El estudio de ADN Looping por FRET sola molécula

Este estudio presenta un procedimiento experimental detallado para medir la dinámica de bucle de ADN de doble cadena utilizando una sola molécula de transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET). El protocolo también se describe cómo extraer la densidad de probabilidad de bucle llamado factor J.

El objetivo general del siguiente experimento es investigar cómo la dinámica de bucle del ADN bicatenario se ve afectada por la forma intrínseca del ADN sin el uso de proteínas de unión al ADN. Esto se logra mediante la incorporación de moléculas de colorante en fragmentos de ADN bicatenario de diferentes curvaturas para que el bucle de ADN pueda controlarse mediante resonancia de fluorescencia, transferencia de energía o traste. Los eventos de bucle reversible y bucle no reversible de las moléculas individuales de ADN se pueden observar mediante microscopía de reflexión interna total.

La velocidad de bucle del ADN se puede extrapolar a partir de las trayectorias temporales de la fluorescencia de cada molécula individual. En última instancia, se puede medir la probabilidad de bucle del ADN en relación con la forma intrínseca del fragmento. La principal ventaja de este ensayo de bucle de ADN es que no depende de la proteína de unión al ADN A, lo que podría afectar a la cinética de bucle del ADN A.

El protocolo simple consiste en utilizar una técnica llamada transferencia de energía por resonancia fluorescente y síntesis de ADN basada en PCR. Para medir la probabilidad de mirar del ADN, comience diseñando ADN curvado globalmente repitiendo una secuencia de 10 MER. Por ejemplo, esta secuencia representativa es un ADN curvo de 186 pares de bases, donde X es una base extra aleatoria y las secuencias que flanquean la secuencia repetida de 10 mers son secuencias adaptadoras.

A continuación, realice la PCR con los cebadores uno y dos con el rotulador donante de trastes SI tres marcando el cebador dos en el extremo de los cinco cebadores. A continuación, realice la PCR con los cebadores tres y cuatro con el marcador SCI cinco del aceptor de trastes a través de la columna vertebral y el enlazador de biotina en el extremo del cebador tres cinco. Después de purificar los productos de PCR con un kit de limpieza de PCR, mezcle los productos etiquetados con tres y cinco marcados con SCI en un tampón para el intercambio de hebras a concentraciones finales de 0,4 micromolares y 0,1 micromolares respectivamente.

A continuación, incubar las hebras a 98,5 grados centígrados durante dos minutos, enfriándose gradualmente a cinco grados centígrados con una tasa de rampa de 0,1 grados centígrados por segundo, y luego incubar a cinco grados centígrados durante dos horas. Para intercambiar las hebras para preparar la celda de flujo, use una taladradora y brocas de diamante para crear de seis a siete pares de agujeros a lo largo de los dos bordes opuestos de un portaobjetos de vidrio de tres pulgadas por una pulgada. Cuando se hayan perforado todos los agujeros, frote el portaobjetos con agua corriente para eliminar cualquier polvo de vidrio visible.

Coloque los portaobjetos en posición vertical en un frasco de vidrio y llénelo con agua destilada. Sonicar el frasco durante 15 minutos y luego transferir los portaobjetos a un frasco de vidrio dedicado a la limpieza con acetona. Llene el frasco con acetona y sonique los portaobjetos en acetona durante otros 15 minutos.

A continuación, rocíe los portaobjetos con etanol y luego con agua para enjuagarlos y luego transfiera los portaobjetos a un frasco de polipropileno. Llene el frasco de polipropileno con hidróxido de potasio de cinco molares y luego sonique los portaobjetos durante 15 minutos más después del último lavado, enjuague los portaobjetos en agua destilada, seguidos de otros 15 minutos. Sonicación luego después de limpiar los cubreobjetos.

De la misma manera, dispense 80 microlitros de solución PEG recién preparada en cada portaobjetos y luego baje suavemente un cubreobjetos sobre la clavija. Después de 45 minutos, use pinzas para quitar los portaobjetos de las cubiertas, enjuague los portaobjetos y las fundas con abundante agua destilada. Luego séquelos en un desecado cuando los cubreobjetos y los portaobjetos estén secos, coloque tiras delgadas de cinta adhesiva doble a través del portaobjetos para formar canales, una línea un deslizamiento de cubierta sobre las tiras y presione firmemente el cubreobjetos para formar canales herméticos a líquidos.

A continuación, utilice epoxi de cinco minutos para sellar los bordes de los canales y inmovilizar las moléculas para la microscopía. Primero, inyecte 15 microlitros de solución de neutro tradin en un canal. Después de dos minutos, enjuague el canal con 100 microlitros de tampón T 50 y luego inyecte 50 microlitros de muestra de ADN en el canal.

