Expresión recombinante de celulasa de Cel5A Trichoderma reesei En plantas de tabaco

El objetivo general del siguiente experimento es expresar proteínas diana de forma transitoria en el tabaco para tener una idea de la viabilidad de la expresión de enzimas de origen vegetal en un corto período de tiempo. Esta expresión transitoria se logra infiltrando hojas de tabaco con una cepa de agrobacterium tumor fain, que contiene un vector que incorpora el gen de interés como segundo paso: Después de la incubación, las hojas de las plantas infiltradas se cosechan y los extractos de proteínas se purifican parcialmente para obtener una solución enzimática funcional. A continuación, se realiza un análisis de proteínas para evaluar los efectos de la expresión vegetal en la enzima y verificar su actividad enzimática.

Se obtienen resultados que muestran el tamaño de la proteína, los posibles efectos de la glicosilación y la actividad enzimática basada en ensayos de western bloting, zy y degradación del sustrato. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la conversión de biomasa vegetal y también puede proporcionar información sobre la actividad de las enzimas después de expresarse transitoriamente en el tabaco. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de infiltración son difíciles de aprender debido a que las hojas se dañan fácilmente con la jeringa.

Transfiera las colonias individuales de agrobacterium toan a un matraz erlenmeyer que contenga 10 mililitros. Caldo de extracto de levadura con antibióticos. A continuación, incubar el caldo inoculado durante 36 a 40 horas a 26 grados centígrados con agitación a 180 RPM, a continuación, inocular 200 microlitros de cada cultivo en 20 mililitros de caldo de extracto de levadura con los mismos antibióticos que antes e incubar en las mismas condiciones después de 36 a 40 horas.

Inducir los cultivos con dos microlitros de acetofenona, 100 microlitros de solución de glucosa al 40% y 200 microlitros de un tampón MES molar a pH 5,6 y continuar incubando durante la noche. Ahora tome las plantas del invernadero y use una punta de pipeta para cortar el lado axial AB de la tercera a la quinta hoja desde la parte superior de la planta para facilitar la infiltración. A continuación, llene una jeringa con medio de infiltración y colóquela sobre una de las muescas previamente hechas.

Sostenga la jeringa con un dedo en el lado de la hoja axio e inyecte el medio con cuidado en la zona de la hoja intravenosa. Para visualizar la fluorescencia en las secciones de las hojas que expresan la celda TR 5:00 AM cerezo, haga brillar las plantas con una fuente de luz portátil que emite luz verde. Cuando se ve a través de un filtro rojo, la fluorescencia de la celda TR 5:00 AM cereza será claramente visible.

Para extraer las proteínas expresadas, seleccione hojas de tabaco que hayan sido infiltradas con AUM que contengan P track ERTR célula cinco A y córtelas en trozos de un gramo. A continuación, colóquelos en un mortero preenfriado y añada una cantidad adecuada de nitrógeno líquido a las muestras. Muele las hojas hasta convertirlas en polvo con un mortero.

Repetir el proceso con hojas de tabaco no infiltradas para obtener muestras de control. Luego agregue dos mililitros de PBS que contengan un milimolar de fluoruro de fenil metil suen a la materia de la hoja molida y mezcle hasta que la mayor parte de la materia de la hoja esté en suspensión. Centrifugar el extracto a 15.000 GS durante 20 minutos a cuatro grados centígrados.

A continuación, deseche el pellet, la célula TR cinco A parcialmente purificada incubando la proteína que contiene S natin a 55 grados centígrados durante 10 minutos y déjela reposar a temperatura ambiente durante otros 10 minutos. A continuación, centrifugar un SNAT a 15.000 GS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Deseche el pellet y use la proteína que contiene snat para todos.

Ensayos adicionales. También realizar el proceso de purificación parcial de plantas no infiltradas para la obtención de muestras de control. En este procedimiento, mezcle etilcelulosa y agua para obtener una solución al 1,5% e incube agitando hasta que se disuelva.

Para hacer gel de página A-C-M-C-S-D-S, sustituya un mililitro de CMC al 1,5% por un mililitro de agua en una solución de mezcla de gel de página SDS de 10 mililitros y vierta el gel normalmente a continuación, desnaturalice las muestras hirviéndolas en presencia de SDS. Realice la electroforesis a 200 voltios durante 50 minutos hasta que el frente del tinte llegue al fondo del gel. Ahora realizar en gel de repliegue de proteínas en el punto 15%C-M-C-S-D-S página de gel.

Utilizando ciclodextrina beta al 1,5% en tampón de citrato de fosfato de 20 milimolares a pH 6,5. Incubar el gel en esta solución a temperatura ambiente agitando suavemente durante 15 minutos. Deseche la solución de beta ciclodextrina y lave brevemente el gel con agua incubada a temperatura ambiente en tampón de acetato de sodio de 50 milimolares a pH 4.8 durante otros 15 minutos.

A continuación, realice CMC zy utilizando el gel de página 15%C-M-C-S-D-S de punto redoblado incubando el gel en tampón de acetato de sodio de 30 milimolares durante 20 minutos a 50 grados centígrados. Para visualizar dónde se ha degradado la CMC, tiña el gel durante 10 minutos con una solución de rojo Congo al 0,1% y detenlo con un molar de cloruro de sodio durante 30 minutos o hasta que se observen bandas claras al final, lava el gel con ácido acético al 0,3%. Para obtener imágenes más claras inmediatamente antes de ejecutar el ensayo, prepare una pipeta de solución de trabajo de cuatro MUC dos X, 100 microlitros de solución de trabajo de cuatro MUC en pocillos separados de una placa de 96 pocillos.

