figura 4 muestra la tinción de ADN en primordios óvulo todo el montaje don...

Ofrecemos aquí un protocolo eficiente y confiable para la inmunotinción, hibridación in situ fluorescente, la tinción de ADN seguido por cuantitativos, imágenes de alta resolución en óvulos de Arabidopsis thaliana todo el montaje. Este método fue utilizado con éxito para analizar modificaciones de la cromatina nuclear y de la arquitectura.

Un método eficaz para Cuantitativo, Análisis de celda única de la cromatina modificación y Arquitectura Nuclear en Todo el montaje en Óvulos<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar vistas de Arabidopsis para hibridación y tinción inmunológica en preparación completa. Esto se logra primero fijando capullos de flores frescos en la solución fijadora. El segundo paso consiste en diseccionar cuidadosamente e incrustar las vistas en almohadillas miniatura de acrilamida directamente sobre portaobjetos para microscopía.El siguiente paso del procesamiento del tejido permite la clarificación y la permeación del tejido. El paso final consiste en incubar las muestras tratadas con una solución de anticuerpos para tinción inmunológica o con una sonda marcada para hibridación fluorescente en C dos. En última instancia, la imagen confocal de alta resolución seguida de la reconstrucción tridimensional permite el análisis cuantitativo en preparaciones completas a nivel de célula individual.Este método se empleó inicialmente para obtener información sobre la organización del CT en la vista, pero también podría aplicarse para analizar otros compartimentos celulares en otros tejidos del espécimen y en otros organismos modelo. En tubos microfuga llenos con tampón BBO recién preparado y enfriado en hielo, coloque de 20 a 30 carpos por tubo y deje que los tubos agiten suavemente a temperatura ambiente durante media hora. A continuación, centrifugue los tubos durante un minuto a 400 Gs. Luego aspire cuidadosamente los sobrenadantes, deséchelos y añada un mililitro de PBT a los carpos. Coloque los tubos en hielo para cada tubo de carpos a montar.Preparar en hielo. Cinco tubos que contienen 200 microlitros. Una mezcla recién preparada de acrilamida al 5%.Cinco portaobjetos limpios tipo Super Frost marcados con un lápiz, una solución Eloqua de 20 % de PS y una solución Eloqua de 20 % de NAPS de un tubo de carpos. Tome cuatro o cinco con la punta cortada y colóquelos individualmente sobre cada portaobjeto. Retire el exceso de líquido pipeteando cuidadosamente con agujas finas.Realice cortes longitudinales en los carpianos y retire las paredes carpianas para liberar las hileras de vues. Este paso requerirá práctica. Evite que los vues se sequen agregando hasta 10 microlitros de PBS, y luego transfiéralos a un tubo de microcentrífuga que contenga la mezcla de acrilamida.Agregue rápidamente 12 microlitros de NAPS y 12 microlitros de una PS. Mezcle bien la solución mediante pipeteo y agregue rápidamente 30 microlitros de esta acrilamida activada. Mezcle sobre un portaobjetos con cortes histológicos. Coloque suavemente una pequeña cubreobjetos sobre la preparación y deje que la solución polimerice a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora.Prepare cada portaobjetos de esta manera más adelante. Utilice una cuchilla de afeitar para desprender las laminillas. Las muestras pueden almacenarse durante la noche a cuatro grados Celsius en un frasco coplano con PBS o procesarse directamente a continuación.Generalmente, el procesamiento debe realizarse en frascos coplán con 80 mililitros de solución y bajo la campana extractora. Comience por aclarar los tejidos mediante incubación en una serie de soluciones de metanol-etanol, una solución de etanol-xilol uno a uno, y nuevamente en etanol y luego en metanol.Cada baño dura cinco o 30 minutos. Consulte el protocolo escrito. A continuación, use una solución de PBT con metanol al 1:1 con 2,5 % de formaldehído durante 15 minutos.Luego, enjuague el tejido en PBT dos veces durante 10 minutos por baño. Después de esto, las laminillas pueden almacenarse durante la noche a cuatro grados Celsius si es necesario. A continuación, tome hasta seis laminillas del frasco y elimine el líquido sobrante.Colóquelos sobre un papel de tejido y agregue rápidamente 100 microlitros de una enzima fría de digestión de la pared celular. Mezcle sobre las almohadillas. Luego cubra los portaobjetos con cubreobjetos grandes.Incube las laminillas durante dos horas a 37 grados Celsius en una cámara húmeda. Es importante optimizar la temperatura de digestión con CO para cada nueva solución enzimática, ya que este paso