Name: Estabilizar hepatocelular Fenotipo Usando superficies sintéticas optimizadas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Aprende a optimizar superficies recubiertas con polímero PU 1 3 4 para cultivar hepatocitos derivados de células madre. Este método mejora la adhesión celular y la viabilidad a largo plazo mediante técnicas de recubrimiento por centrifugación y esterilización gamma.

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DCH, MB y FK fueron apoyados por un seguimiento EPSRC el Fondo. BL-V y DS fueron cada apoyados por becas de doctorado MRC. KC fue apoyado por la financiación de la Plataforma de Medicina Regenerativa del Reino Unido.

1 Síntesis de PHNGAD (Poli [1,6-hexanodiol / neopentil glicol / di (etilenglicol)-ácido adípico -alt] diol) <img alt="Esquema 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723scheme1.jpg" width="500" /> Esquema 1: Síntesis de PHNAGD Representación esquemática de la síntesis de PHNAGD.. PHNAGD se preparó por la reacción de 1,6-Hexanodiol, dietilenglicol, neoppentyl y ácido adípico. PHNAGD, Poly [1,6-hexanodiol / neopentil glicol / di (etilenglicol)-ácido adípico -alt] diol. <ol><li> Aplicar un tratamiento térmico a los monómeros de 1,6-hexanodiol, di (etilenglicol) y neopentilglicol a 40 ° C durante 48 horas en un horno de vacío para eliminar el agua residual. Permitir al frío a temperatura ambiente bajo vacío. </li><li> Añadir 22 mmol de cada monómero y ácido adípico (55 mmol) a un matraz de fondo redondo de dos bocas, equipado con una barra de agitación y conectado a un aparato de Dean-Stark. </li><li> Coloque todo el conjunto bajo un vacío y calentar suavemente el glassware a 40 ° C durante 6 horas, con el fin de evitar cualquier absorción de humedad durante la adición de la sustancia química en el matraz. </li><li> Añadir medio de una jeringa, gota a gota, 0,0055 mol del catalizador de titanio (IV) butóxido de potasio. </li><li> Se agita la mezcla de reacción a 180 ° C, bajo una atmósfera de N2 durante 24 horas, y recoger el agua residual en la trampa Dean-Stark. Deje que el producto se enfríe a temperatura ambiente. </li></ol> 2 Síntesis de PU134 <img alt="Esquema 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723scheme2.jpg" width="500" /> Esquema 2: Síntesis de PU134 Representación esquemática de la síntesis de poliuretano 134. PU134 se preparó por la reacción de 1,0 equivalentes de un PHNGAD con 2,0 equiv de un 4,4 &#39;-metilenbis (isocianato de fenilo), seguido por la adición de 1,0. equiv de un extensor de cadena de 1,4-butanodiol. <ol><li> Mezclar un equivalente de la PHNGAD poliol (Mn ~ 1800 Da, 3,2 mmol) con dos equivalentes de 4&#39;4-metilenbis (isocianato de fenilo) (6,4 mmol) en N, N-dimetilformamida (12 ml). </li><li> Se agita la mezcla de reacción a 70 ° C, bajo una atmósfera de N2. </li><li> Añadir medio de una jeringa, gota a gota el catalizador de titanio (IV) butóxido de potasio (0,8% en peso). </li><li> Después de 1 hora, añadir un equivalente del prolongador de cadena de 1,4-butanodiol (3,2 mmol). Aumentar la temperatura a 90 ° C y se agita durante 24 h bajo una atmósfera de N2. </li><li> Después de la reacción, recoger el poliuretano por precipitación por adición de éter dietílico (hexano o el agua también podría ser utilizado) gota a gota a la solución de reacción hasta que se produce la precipitación. </li><li> Centrifugar la solución a 5.300 xg durante 5 min. </li><li> Decantar el sobrenadante y secar a 40 ° C en un horno de vacío hasta que el disolvente se evapora. Nota: Con el fin de garantizar que el producto final de la reacción poseen los parámetros correctos con respecto a la distribución de peso molecular, los principales grupos funcionalesps del polímero, y las temperaturas de fusión y de transición vítrea, diversas técnicas y métodos de análisis se puede utilizar, tal como cromatografía de permeación en gel o espectroscopia FITR. </li></ol> 3 Preparación de Soluciones PU134 <ol><li> Pesar 200 mg de PU134 en una botella de vidrio. </li><li> Diluir PU134 a una concentración final de 2% en una serie de disolventes: cloroformo, una combinación de cloroformo y tolueno en proporción 1: 1, tetrahidrofurano, y la combinación de tetrahidrofurano y diclorometano en proporción 1: 1. Nota: La elección del disolvente adecuado varía dependiendo del polímero de usar. Diferentes disolventes poseen diferentes puntos de ebullición que pueden afectar a la solubilización del polímero. </li><li> Agitar la solución vigorosamente durante 20 min a temperatura ambiente usando un agitador a una velocidad de 200 mot / min, hasta que la solución se vuelve homogénea y se observó ningún precipitado. </li></ol> 4. revestimiento de cristal diapositivas con PU134 <ol><li> Coloque un