A continuación, añada 100 microlitros de cada muestra en los pocillos apropiados, ejecutando cada muestra por triplicado utilizando una longitud de onda de excitación de 360 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 465 nanómetros. Determine el punto de tiempo de minuto cero de la fluorescencia de cuatro mu a través de espectroscopia fluorescente. A continuación, incuba las placas cubiertas con tapas adhesivas a 50 grados centígrados durante 20 minutos.

Posteriormente, detenga la reacción congelando. Después de eso, mida la fluorescencia mu del punto final utilizando los mismos parámetros que para el punto de tiempo de cero minutos. Reste el valor de fluorescencia a cero minutos del valor de fluorescencia a los 20 minutos para determinar el cambio en la fluorescencia causado por la actividad enzimática inmediatamente antes de ejecutar el ensayo.

Prepare la solución de trabajo A-O-C-M-C two X. A continuación, combine 50 microlitros de la muestra y 50 microlitros de la solución de trabajo en un tubo de 1,5 mililitros. A continuación, incube las muestras durante 20 minutos a 50 grados centígrados.

Detenga la reacción agregando 250 microlitros de solución de precipitación. Posteriormente, agite cada muestra vigorosamente durante 10 segundos para asegurar la mezcla completa de la muestra con la solución de precipitación. A continuación, incubar las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos y volver a vórtelas antes de centrifugarlas a 1000 Gs durante 10 minutos.

Después de eso, transfiera 200 microlitros del SNAT de cada muestra a una placa de 96 pocillos sin alterar. La actividad enzimática de los pellets se muestra por niveles más altos de colorante solubilizado. Mida esto usando espectroscopía absorbente a una longitud de onda de 590 nanómetros.

En este paso. Coloca círculos de papel de filtro en tubos de 1,5 o dos mililitros. Agregue 100 microlitros de acetato de sodio de 60 milimolares y 100 microlitros de muestras a los círculos de papel de filtro e incube durante 20 horas a 50 grados centígrados con agitación a 300 RPM.

Además, incube las muestras individuales sin papel de filtro como controles inmediatamente antes de realizar el ensayo. Prepare una solución de trabajo de 1,5 x PABA que contenga un mililitro de solución A de PBA y nueve mililitros de solución de PABA B.Store en hielo hasta su uso. A continuación, prepare las muestras en tubos termoestables de 0,5 mililitros.

Las muestras están compuestas por 45 microlitros de agua, cinco microlitros de cada solución incubada con papel de filtro y 100 microlitros de solución de trabajo PABA. Después de eso, ejecute los controles de muestra y cinco estándares preparados de la misma manera. A continuación, incubar las muestras, los controles y los patrones durante exactamente 10 minutos a 100 grados centígrados y enfriar a temperatura ambiente durante otros 10 minutos.

Pipetear 100 microlitros de la solución en una placa de 96 pocillos un ensayo con un espectrofotómetro a una longitud de onda de 410 nanómetros. Reste los valores de control de muestra individuales de los valores de muestra de papel de filtro para determinar la cantidad de azúcares reductores liberados. Aquí hay una imagen que muestra la expresión de casetes, así como la expresión de proteínas en plantas de tabaco.

Así es como aparece una hoja de tabaco infiltrada bajo luz normal y bajo luz verde con un filtro rojo donde la expresión de la celda TR 5:00 AM cereza indicada por el color rojo es claramente visible aquí. La página SDS gel western lot y CMC zy que muestran el tamaño y la actividad de la célula T cinco A. Las proteínas solubles totales se han separado y podemos visualizarlas con tinción con azul de kumasi, Western blot contra la región de la etiqueta hist de la célula T cinco A confirma el tamaño de la proteína y, además, la actividad de la celulasa contra CMC se muestra mediante un xenoinjerto teñido con rojo Congo. Lo que se puede ver aquí es el total de proteínas solubles de las hojas de la planta de tabaco donde la célula TR cinco A se expresó transitoriamente antes y después de la purificación por precipitación térmica, donde la celda TR cinco A es la banda visible más grande y también es visible en el lote occidental y en el ígrafo de CMCs.

También vemos el total de proteínas solubles de las plantas de tabaco donde la Tcell cinco A no estaba también después de la precipitación térmica y las proteínas de una mezcla comercialmente disponible de tresa celulasa. En esta figura se muestra la cuantificación de la actividad enzimática de la célula TR cinco A, la célula TR cinco A se incubó con cuatro MUC Azo CMC o papel de filtro, y la degradación del sustrato se midió mediante la liberación del fluoro cuatro cuatro mu el colorante azoico, o mediante la cuantificación de los azúcares reductores del cambio de color del PBA Siguiendo este procedimiento. Otros métodos, como la segmentación de proteínas, pueden utilizarse para proporcionar información adicional sobre cómo la localización de las proteínas puede afectar a la estabilidad y la actividad de la enzima.

Después de haber visto este video, ahora debería tener una comprensión clara de cómo expresar proteínas transitoriamente en el tabaco, así como un buen conocimiento sobre cómo evaluar la actividad enzimática. Foro de conversión de biomasa de celulosa.