Un método de permeabilización de Drosophila Los embriones para ensayos de moléculas pequeñas Actividad

El objetivo general del siguiente experimento es preparar embriones viables de Drosophila con una cáscara de huevo permeable para probar la bioactividad de fármacos o toxinas de moléculas pequeñas introducidas. Esto se logra tratando primero los embriones en etapa de desarrollo con lejía diluida para eliminar las capas externas de cáscara de huevo coriónica. El segundo paso es colocar los embriones con un disolvente que agote la fina capa cerosa de cáscara de huevo que bloquea los solutos de moléculas pequeñas.

El tercer paso es tratar los embriones con un fármaco o toxina y un colorante para medir simultáneamente la permeabilidad de la cáscara del huevo e introducir un compuesto de interés. Después de un mayor desarrollo, los embriones pueden ser fotografiados directamente o procesados para inmunohistoquímica. En última instancia, los resultados pueden mostrar la actividad de un fármaco o toxina en el desarrollo de los tejidos, determinada por microscopía fluorescente con reactivos inmunológicos o lazos vitales.

Hoy presentaré nuestro método de permeación de embriones de Drosophila para ensayos de actividad de moléculas pequeñas. Las principales ventajas de esta técnica frente a los métodos existentes son el uso de disolventes orgánicos convencionales como el heptano para la permea. La cáscara del huevo es que nuestro solvente de permeación embrionaria, o EPS, es absorbible por el agua y relativamente no tóxico.

Estas propiedades facilitan los tratamientos embrionarios, en los que la exposición a los disolventes puede controlarse con mayor precisión y puede llevarse a cabo en medios fisiológicamente relevantes, lo que da lugar a una mayor viabilidad embrionaria. La primera vez que tuve la idea de este método fue cuando contemplé cómo eliminar la capa cerosa de la cáscara de huevo. Siendo esquiador, reflexioné sobre el uso común del solvente cítrico para eliminar la cera residual de la base de los esquís.

Esto me impulsó a trasladar esta aplicación a la cáscara de huevo del embrión de mosca, y después de algunas pruebas y errores condujo a la resolución de la composición de EPS, Prepare jaulas de población con al menos 500 moscas en edad de apareamiento de las cepas deseadas. Las jaulas deben estar equipadas con jugo de uva de 10 centímetros. Airea con un poco de pasta de levadura.

Cambie estas placas dos veces al día. Después de unos días, las moscas serán condicionadas al cultivo y pondrán embriones con mayor regularidad. El EPS está hecho de tensioactivos y soluciones solventes limitantes y es bueno durante dos meses.

Cuando se almacenan a temperatura ambiente, caliente los tensioactivos a 37 grados centígrados cuando mezcle EPS fresco Para el tratamiento de EPS, los embriones se manipulan con cestas hechas de tres centímetros, por lo que el tubo de polipropileno de 50 mililitros y la malla de nailon se desbastan. Los bordes de plástico se funden en la malla más fácilmente durante los pasos posteriores de desarrollo. Los embriones también se manipulan con cestas hechas con tapas de tubos de 50 mililitros.

La tapa está perforada y con muescas, y la rosca entre la tapa y el tubo asegura la malla. Alternativamente, se utiliza una cámara de deslizamiento de máquina local y se prepara con una pieza permeable al oxígeno. Membrana asegurada sobre la abertura por un anillo de retención para recolectar los embriones.

Coloque un plato de uva fresca con pasta de levadura en el cultivo por la mañana. Después de una hora, cambie el plato y deseche el primer plato recogido. Deje que la segunda placa recoja los embriones durante dos horas a 25 grados centígrados.

Luego recoja el plato y transfiéralo a 18 grados centígrados. Permita que los embriones se desarrollen hasta la etapa deseada. Cuando los embriones estén listos, descúbralos antes del tratamiento con EPS.

Enjuáguelos del plato en la canasta de maceración con agua y el uso de un pincel. En segundo lugar, enjuáguelos con agua corriente suave para eliminar cualquier residuo. En tercer lugar, sumérjalos en lejía al 50% durante dos minutos con circulación periódica de la solución de lejía.

Luego enjuáguelos rápidamente con agua corriente. Ahora llene seis platos de 60 milímetros, cada uno con 10 mililitros de PBS para que funcionen como baños y haga una dilución de uno a 40 de EPS en MBIM para agitar la mezcla. Se formará una emulsión blanca, secará el exceso de agua del fondo de la cesta de malla con una toallita y sumergirá los embriones en la dilución de EPS con un movimiento de remolino constante.