round 15 mm 2 cubreobjetos en la recubridora de rotación. </li><li> Aplique 50 l de la solución PU134 a cada uno usando una pipeta. Ajustar el volumen de la solución PU134 en consecuencia para el tamaño requerido cubreobjetos manteniendo el volumen a la superficie relación proporcional. </li><li> Haga girar cada cubreobjetos de 7 segundos a 23 x g. </li><li> Aire cubreobjetos seco a temperatura ambiente durante al menos 24 horas antes de la esterilización. </li></ol> 5. irradiación de Cubreobjetos <ol><li> Gamma-irradiar cubreobjetos recubiertos de polímero mediante la aplicación de una dosis de 10 Grays usando un irradiador de laboratorio durante 12 min. </li><li> UV irradiar polímero recubierto cubreobjetos usando una 30 W, lámpara de rayos UV durante 16 minutos cada lado. </li><li> Coloque el cubreobjetos recubierto de polímero en una placa de cultivo tisular adecuado de acuerdo con el tamaño de diapositiva. </li></ol> 6. Microscopía Electrónica de Barrido <ol><li> Oro escudo cubreobjetos polímero mediante pulverización catódica de 200 seg en una atmósfera de 5 x 10 -1 milibares de presión. </li><li> Capturar la micrographs del cubreobjetos recubierto con polímero utilizando un microscopio electrónico de barrido a un voltaje de aceleración de 20 kV en modo de imagen de electrones secundarios. </li></ol> 7. Observaciones Microscopía de Fuerza Atómica <ol><li> Analiza un área de 20 x 20 m de la superficie del polímero. </li><li> Establecer una velocidad de barrido de 1,32 Hz a 1,60 Hz. </li><li> Configurar una resolución de 512 x 512 píxeles en la región explorada. </li><li> Calcula la raíz cuadrada media (RMS o Rq) del recubrimiento mediante el uso de la media de desviaciones de altitud tomadas del plano medio de datos de imagen, expresado como: <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51723/51723eq1.jpg" width="123" /> Cuando Zi es el valor actual Z, y N es el número de puntos dentro del área determinada. </li><li> 7.5 Se calcula la desviación o la media de rugosidad superficial (Ra) de la imagen utilizando, <img fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723eq2.jpg" width="154" /> Cuando Z (x) es la función que describe tque la superficie del perfil se analiza en términos de altura (Z) y la posición (x) de la muestra sobre la longitud de evaluación &quot;L&quot;. Ra representa el valor medio de la superficie con respecto al plano central. </li></ol> 8. Cultivo Celular y Diferenciación <ol><li> Cultura y diferenciar lo humano línea de células madre embrionarias (células madre) H9 como se describe en Hay 17. </li><li> Separar las células usando un reactivo de disociación y replate ellos en PU134 portaobjetos recubiertos en el Día 9 del proceso de diferenciación, en presencia de un medio libre de suero como se describe en Szkolnicka 18,19. Nota: Se prefiere el uso de una disociación celular enzimática para el desprendimiento de células físico. </li></ol> 9. citocromo P450 ensayo funcional <ol><li> Medir la actividad de CYP3A, siguiendo las instrucciones del fabricante. </li><li> Incubar hepatocitos derivados de células madre en el Día 13 o día 19, y medios sin células - como control negativo, con el substr apropiadacomió durante 5 horas a 37 ° C. </li><li> Recoger los sobrenadantes de las células y los medios de comunicación, llevar a cabo el ensayo según las instrucciones del fabricante. </li><li> Medir el nivel de actividad de CYP y relativa normalizada para el área de superficie (cm 2). </li></ol> 10. Inmunoticción <ol><li> Lave hESC deriva hepatocitos con PBS, durante 1 min, repita dos veces. </li><li> Añadir hielo frío metanol al 100% para fijar las células, en lugar de -20 ° C durante 10 min. </li><li> Lavar las células con PBS durante 5 min y repetir dos veces. </li><li> Se incuban las células con PBS / T (0,1% de Tween) / 10% de BSA durante 1 hora a RT. </li><li> Aspirar la solución PBST y añadir el anticuerpo primario apropiado diluido en PBS / T (0,1% de Tween) / 1% de BSA, se incuba a 4 ° C con suave agitación O / N. </li><li> Lavar las células con PBS / T (0,1% de Tween) / BSA al 1% durante 5 min y repetir tres veces. </li><li> Diluir el anticuerpo apropiado en PBS / T (0,1% de Tween) / 1% de BSA, añadir a las células y se incuba en la oscuridad a RT durante 1 h con agitación suave. </li><li> Lavar las células con PBS durante 5 min y repetir tres veces. </li><li> Añadir MOWIOL 488 (que contiene DAPI 1: 1.000) a cada pocillo, añadir un cubreobjetos con cuidado para reducir el número de burbujas de aire. Tienda células fija a 4 ° C en la oscuridad. Observe tinción utilizando un microscopio con un filtro adecuado y la lámpara fluorescente. Los anticuerpos primarios y secundarios optimizados se enumeran en la Tabla 1. </li></ol>

