Expresión recombinante de celulasa de Cel5A

El objetivo general del siguiente experimento consiste en expresar transitoriamente proteínas diana en tabaco para obtener una idea sobre la viabilidad de la expresión de enzimas basada en plantas en un corto período de tiempo. Esta expresión transitoria se logra infiltrando hojas de tabaco con una cepa de Agrobacterium tumefaciens, que contiene un vector que incorpora el gen de interés como segundo paso. Tras la incubación, se recolectan las hojas de la planta infiltradas y se obtienen extractos proteicos parcialmente purificados para conseguir una solución enzimática funcional. A continuación, se realiza un análisis proteico con el fin de evaluar los efectos de la expresión basada en plantas sobre la enzima y verificar su actividad enzimática.

Se obtienen resultados que muestran el tamaño de la proteína, posibles efectos de glicosilación y actividad enzimática basados en inmunoensayos tipo western, ensayos de actividad zimográficay de degradación de sustrato. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la conversión de biomasa vegetal y también puede proporcionar información sobre la actividad de enzimas tras su expresión transitoria en tabaco. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de infiltración son difíciles de aprender debido a que las hojas se dañan fácilmente con la jeringa, la ropa del manipulador y los experimentos se realizarán bajo condiciones estériles.

Transferir colonias individuales de agrobacterium a un matraz erlenmeyer que contenga 10 mililitros de caldo de extracto de levadura con antibióticos. A continuación, incubar el caldo inoculado durante 36 a 40 horas a 26 grados Celsius con agitación a 180 RPM. Después, inocule 200 microlitros de cada cultivo en 20 mililitros de caldo de extracto de levadura con los mismos antibióticos que antes e incube bajo las mismas condiciones durante 36 a 40 horas.

Induzca los cultivos con dos microlitros de acetofenona, 100 microlitros de solución de glucosa al 40 % y 200 microlitros de tampón MES uno molar a pH 5,6 y continúe incubando durante la noche. Ahora tome las plantas del invernadero y utilice la punta de una pipeta para hacer un pequeño corte en el lado axial AB de la tercera a la quinta hoja contando desde la parte superior de la planta para facilitar la infiltración. A continuación, llene una jeringa con medio de infiltración y colóquela en uno de los cortes previamente realizados.

Sostenga la jeringa con un dedo en el lado del lóbulo axilar e inyecte cuidadosamente el medio en la zona foliar intravenosa. Para visualizar la fluorescencia en las secciones foliares que expresan TR cell 5:00 AM cherry, ilumine las plantas con una fuente de luz portátil que emita luz verde. Al observarlas a través de un filtro rojo, la fluorescencia procedente de TR cell 5:00 AM cherry será claramente visible.

Para extraer las proteínas expresadas, seleccione hojas de tabaco que hayan sido infiltradas con AUM que contenga P track ERTR cell cinco A y córtelas en trozos de un gramo. A continuación, colóquelas en un mortero previamente enfriado y agregue una cantidad adecuada de nitrógeno líquido a las muestras. Muela las hojas hasta obtener un polvo usando un pistilo.

Repita el proceso con hojas de tabaco no infiltradas para obtener muestras control. Luego, agregue dos mililitros de PBS que contengan fluoruro de fenil metilsulfonilo de un milimolar al material vegetal molido y mezcle hasta que la mayor parte del material vegetal quede en suspensión. Centrifugue el extracto a 15.000 ×g durante 20 minutos a cuatro grados Celsius.

Luego deseche el precipitado, purifique parcialmente la célula TR cinco A incubando el sobrenadante que contiene proteína a 55 grados Celsius durante 10 minutos y déjelo reposar a temperatura ambiente durante otros 10 minutos. A continuación, centrifugue el sobrenadante a 15.000 ×g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Deseche el precipitado y utilice el sobrenadante que contiene proteína para todos los usos.

Ensayos adicionales. Realice también el proceso de purificación parcial con plantas no infiltradas para obtener muestras de control. En este procedimiento, mezcle etilcelulosa y agua para obtener una solución al 1,5% e incube con agitación hasta que se disuelva.

Para preparar el gel A-C-M-C-S-D-S, sustituya un mililitro de CMC al 1,5% por un mililitro de agua en una solución mezclada de gel SDS-PAGE de 10 mililitros y vierta el gel normalmente. A continuación, desnature las muestras hirviéndolas en presencia de SDS. Realice la electroforesis a 200 voltios durante 50 minutos hasta que el frente de colorante alcance la base del gel. Ahora realice el plegado de proteínas en gel sobre el gel SDS-PAGE con CMC al 0,15%.

Utilizando 1,5 % de beta ciclodextrina en tampón de citrato fosfato 20 milimolar a pH 6,5. Incube el gel en esta solución a temperatura ambiente con agitación suave durante 15 minutos. Deseche la solución de beta ciclodextrina y lave brevemente el gel con agua incubada a temperatura ambiente en tampón de acetato de sodio 50 milimolar a pH 4,8 durante otros 15 minutos.

Luego, realice la electroforesis CMC zy utilizando el gel de punto 15%C-M-C-S-D-S replegado, incubando el gel en tampón de acetato de sodio 30 milimolar durante 20 minutos a 50 grados Celsius. Para visualizar dónde se ha degradado el CMC, tiña el gel durante 10 minutos usando una solución de rojo Congo al 0,1% y deténgalo usando cloruro de sodio 1 molar durante 30 minutos o hasta que se observen bandas definidas; al final, lave el gel con ácido acético al 0,3%. Para obtener imágenes más nítidas inmediatamente antes de realizar el ensayo, prepare una solución de trabajo 4 MUC 2X y pipetee 100 microlitros de la solución de trabajo 4 MUC en pozos separados de una placa de 96 pozos.