Después de agitar los embriones en EPS durante 30 segundos, retírelos y seque el exceso de solución. A continuación, mueva la cesta entre los seis baños de PBS, rociando suavemente para enjuagar y continuar con el tratamiento con tinte y medicamentos. La optimización de la permeabilidad y la viabilidad es la parte más complicada de este protocolo.

La permeabilidad es sensible a la etapa de desarrollo del embrión. La temperatura a la que envejecen los embriones también puede variar ampliamente entre las cepas individuales de moscas. Los mejores parámetros para la dilución de EPS y el tiempo de exposición deben determinarse empíricamente.

Primero, prepare una solución de 50 micromolares de colorante de ácido carboxílico de ciencia ficción en M-B-I-M-T, un mililitro en un tubo de microficha es suficiente. En esta etapa se puede agregar una toxina o un medicamento para que el vórtice de los tratamientos agudos se mezcle. Transfiera los embriones de perme de la canasta al tubo de micro fuga con un pincel.

Tape el tubo e inviértalo varias veces. Luego cargue el tubo en un mutador y déjelo incubar durante 15 minutos. Una vez que los embriones se hayan asentado, retire el tinte con una pipeta y vuelva a agregar un mililitro de M-B-I-M-T para un lavado. Resus.

Suspenda los embriones, deje que se asienten y reemplace el M-B-I-M-T. Luego haga esto por tercera y cuarta vez. Una vez que se complete el cuarto lavado, retire todo el M-B-I-M-T y mueva los embriones a una canasta de desarrollo durante largos períodos de desarrollo.

Para la canasta de desarrollo, primero prepare la canasta con un enjuague de etanol al 70% y luego di agua, seque la sangre con una toallita de laboratorio. Cuando esté listo. A continuación, transfiera la cesta a un plato de 60 milímetros con seis mililitros de medio de incubación que contenga el fármaco o la toxina deseada.

Transfiera los embriones a la malla en la canasta con un pincel dejando caer suavemente el medio de incubación sobre ellos, disperse los embriones en una monocapa. Tenga cuidado de no atrapar burbujas de aire debajo de la malla. Para usar primero una cámara deslizante, prepare la cámara, invierta la cámara deslizante y coloque una fina gota de grasa para aspiradoras alrededor del borde de la abertura.

A continuación, 150 microlitros del medio deseado sobre la superficie de la membrana de oxígeno disuelto dentro de la abertura. Ahora, transfiera los embriones al medio con un pincel y distáprelos sobre la membrana. Termine aplicando un cubreobjetos circular de 25 milímetros aplanando el medio.

Aplique una ligera presión alrededor del perímetro para asegurar el sellado. Existe un efecto robusto de la cría de embriones a 18 grados centígrados en su capacidad para ser permeados por EPS y absorber el tinte en etapas tardías del desarrollo. Esto se ilustra por la ausencia de absorción de Rumine BD en embriones tratados con EPS criados a 25 grados Celsius, la absorción de colorante de ácido carboxílico de ciencia ficción que se ve aquí en rojo revela los diversos niveles de permeabilidad que se observan típicamente en los embriones tratados con EPS.

La distribución dinámica del colorante rojo lejano de ciencia ficción durante el desarrollo y su consolidación en la yema dentro del intestino desarrollado visto con autofluorescencia azul revelan un criterio utilizado para evaluar la viabilidad. El tinte de ciencia ficción también puede determinar la permeabilidad previa del embrión después de la fijación de formaldehído y la inmunotinción. Después de que los embriones de EPS fueron tratados con tinte de ciencia ficción y toxina de metilmercurio, se tiñen con Antifa dos visto en verde para etiquetar las neuronas motoras y anti E lab en rojo para etiquetar los cuerpos de las células neuronales.

El tinte de ciencia ficción es pseudo coloreado en azul. El metilmercurio tiene un efecto sobre el patrón de los cuerpos de las células de las neuronas cortonas marcadas por las flechas en los embriones de tratamiento de control. Estas neuronas tienen un orden fascial, dos que se muestran aquí en blanco ilustra la ramificación normal de las neuronas segmentarias en el tratamiento de control observado por las puntas de flecha.

En comparación, el tratamiento con metilmercurio cambia el patrón de ramificación marcado por las flechas verdes sólidas. La flecha verde hueca marca el lugar donde se desplazó la ramificación. Una vez dominado, los tratamientos de permeación embrionaria en esta técnica se pueden realizar en unos 30 o 40 minutos si se realiza correctamente.

Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la fijación y la inmunotinción de los embriones, para responder a preguntas adicionales, como qué tejidos específicos son el objetivo de un fármaco o una toxina durante el desarrollo. Le agradezco que haya observado este procedimiento y le deseo la mejor de las suertes al poner en práctica estos métodos en su laboratorio.