<ol><li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation+of+HNF4%CE%B1+regulates+protein+stability+and+hepatocyte+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">SUMOylation of HNF4α regulates protein stability and hepatocyte function.</a> J Cell Sci. 125 (15), 3630-3635 (2012).</li>
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<li>Rosu, L., Cascaval, C. N., Ciobanu, C., Rosu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+UV+radiation+on+the+semi-interpenetrating+polymer+networks+based+on+polyurethane+and+epoxy+maleate+of+bisphenol+A%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobilogy+A%3A+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of UV radiation on the semi-interpenetrating polymer networks based on polyurethane and epoxy maleate of bisphenol A.</a> Journal of Photochemistry and Photobilogy A: Chemistry. 169 (2), 177-185 (2005).</li>
<li>Yang, X. F., Tallman, D. E., Bierwagen, G. P., Croll, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blistering+and+degradation+of+polyurethane+coatings+under+different+accelerated+weathering+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Degradation+and+Stability%22%5BJournal%5D)">Blistering and degradation of polyurethane coatings under different accelerated weathering tests.</a> Polymer Degradation and Stability. 77 (1), 103-109 (2002).</li>
</ol>

DCH es CSO, Director, fundador y accionista de FibromEd Products Ltd. MB y JPI son accionistas fundadores en FibromEd Products Ltd.

Muchos de los métodos actuales utilizados para generar hepatocitos a partir de células madre se basan en matrices indefinidos de origen animal. Estos sustratos pueden ser costosos y altamente variable, que afecta a la función celular y la estabilidad, lo que representa una barrera significativa a la aplicación. Por lo tanto, se realizó una pantalla para materiales sintéticos que apoyan la cultura de células madre de hepatocitos derivados. Hemos identificado, un poliuretano sencilla (PU134), formado por la polimerización...