Después de cinco minutos, enjuague el ADN no unido con 100 microlitros de tampón T 50 y luego llene el canal con un tampón de imágenes que contenga el sistema de eliminación de oxígeno. Ahora coloque aceite de inmersión en el objetivo del microscopio y luego use clips de muestra para fijar la celda de flujo a la platina del microscopio. Encienda el láser de 532 nanómetros.

Utilice la vista en vivo de las imágenes fluorescentes en el monitor para refinar. Ajusta el enfoque. Comience la adquisición de datos con el láser de 532 nanómetros encendido.

Detenga la adquisición de datos cuando la mayoría de las moléculas se hayan fotoblanqueado para procesar y analizar las imágenes, utilice un script de MATLAB para examinar todas las trazas de tiempo de una sola molécula que muestren múltiples transiciones entre las señales de traste alto y bajo. Identifique los estados de bucle y desbucle y, a continuación, encuentre el umbral que separa las dos distribuciones determinando la intersección entre las dos curvas gaussianas ajustadas. A continuación, calcule la eficiencia del frente F dividiendo la intensidad de ciencia ficción por la suma de las intensidades de SCI tres y ciencia ficción.

Asignación de los estados de bucle con valores de traste altos y los estados de desbucle con valores de traste bajos. A continuación, utilizando un script de MATLAB, analice el número acumulado de moléculas o NFT que se reprodujeron en bucle, es decir, que alcanzaron el estado de traste alto en diferentes lapsos de tiempo. Desde el inicio de la adquisición de datos, la tasa de bucle K sub loop se puede extraer ajustando el NFT con una función exponencial.

Si NFT aumenta bi, básicamente se le puede equipar con una doble función exponencial como se ilustra en la ecuación. En este caso, a partir de esta ecuación se obtiene el subbucle K para determinar el flujo del factor J. 20 microlitros de 30 a 50 picaMolar biotina sci cinco oligo o cebador tres en uno de los canales recubiertos de travaína de nuez como se acaba de demostrar.

A continuación, enjuague el canal con 100 microlitros de T 50 para lavar los oligonucleótidos no unidos y, a continuación, fluya un tampón de imagen recién preparado suplementado con PS tres oligonucleótidos en la cámara. Mantenga encendido el láser de 532 nanómetros y luego encienda brevemente el láser de 640 nanómetros para identificar las ubicaciones de cualquier oligonucleótido de ciencia ficción unido a la superficie. Luego apague el láser de 640 nanómetros y comience a monitorear la señal del traste.

Utilice un script de MATLAB para analizar el número de moléculas que comienzan en el estado no unido. Es decir, con una intensidad baja de sci cinco, pero luego se convierte en el estado IL. Es decir, con una alta intensidad de ciencia ficción en función del tiempo de las trazas de intensidad de ciencia ficción que representan este número de moléculas de ane frente al tiempo, ajustando la curva con una sola función exponencial para obtener la tasa de ealing.

K sub anil, repita el experimento a diferentes concentraciones de SI tres oligonucleótidos para confirmar la linealidad entre la tasa de arrodillamiento y la concentración de reactivo. Extraiga el segundo orden de una constante de tasa de arrodillamiento K prime sub ail de la pendiente. Finalmente, calcule el factor J donde K sub loop es la tasa de bucle medida bajo las mismas condiciones de tampón para probar el efecto de la curvatura intrínseca del ADN bicatenario en el bucle.

En este experimento, un par de bases 186 recto y otro curvo. Se construyeron ADNs bicatenarios comparados con ADN puro. Se determinó que el ADN curvo producía más eventos de trastes altos durante el mismo período de tiempo.

El ADN curvo también se repitió cuatro veces más frecuentemente que el ADN recto durante el mismo tiempo de adquisición, lo que demuestra que la curvatura intrínseca del ADN puede afectar significativamente la dinámica del bucle. En este paso final del análisis, el factor J se calculó dividiendo la tasa de bucle por el primer orden, una constante de tasa de arrodillamiento, y se determinó que era de 61 más o menos tres nanomolares para el ADN recto y de 265 más o menos 48 nanomolares para el ADN de la curva, de acuerdo con los hallazgos anteriores. Siguiendo este procedimiento, se pueden estudiar los efectos del factor de accidente en la movilidad del bucle, como la temperatura, la deformación y la viscosidad.

Este protocolo será útil no solo para estudiar la física de polímeros del ADN, sino también para demostrar el poder de la fluorescencia de una sola molécula a estudiantes de investigación principiantes o al público lego.