Estabilizar hepatocelular Fenotipo Usando superficies sintéticas optimizadas

El objetivo general de este procedimiento es optimizar las superficies recubiertas de polímeros para preservar el cultivo estable a largo plazo de hepatocitos humanos derivados de células madre. Esto se logra sintetizando primero poliuretano 1 3 4 o PU 1 3 4. El segundo paso es elegir el disolvente adecuado para solubilizar el PU 1 34.

A continuación, se optimiza el proceso de recubrimiento por centrifugado con el PU 1 3 4 en el engobe de la cubierta de vidrio. El paso final es la optimización del procedimiento de esterilización de los cubreobjetos de vidrio recubiertos de polímero P 1 34, en última instancia, microscopía electrónica de barrido, microscopía de fuerza atómica y metabolismo de fármacos. Los ensayos se utilizan para mostrar la influencia del recubrimiento polimérico PU 1 34 en la función de los hepatocitos derivados de células madre.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el uso de al Metrices en cultivo para mantener células madre potentes de URI que tienen hepatocitos, es que estos materiales sintéticos se pueden ajustar para el propósito y una escala S a estándares de calidad garantizada. Además, muestran la consistencia del bus del lote dos. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de las enfermedades hepáticas porque representa un ejemplo de cómo se puede optimizar la superficie de un polímero sintético para preservar el fenotipo celular.

El Dr. Jeffrey Walton, un postdoctorado de mi laboratorio, demostrará el procedimiento antes de comenzar este procedimiento. Aplique un tratamiento térmico a la esfera de seis hexanos di etilenglicol y neo PenTile glycol a 40 grados centígrados durante 48 horas en un horno de vacío. Para eliminar cualquier agua residual, agregue 22 milimoles de cada monómero y 55 milimoles de un ácido dpic a un matraz de fondo redondo de dos cuellos conectado a un aparato dean stark y equipado con una barra de agitación magnética.

A continuación, coloque todo el conjunto al vacío y caliente suavemente la cristalería a 40 grados centígrados durante seis horas para evitar la absorción de humedad durante la adición del producto químico al matraz. Después de retirar el conjunto del horno y colocar el sistema bajo nitrógeno, agregue 0,0055 moles del catalizador titanio cuatro, pero oxide gota a gota con una jeringa al matraz. Agite la mezcla de reacción a 180 grados centígrados durante 24 horas, recogiendo el agua residual en la trampa dean stark.

Deje que el producto se enfríe a temperatura ambiente. A continuación, mezcle 3,2 milimoles, o un equivalente del poliol P-H-N-G-A-G con 6,4 milimoles o dos equivalentes de cuatro cuatro metilo y un isocianato de bisfenol. En 12 mililitros de DML anhidro a un matraz de fondo redondo de dos cuellos conectado a un aparato Dean Stark y equipado con una barra de estrella magnética.

Agite la mezcla de reacción a 70 grados centígrados bajo una atmósfera de nitrógeno. A continuación, añada el catalizador de titanio cuatro óxido gota a gota a través de una jeringa hasta una concentración final de 0,8%Después de una hora, añada un equivalente del extensor de cadena un dial de cuatro butano para dar producto de copolímero. Aumente la temperatura a 90 grados centígrados y muera de hambre durante 24 horas bajo una atmósfera de nitrógeno.

Una vez que la mezcla de reacción ha llamado a temperatura ambiente un dal éter gota a gota a la mezcla de reacción hasta que se observa la precipitación del producto de poliuretano. Después de transferir la mezcla de reacción a un tubo de centrífuga, centrifugar la solución a 5.300 veces G durante cinco minutos. Después de la decantación, el supinato se seca a temperatura ambiente hasta que el solvente se evapora.

A continuación, pesa 200 miligramos de PU 1 34 en una botella de vidrio. Diluir la muestra hasta una concentración final del 2% en cloroformo o cloroformo y tolueno en una proporción de uno a uno o tetra roran o una combinación de tetra roran anticlorometano. En una proporción de uno a uno, agite la solución vigorosamente durante 20 minutos a temperatura ambiente usando un agitador a una velocidad de 200 movimientos por minuto hasta que la solución se vuelva homogénea y no se observe ningún precipitado.

Cuando termine, coloque alrededor de 15 milímetros cuadrados de cubierta de vidrio en el tapiz giratorio. Aplique 50 microlitros de la solución de PU de uno a cuatro al cubreobjetos con una pipeta, centrifugue cada cubreobjetos durante siete segundos a 23 veces G. Luego seque al aire el cubreobjetos a temperatura ambiente durante al menos 24 horas antes de la esterilización. En este punto, los rayos gamma irradian cada cubreobjetos recubiertos de polímero aplicando una dosis de 10 grises con un radiador de laboratorio durante 12 minutos.

Alternativamente, irradie con rayos UV cada cubreobjetos recubiertos de polímero utilizando una bombilla UV de 30 vatios durante 16 minutos en cada lado. Cuando termine, coloque el cubreobjetos recubierto de polímero en una placa de cultivo de tejidos adecuada de acuerdo con el tamaño del cubreobjetos. Después de cultivar y diferenciar la línea de células madre embrionarias humanas, las células se desprendieron utilizando el reactivo de disociación y las reprodujeron en los cubreobjetos recubiertos de PU 1 34 en el noveno día del proceso de diferenciación en presencia de microscopía electrónica de barrido en medio libre de suero.

Las imágenes de los diferentes cubreobjetos de vidrio revestido muestran que el recubrimiento con tolueno o cloroformo no era homogéneo, lo que demuestra un recubrimiento desigual con precipitación de PE 1 34. Por el contrario, el tetraedro permitió el recubrimiento por espín de una superficie mucho más uniforme. Además, el análisis de microscopía de fuerza atómica de los diferentes recubrimientos poliméricos muestra una reducción del 40% en la rugosidad del P 1 34 solubilizado en tetra hidrofurina en comparación con otros solventes, lo que demuestra un recubrimiento de PU 1 34 más uniforme, se indujo una diferenciación del endodermo hepático de aplicación biológica y en el noveno día, se observaron blastos hepato similares a las células, con la mayoría de las células expresando la proteína alfa feta de citoqueratina 19 y el factor nuclear de los hepatocitos para alfa y Niveles bajos de albúmina como medida de la función metabólica.

Se evaluó la función del citocromo P 44 50 cuatro días después de la reposición en diferentes superficies recubiertas de polímeros. Se observó un aumento del doble en la actividad metabólica en las células replateadas en superficies recubiertas de tetra hydro fure mpu 1 3 4. Estos resultados demuestran que la actividad metabólica de los hepatocitos derivados de células madre embrionarias humanas mejora con una cara de recubrimiento P 1 34 más uniforme. Las imágenes de contraste no mostraron diferencias macroscópicas después de la irradiación UV o gamma, lo que se confirmó aún más mediante un análisis de microscopía electrónica de barrido.

Los hepatocitos derivados de células madre embrionarias humanas replateados en cubreobjetos de PU 1 34 radiados con rayos gamma mostraron un aumento de tres veces en la actividad del CYP tres a sobre las células rechapadas en cubreobjetos de PU 1 34 recubiertos con radiación UV. Estas observaciones demuestran que la radiación gamma es la técnica de esterilización óptima. Al intentar este procedimiento, es importante recordar verificar la homogeneidad del recubrimiento entre diferentes CLO de recubrimiento por centrifugación, y no olvide que trabajar con instrumentación de solventes químicos puede ser extremadamente peligroso.

Siempre se deben tomar aplicaciones como el uso de gafas de seguridad mientras se realiza este procedimiento.