Los materiales biológicos han sido ampliamente utilizados en el mantenimiento y diferenciación de células madre pluripotentes 1. Al tiempo que permite, estos sustratos biológicos a menudo contienen una gran cantidad de componentes no definidos. Matrigel es un sustrato comúnmente utilizado para el cultivo de células madre y la diferenciación. Desafortunadamente, su composición variable influye en la función celular y el fenotipo. Aunque una variedad de matrices biológicas alternativas, más definidos se han utilizado 2-7, su origen animal o pobre escalabilidad les hace candidatos inadecuados para la fabricación industrial. Por lo tanto, la identificación de alternativas sintéticas, con composición definida y un rendimiento fiable, son objetivos clave en la investigación de células madre. En un intento de superar las limitaciones de los sustratos de cultivo de células definidos, colaboraciones interdisciplinarios entre la química y la biología han identificado materiales sintéticos con la capacidad de soportar el fenotipo celular. Synthsustratos etic son escalables, rentables, y se pueden fabricar en complejas estructuras 3D, imitando el entorno en vivo. Debido a estas propiedades sustratos sintéticos han sido ampliamente utilizados para apoyar y conducir la diferenciación de muchos tipos de células 8-10. Ensayos avanzados y de alto rendimiento han facilitado la rápida detección de los materiales sintéticos, de grandes bibliotecas, y entregado nuevos materiales con propiedades flexibles con amplias aplicaciones en la investigación y el desarrollo 11-13 biomédica. La utilización de un alto rendimiento, tecnología de tramado polímero micro-array, identificamos rápidamente en un sencillo de poliuretano (PU134), adecuado para el mantenimiento de los hepatocitos derivados de células madre humanas. Este polímero se encontró que era superior a sustratos derivados de animales con respecto a la diferenciación y la función de los hepatocitos 14-16. Hemos optimizado posteriormente el proceso de condiciones de recubrimiento, la topografía y la esterilización para acceder a efectosen el rendimiento del polímero en la estabilización de función de los hepatocitos y la vida útil. Esto tiene implicaciones significativas en cuanto a la comprensión de los fundamentos de la biología de los hepatocitos para el modelado basado en células y aplicaciones de medicina regenerativa. La tecnología aquí descrita representa un ejemplo de cómo la superficie de un polímero sintético puede ser optimizado para preservar el fenotipo celular. Creemos que la combinación de esta tecnología con un protocolo de diferenciación de hepatocitos sin suero eficiente tiene el potencial de proporcionar una producción escalable de hepatocitos para su uso en modelado in vitro y la medicina regenerativa.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Síntesis, preparación, recubrimiento y caracterización de cubreobjetos recubiertos de polímero PU134</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Edmun B&uuml; Irradiador</td><td>hler KS-15</td><td></td></tr><tr><td></td><td>CIS Biointernational</td><td>IBL 637&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sistema</td> de <td>recubrimiento especial</td><td>P-6708</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de barrido&nbsp;</td><td>Microscopio</td> de fuerza atómica <td>Philips XL30CPSEM</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DimensionV Nanoscopio, VEECO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p4-GLO CYP3A4</td><td>Promega</td><td>V8902</td><td></td></tr><tr><td>Bombilla UV</td><td>ESCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoScope software de análisis</td><td>VEECO</td><td></td><td>versión 1.20</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>Olympus</td><td>TH45200</td><td>utilizar el software Volocity 4</td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos Corning</td><td>, Reino Unido&nbsp;</td><td>3527</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos de vidrio</td><td>Suministros de laboratorio científico</td><td>MIC3308</td><td></td></tr><tr><td>dietilenglicol</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>93171</td><td></td></tr><tr><td>1,6-hexanodiol</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>240117</td><td></td></tr><tr><td>Neopentilglicol</td><td>Sigma &ndash; Aldrich</td><td>408255</td><td></td></tr><tr><td>Ácido adípico</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>9582</td><td></td></tr><tr><td>anhidro N,N-Dimetilformamida</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>Éter dietílico</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>676845</td><td></td></tr><tr><td>butóxido de titanio (IV)&nbsp;</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>244112</td><td></td></tr><tr><td>1,4-butanodiol&nbsp;</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>493732</td><td></td></tr><tr><td>Horno de vacío</td><td>Thermoscientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4,4'-Methylenbis(isocianato de fenilo)</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>101688</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>Barnizadora de pulverización catódica</td><td>Bal-Tec SCD 050</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Immunostaining</td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2)</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td>Store a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>PBST, PBS compuesto por 0.1% TWEEN 20&nbsp;</td><td>&nbsp; Suministros de laboratorio científico Ltd</td><td>EC607 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>&nbsp; Scientific Laboratory Supplies Ltd</td><td>CHE5010</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich, Reino Unido</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>MOWIOL 488 DAPI</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td>Hecho en Tris HCl y glicerol según las instrucciones</td></tr><tr> del fabricante<td colspan="4">Cell culture and Functional assay</td></tr><tr><td>CYP3A activity pGLO kit</td><td>Promega</td><td>V8902</td><td></td></tr><tr><td>Hepatozyme</td><td>Gibco</td><td>17705021</td><td></td></tr><tr><td>TryLE expresan</td><td>Life Technologies</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12604013">12604013</a></td><td></td></tr></tbody></table>