es crítico para obtener una tinción homogénea posteriormente. Lave las laminillas dos veces con PBT durante cinco minutos por cada lavado.Luego, drene las laminillas y añada a cada una 100 microlitros de RNAsa en PBS completado con 1 % de tween. Incube las laminillas durante una hora a 37 grados Celsius en una cámara húmeda. Tras la incubación, lave las laminillas dos veces con PBT como antes, y luego fije nuevamente el tejido incubando las laminillas en un baño de PBTF recién preparado durante 20 minutos. Enjuague el PBTF con un lavado en PBT durante 10 minutos.Luego, proceda a la permeabilización del tejido incubando los portaobjetos en PBS con tween al 2% durante dos horas a cuatro grados Celsius. Utilice dos lavados en PBT de cinco minutos cada uno para eliminar la solución permeabilizante. A continuación, continúe con la inmunotinción.Comience incubando los portaobjetos en el anticuerpo primario de interés. Aplique alícuotas de 100 microlitros del anticuerpo diluido en PBS y con 0,2% entre cada portaobjeto. Transfiera los portaobjetos a una cámara húmeda e incúbelos a cuatro grados Celsius durante 12 a 24 horas.Lave las laminillas en un baño de PBT durante dos a cuatro horas con agitación suave a temperatura ambiente. A continuación, agregue 100 microlitros de anticuerpo secundario diluido uno a 200 en PBS con 0,2% entre 20 e incube las laminillas durante 24 horas a cuatro grados Celsius. Un baño de una hora en PBT con agitación suave es suficiente para lavar el anticuerpo secundario no unido.Luego contratiña el ADN con una solución de 10 microgramos por mililitro de yoduro de propidio en PBS. Deje que la tinción continúe durante 15 minutos y luego lave los portaobjetos con PBT mediante agitación suave durante 15 minutos a temperatura ambiente. Ahora monte los portaobjetos con un medio antidesvanecimiento suplementado con 10 microgramos por mililitro de yoduro de propidio.Después de dejar reposar durante una hora, obtener imágenes de los portaobjetos en un microscopio confocal utilizando una lente de inmersión en glicerol de 63 x. Durante la adquisición de imágenes, es fundamental mantener idénticos los parámetros de escaneo entre las muestras para permitir una cuantificación comparativa y utilizar un modo de detección lineal. Posteriormente, reconstruir las imágenes seriadas en estructuras tridimensionales, segmentar cada núcleo de interés y utilizar un software de procesamiento de imágenes 3D para cuantificar las señales.Mediante este protocolo robusto de preparación a gran escala, las preparaciones en montaje completo conservarán su estructura tridimensional. Las estructuras subcelulares se vuelven visibles con gran detalle, como se observa con la cromatina. Al teñir el ADN, la heterocromatina aparece como focos brillantes y bien definidos sin necesidad de aplicar deconvolución.Este protocolo permite la inmunotinción paralela con varios anticuerpos en una sola ronda. Por ejemplo, la marca permitida asociada a la cromatina U, la lisina cuatro trimetilada de la histona tres H3K4me3, y la marca asociada a la heterocromatina lisina 27 monometilada de la histona tres H3K27me1 fueron detectadas ambas en un mismo experimento sobre portaobjetos réplicas distintos para analizar la dinámica de la cromatina. Otra técnica compatible es la hibridación fluorescente in situ o FISH para el ARNr 45S.Se utilizaron repeticiones de ADN para definir regiones de organización nuclear. La sonda se marcó directamente con Alexa 488, y el ADN se contratinchó para el análisis de hibridación. Es muy importante probar diferentes diluciones del anticuerpo y tiempos de incubación para identificar las condiciones que produzcan una señal robusta y homogénea con el nivel más bajo posible de contracción del anticuerpo.Dado que este método logra una excelente preservación del tejido y una permeación óptima para el análisis de una sola célula de la organización de la cromatina, allana el camino para que los científicos en el campo de la biología celular vegetal o la epigenética vegetal investiguen la organización nuclear o subcelular a nivel de una sola célula y en todo el contexto del organismo.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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Un método eficaz para Cuantitativo, Análisis de celda única de la cromatina modificación y Arquitectura Nuclear en Todo el montaje en Óvulos Arabidopsis (Video) | JoVE Journal

Un método eficaz para Cuantitativo, Análisis de celda única de la cromatina modificación y Arquitectura Nuclear en Todo el montaje en Óvulos

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