Luego, agregue 100 microlitros de cada muestra en los pozos correspondientes, realizando cada muestra por triplicado, utilizando una longitud de onda de excitación de 360 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 465 nanómetros. Determine el punto de tiempo cero de cuatro mu de fluorescencia mediante espectroscopía de fluorescencia. A continuación, incube las placas cubiertas con tapas adhesivas a 50 grados Celsius durante 20 minutos.

Posteriormente, detenga la reacción mediante congelación. Después, mida la fluorescencia final de mu utilizando los mismos parámetros que para el punto temporal de cero minutos. Reste el valor de fluorescencia a cero minutos del valor de fluorescencia a 20 minutos para determinar el cambio en la fluorescencia causado por la actividad enzimática inmediatamente antes de realizar el ensayo.

Prepare la solución de trabajo A-O-C-M-C dos X. Luego, combine 50 microlitros de la muestra y 50 microlitros de la solución de trabajo en un tubo de 1,5 mililitros. A continuación, incube las muestras durante 20 minutos a 50 grados Celsius.

Detenga la reacción añadiendo 250 microlitros de solución precipitante. Posteriormente, vortex cada muestra vigorosamente durante 10 segundos para asegurar una mezcla completa de la muestra con la solución precipitante. A continuación, incube las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos y vortex nuevamente antes de centrifugarlas a 1000 Gs durante 10 minutos.

A continuación, transfiera 200 microlitros del SNAT de cada muestra a una placa de 96 pocillos sin perturbar el precipitado. La actividad enzimática del pellet se indica por niveles más altos de colorante solubilizado. Mida esto mediante espectroscopía de absorción a una longitud de onda de 590 nanómetros.

En este paso, coloque círculos de papel de filtro en tubos de 1,5 o dos mililitros. Añada 100 microlitros de acetato de sodio 60 milimolar y 100 microlitros de las muestras a los círculos de papel de filtro e incube durante 20 horas a 50 grados Celsius con agitación de 300 RPM.

Además, incubar las muestras individuales sin papel de filtro como controles inmediatamente antes de realizar el ensayo. Preparar una solución de trabajo de PABA 1,5 x conteniendo un mililitro de solución A de PBA y nueve mililitros de solución B de PABA. Conservar en hielo hasta su uso. A continuación, preparar las muestras en tubos térmicamente estables de 0,5 mililitros.

Las muestras están compuestas por 45 microlitros de agua, cinco microlitros de cada solución incubada con papel filtro y 100 microlitros de la solución de trabajo de PABA. A continuación, analice los controles de muestra y cinco patrones preparados de la misma manera. Luego, incube las muestras, controles y patrones exactamente durante 10 minutos a 100 grados Celsius y enfríe a temperatura ambiente durante otros 10 minutos.

Pipete 100 microlitros de la solución en una placa de 96 pocillos y realice un ensayo con un espectrofotómetro a una longitud de onda de 410 nanómetros. Reste los valores de control individuales de la muestra de los valores de la muestra de papel filtro para determinar la cantidad de azúcares reductores liberados. A continuación se muestra una imagen que representa los cassettes de expresión, así como la expresión proteica en plantas de tabaco.

Así es como se ve una hoja de tabaco infiltrada bajo luz normal y bajo luz verde con un filtro rojo, donde la expresión de TR célula T 5:00 AM cherry, indicada por el color rojo, es claramente visible aquí. La electroforesis SDS-PAGE, el inmunotransferencia y el zimograma CMC muestran el tamaño y la actividad de la célula T cinco A. Las proteínas solubles totales han sido separadas y podemos visualizarlas mediante tinción con azul de Comassie. El inmunotransferencia contra la región con etiqueta His de la célula T cinco A confirma el tamaño de la proteína, y adicionalmente, la actividad celulasasa frente a CMC se muestra mediante un zimograma teñido con rojo Congo. Lo que se observa aquí son las proteínas solubles totales provenientes de las hojas de la planta de tabaco donde la célula T cinco A fue expresada transitoriamente, antes y después de la purificación por precipitación térmica, en la que la célula T cinco A es la banda más grande visible y también es observable en el inmunotransferencia y en el zimograma CMC.

También observamos las proteínas solubles totales de plantas de tabaco en las que Tcell cinco A no se sometió a precipitación térmica, así como las proteínas de una mezcla comercialmente disponible de tresa celulasa. Esta figura muestra la cuantificación de la actividad enzimática de TR cell cinco A; TR cell cinco A se incubó con cuatro MUC Azo CMC o papel filtro, y la degradación del sustrato se midió mediante la liberación del fluoruro cuatro cuatro mu del colorante azo, o cuantificando los azúcares reductores a partir del cambio de color del PBA siguiendo este procedimiento. Otros métodos, como el direccionamiento proteico, pueden utilizarse para obtener información adicional sobre cómo la localización de la proteína puede afectar la estabilidad y actividad enzimática.

Después de ver este video, ahora debería tener una comprensión clara de cómo expresar transitoriamente proteínas en tabaco, así como algunos conocimientos sólidos sobre cómo evaluar la actividad enzimática. Para la conversión de biomasa de celulosa.