estabilizar hepatocelular fenotipo usando superficies sintéticas optimizadas

Stabilizing Hepatocellular Phenotype Using Optimized Synthetic Surfaces

Actualmente, una de las principales limitaciones en biología celular es mantener el fenotipo celular diferenciado. Las matrices biológicas se utilizan comúnmente para cultivar y mantener hepatocitos derivados de células madre primarias y pluripotentes. Si bien las matrices biológicas son útiles, permiten el cultivo a corto plazo de hepatocitos, lo que limita su aplicación generalizada. Hemos intentado superar las limitaciones utilizando un recubrimiento de polímero sintético. Los polímeros representan una de las clases más amplias de biomateriales y poseen una amplia gama de propiedades mecánicas, físicas y químicas, que se pueden ajustar para su propósito. Es importante destacar que dichos materiales se pueden escalar a estándares de calidad garantizada y mostrar la consistencia de un lote a otro. Esto es esencial si las células se van a expandir para el cribado de alto rendimiento en la industria de pruebas farmacéuticas o para la terapia basada en células. Los poliuretanos (PU) son un grupo de materiales que se han mostrado prometedores en el cultivo celular. Se presentan y discuten nuestros recientes avances en la optimización de una superficie recubierta de poliuretano para el cultivo a largo plazo de hepatocitos humanos que muestran un fenotipo estable.

Disolvente de polímero influye en la topografía de la superficie del polímero recubierto Poliuretano 134 se solubilizó en cloroformo, ya sea solo o en combinación con tolueno o tetrahidrofurano o diclorometano y los portaobjetos de vidrio mediante revestimiento por centrifugación con las diferentes formulaciones. Microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía de fuerza atómica (AFM) se utilizaron para caracterizar las propiedades físicas de los revestimientos de polí...

Este artículo se centrará en el desarrollo de superficies de polímero recubierto de largo plazo, la cultura estable de células madre derivadas de hepatocitos humanos.

Estabilizar hepatocelular Fenotipo Usando superficies sintéticas optimizadas

Currently, one of the major limitations in cell biology is maintaining differentiated cell phenotype. Biological matrices are commonly used for culturing ...

El objetivo general de este procedimiento es optimizar superficies recubiertas con polímeros para preservar el cultivo estable a largo plazo de hepatocitos humanos derivados de células madre. Esto se logra primero sintetizando poliuretano 1 3 4 o PU 1 3 4. El segundo paso consiste en elegir el disolvente adecuado para solubilizar PU 1 34.A continuación, se optimiza el proceso de recubrimiento por centrifugación con el PU 1 3 4 sobre la cubreobjetos de vidrio. El paso final consiste en la optimización del procedimiento de esterilización de las cubreobjetos de vidrio recubiertas con el polímero P 1 34, seguido finalmente de microscopía electrónica de barrido, microscopía de fuerza atómica y metabolismo de fármacos. Se utilizan ensayos para mostrar la influencia del recubrimiento con el polímero PU 1 34 en la función de los hepatocitos derivados de células madre.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como el uso de matrices en cultivo para mantener células madre potentes con características de hepatocitos, es que estos materiales sintéticos pueden ajustarse finamente según el propósito y escalarse según normas de calidad asegurada. Además, presentan una consistencia entre lotes. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de enfermedades hepáticas, ya que representan un ejemplo de cómo la superficie de un polímero sintético puede optimizarse para preservar el fenotipo celular.El procedimiento será demostrado por el Dr. Jeffrey Walton, un postdoctorado de mi laboratorio. Antes de comenzar este procedimiento, aplique un tratamiento térmico al mono-1,6-hexanodiol, dial dietilenglicol y neopentilglicol a 40 grados Celsius durante 48 horas en un horno al vacío para eliminar cualquier agua residual. Añada 22 milimoles de cada monómero y 55 milimoles de un ácido dpic a un matraz redondo de dos bocas conectado a un aparato de Dean-Stark y equipado con una barra de agitación magnética.A continuación, coloque todo el conjunto bajo vacío y caliente suavemente el material de vidrio a 40 grados Celsius durante seis horas para evitar cualquier absorción de humedad durante la adición del reactivo químico al matraz. Después de retirar el conjunto del horno y colocar el sistema bajo nitrógeno, añada 0,0055 moles del catalizador titanio cuatro, pero óxido, gota a gota mediante una jeringa al matraz. Agite la mezcla de reacción a 180 grados Celsius durante 24 horas, recolectando el agua residual en el trampa de Dean-Stark.Deje que el producto se enfríe a temperatura ambiente. A continuación, mezcle 3,2 milimoles, o un equivalente del poliol P-H-N-G-A-G, con 6,4 milimoles o dos equivalentes de 4,4'-metileno-bisfenil isotiocianato, en 12 mililitros de DML anhidro, en un matraz redondo de dos bocas conectado a un aparato Dean-Stark y equipado con una barra de agitación magnética.Agite la mezcla de reacción a 70 grados Celsius bajo una atmósfera de nitrógeno. Luego, añada el catalizador dióxido de titanio gota a gota mediante una jeringa hasta una concentración final del 0,8 %. Después de una hora, agregue un equivalente del extensor de cadena 1,4-butanodiol para obtener el producto de copolímero. Eleve la temperatura a 90 grados Celsius y mantenga la reacción durante 24 horas bajo una atmósfera de nitrógeno.Una vez que la mezcla de reacción haya enfriado a temperatura ambiente, añada éter dal gota a gota a la mezcla de reacción hasta observar la precipitación del producto de poliuretano. Después de transferir la mezcla de reacción a un tubo de centrífuga, centrifugue la solución a 5.300 ×g durante cinco minutos. Tras decantar, seque el sobrenadante a temperatura ambiente hasta que el disolvente se evapore.Opere a continuación pesando 200 miligramos de PU 1 34 en un frasco de vidrio. Diluya la muestra hasta una concentración final del 2% en cloroformo o en una mezcla de cloroformo y tolueno en una proporción uno a uno, o en tetra roran o una combinación de tetra roran y cloro metano, también en una proporción uno a uno. Agite la solución vigorosamente durante 20 minutos a temperatura ambiente utilizando un agitador a una velocidad de 200 movimientos por minuto, hasta que la solución se vuelva homogénea y no se observe precipitado alguno.Una vez finalizado, coloque aproximadamente una cubreobjetos de vidrio cuadrada de 15 milímetros en el centrifugador. Aplique 50 microlitros de la solución PU uno a cuatro sobre la cubreobjetos utilizando una pipeta; centrifugue cada cubreobjetos durante siete segundos a 23 veces G. Luego, deje secar al aire la cubreobjetos a temperatura ambiente durante al menos 24 horas antes de la esterilización. En este punto, irradie con rayos gamma cada cubreobjetos recubierta con polímero aplicando una dosis de 10 grays mediante un radiador de laboratorio durante 12 minutos.Alternativamente, irradie cada cubreobjetos recubierto con polímero utilizando una bombilla UV de 30 vatios durante 16 minutos por cada lado. Una vez finalizado, coloque el cubreobjetos recubierto con polímero en una placa de cultivo de tejidos adecuada según el tamaño del cubreobjetos. Después de cultivar y diferenciar la línea de células madre embrionarias humanas, retire las células disociadas utilizando un reactivo de disociación y repiértalas sobre los cubreobjetos recubiertos con PU 1 34 al noveno día del proceso de diferenciación en presencia de medio sin suero para microscopía electrónica de barrido.Las imágenes de los diferentes cubreobjetos de vidrio recubiertos muestran que el recubrimiento con tolueno o cloroformo no fue homogéneo, lo que demuestra un recubrimiento irregular con precipitación de PE 1 34. En contraste, el tetrahidrofurano permitió el recubrimiento por centrifugación de una superficie mucho más uniforme. Además, el análisis mediante microscopía de fuerza atómica de los diferentes recubrimientos poliméricos muestra una reducción del 40 % en la rugosidad de P 1 34 solubilizado en tetrahidrofurano en comparación con otros disolventes, lo que demuestra un recubrimiento más uniforme de PU 1 34. En una aplicación biológica, se indujo la diferenciación del endodermo hepático y, en el día nueve, eran evidentes células similares a hepatoblastos, con la mayoría de las células expresando citokeratina 19, proteína alfa-fetoproteína y factor nuclear de hepatocitos para alfa, y bajos niveles de albúmina como medida de la función metabólica.La función de la citocromo P cuatro 50 se evaluó cuatro días después del resembrado en diferentes superficies recubiertas con polímero. Se observó un aumento dos veces mayor en la actividad metabólica en las células resembradas en superficies recubiertas con tetra hidro furan mpu 1 3 4. Estos resultados demuestran que la actividad metabólica de los hepatocitos derivados de células madre embrionarias humanas mejora con una superficie de recubrimiento P 1 34 más uniforme. El análisis por contraste de imagen no mostró diferencias evidentes tras la irradiación UV o gamma, lo cual se confirmó además mediante análisis por microscopía electrónica de barrido.Hepatocitos derivados de células madre embrionarias humanas replatados sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos con PU 1 34 irradiados con rayos gamma mostraron un aumento triple en la actividad de CYP tres a en comparación con células replatadas sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos con PU 1 34 irradiados con UV. Estas observaciones demuestran que la irradiación gamma es la técnica de esterilización óptima. Al intentar este procedimiento, es importante recordar verificar la homogeneidad del recubrimiento entre diferentes CLO de recubrimiento por centrifugado, y no olvidar que trabajar con disolventes químicos e instrumentación puede ser extremadamente peligroso.Siempre se deben tomar medidas como el uso de gafas de seguridad al realizar este procedimiento.

stabilizing-hepatocellular-phenotype-using-optimized-synthetic

Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

Este artículo se centrará en la generación de endodermo hepático humano de las poblaciones humanas con células madre embrionarias.

Generación robusta de hepatocitos como las células de las poblaciones humanas células madre embrionarias

Se describe una técnica para aislar hepatocitos humanos y células hepáticas no parenquimatosas del mismo donante. Los diferentes tipos de células hepáticas constituyen la base para los modelos funcionales de hígado y la ingeniería de tejidos. Este nuevo método tiene como objetivo aislar células hepáticas en un alto rendimiento y viabilidad.

Protocolo para el aislamiento de hepatocitos primarios humanos y la correspondiente principales poblaciones de células hepáticas no parenquimatosas

El método presentado aquí describe un sistema de diferenciación -ready prácticas de fabricación escalable y bueno (GMP) para generar células hepatocitos como las humanas a partir de células madre pluripotentes. Sirve como un sistema rentable y estandarizado para generar células hepatocitos humanos para la investigación, como el hígado humano básico y aplicado.

Definido y escalable Generación de células hepatocitos como las de las células madre pluripotentes

El protocolo que presentamos describe una plataforma para la identificación de pequeñas moléculas para el tratamiento de la enfermedad hepática. Se presenta una descripción paso a paso detallando cómo iPSCs se diferencian en células con características de hepatocitos en placas de 96 pocillos y utilizar las células para detectar pequeñas moléculas con potencial actividad terapéutica.

Usando humanos inducida por células de hepatocito-como derivado de células madre pluripotentes de descubrimiento de fármacos

Este protocolo describe un enfoque semiautomático para producir células similares a hepatocitos de células de vástago pluripotent humana en formato de 96 placa bien. Este proceso es rápido y eficiente, permitiendo que la producción de calidad asegurada lotes de hepatocitos como las células para investigación básica y aplicada.

Producción semi automatizada de hepatocitos como células de células madre pluripotentes

Este protocolo describe un enfoque para producir hepatoesferas a partir de células madre pluripotentes humanas utilizando un sistema de cultivo definido y un autoensamblaje celular. Este protocolo es reproducible en una serie de líneas celulares, rentable y permite la producción de hepatóferas humanas estables para aplicación biomédica.

Producción libre de suero de heferas humanas tridimensionales a partir de células madre pluripotentes

El objetivo de este artículo es proporcionar un enfoque estandarizado para inducir la diferenciación de progenitores hepáticos humanos a partir de células madre pluripotentes. El desarrollo de este procedimiento con formulaciones de medios listas para usar ofrece al usuario un sistema fácil para generar células hepáticas humanas para la investigación biomédica y la traducción.

Especificación de progenitores hepáticos a partir de células madre pluripotentes utilizando un sistema de diferenciación definida

Se estableció un sistema de cultivo de organoides 3D ex vitro a largo plazo a partir de hepatocitos de ratón. Estos organoides pueden ser atravesados y manipulados genéticamente por infección por lentivirus de construcción shRNA/ectópica, transfección de siRNA e ingeniería CRISPR-Cas9.

Establecimiento y manipulación genética de organoides hepatocitos murinos

Los hepatocitos derivados de células madre pluripotentes se pueden purificar a través de la clasificación celular, utilizando una combinación de tinción de moléculas de adhesión de células leucocitarias mitocondriales y activadas (ALCAM, también conocida como CD166).

Aplicación de la tinción de mitocondrias vivas en la clasificación celular para purificar hepatocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas

Los avances técnicos recientes permitieron la producción a escala de una plataforma in vitro para aplicaciones de metabolismo y toxicidad de fármacos. Un sistema hepático 2D+ totalmente humano (TV2D+) proporciona resultados fisiológicamente relevantes utilizando métodos tradicionales de cultivo bidimensional. Este protocolo apoyará a los usuarios finales en la configuración, el mantenimiento y la aplicación del sistema.

Un sistema de cultivo hepático totalmente humano para aplicaciones de desarrollo de fármacos

Aprende a optimizar superficies recubiertas con polímero PU 1 3 4 para cultivar hepatocitos derivados de células madre. Este método mejora la adhesión celular y la viabilidad a largo plazo mediante técnicas de recubrimiento por centrifugación y esterilización gamma.

Estabilizar hepatocelular Fenotipo Usando superficies sintéticas optimizadas

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