Utilizando diseño personalizado galvanotaxia Cámaras para Estudiar direccional migración de las células de la próstata

El objetivo general de este procedimiento es realizar Galvan Axxis, un ensayo para evaluar la migración direccional de las células en un campo eléctrico aplicado. Esto se logra ensamblando primero y luego sembrando una cámara Galvan axxis con las celdas de interés. En el segundo paso, se sella la cámara y se aplica un campo eléctrico para obtener imágenes de lapso de tiempo.

En el paso final, se realiza un seguimiento de la velocidad de migración de las celdas individuales y el ángulo relativo al campo eléctrico. En última instancia, cosignatario. Se puede utilizar para mostrar cómo responden las células al campo eléctrico y si migran direccionalmente al cátodo.

La principal ventaja de esta técnica es la fácil recuperación de células después de la administración de Texas para análisis secundario y la facilidad con la que la migración se puede filmar a gran aumento y con células marcadas con fluorescencia. La visualización de este método es fundamental, ya que los pasos de ensamblaje de una cámara son difíciles de aprender sin una demostración para ensamblar las cámaras inferiores. Comience limpiando una cámara de plástico galvan axxis con dos propanol.

Luego use una jeringa para aplicar un sellador de silicona de grado marino alrededor de las aberturas circulares en la parte inferior de la cámara. Coloque un cubreobjetos grande sobre el sellador y presiónelo en su lugar con el extremo de un aplicador de algodón, limpiando el exceso de pegamento con el hisopo de algodón. A continuación, utiliza un rotulador de punta de diamante para cortar un pequeño cubreobjetos y hacer espacios de seis por 25 milímetros y voltear la cámara.

A continuación, utilice una jeringa para aplicar dos tiras de silicona, creando una superficie de canal de 10 por 25 milímetros para la fijación de las células entre las dos aberturas circulares del cristal inferior. A continuación, pega dos espacios de cristal entre las aberturas circulares, empujando los espacios hacia abajo con un nuevo aplicador de algodón y limpiando el exceso de pegamento como se acaba de demostrar. Pruebe la cámara durante 24 horas hasta que el pegamento de silicona esté curado.

Al día siguiente, remoje la cámara en agua destilada durante la noche para eliminar los residuos de ácido acético del pegamento antes de sembrar las células en la cámara. Seque y limpie las cámaras con dos propanol como se acaba de demostrar. Lávelos con PB S3 estéril varias veces y luego verifique el flujo de líquido entre las dos aberturas circulares de las cámaras.

Después de confirmar que las cámaras están en buenas condiciones de funcionamiento, enciérrelas en placas de cultivo estériles y coloque las cámaras a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Mientras las cámaras están en equilibrio, separe las células prostáticas de su placa de cultivo con cinco mililitros de tripsina EDTA a 37 grados centígrados. Después de cinco minutos, neutralizar la reacción con cinco mililitros de 10%FBS.

En PBS, transfiera las celdas separadas a tubos de 15 mililitros y luego centrifugue durante cinco minutos. A 200 veces, G, aspire el medio y luego vuelva a suspender el pellet en un mililitro de medio. Luego, después de contar las células, ajuste la concentración de células a ocho por 10 a las cuatro células por mililitro con medio de cultivo y semilla.

350 microlitros de suspensión de la célula en cada cámara. Incubar las células en la cámara durante la noche en una placa de cultivo con una toallita Kim húmeda a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, comience el montaje de las cámaras superiores calentando primero 10 mililitros de cultivo, medio a 37 grados Celsius para cada cámara AXS galvan.

Mientras el medio se calienta, transfiera una cámara Galvan axxis de la incubadora a una placa de calentamiento de 37 grados Celsius y enjuague la cámara con medio de cultivo. Para eliminar las celdas sueltas, deje 400 microlitros de medio en la cámara y luego use una jeringa para aplicar grasa de alto vacío en la parte superior de ambos espacios de vidrio. Selle la cámara con un cubreobjetos y un aplicador de algodón, y luego seque la superficie del vidrio.

A continuación, aplique la grasa de alto vacío con una jeringa para sellar el espacio entre el cubreobjetos y la cámara. Y luego agregue el medio de cultivo a los depósitos internos. Retire las burbujas y verifique el flujo de líquido entre los depósitos.

Para hacer los puentes de agar, corta un par de tubos de PVC de dos pulgadas, dales la vuelta y luego coloca las piezas en un vaso de precipitados de 100 mililitros. A continuación, agregue 200 miligramos de agar bact toe en un matraz de 50 mililitros con 10 mililitros de medio de cultivo para hacer un gel de agar al 2%. Después de calentar en el microondas durante 30 segundos, use una pipeta de transferencia para cargar el gel de agar en el tubo de plástico y deje los puentes de agar a temperatura ambiente durante 10 minutos para solidificar el agar.

A continuación, añada dos mililitros de medio de cultivo a los depósitos exteriores de la cámara de gal e inserte los puentes de agar en los depósitos de medio interior y exterior para conducir la corriente y realizar imágenes de lapso de tiempo de la migración. Comience transfiriendo la cámara de Galván a una cámara ambiental de 37 grados Celsius en la etapa del microscopio, asegurando la cámara con cinta adhesiva y enfocándose en las celdas bajo un objetivo de 10x. A continuación, inserte los electrodos Galvan Axxis en los depósitos exteriores con el cátodo en el lado derecho, asegurando el cable y los electrodos con cinta adhesiva.

A continuación, encienda la caja de alimentación para aplicar un campo eléctrico a la cámara y utilice un medidor de voltaje para medir el voltaje de salida en la cámara para alcanzar los 2,5 voltios para la cámara de 25 milímetros de largo. Ahora seleccione 10 puntos en la cámara para generar 10 películas de lapso de tiempo y establezca las condiciones de adquisición en intervalos de 10 minutos durante dos horas. Luego comience a filmar y ajuste la corriente de salida según sea necesario para mantener la intensidad del campo durante el experimento.

Al final del experimento, retire la cámara del escenario y fije las células en alcohol al 95%. A continuación, abra la cámara. El comprobante se puede guardar para más tarde.

Tinción e imagenología. Limpie la cámara para los años futuros. Para cuantificar el Galvan Axxis, gire los vídeos time-lapse para orientar el cátodo a la parte superior de las imágenes.

Exporte las películas al software de seguimiento de celdas y rastree manualmente la posición XY de 10 a 20 celdas en cada punto de tiempo de cada película, las distancias de migración y los ángulos relativos a la dirección norte sur, la misma orientación del campo eléctrico se calculará en el software de seguimiento de celdas. Finalmente, guarde las mediciones e importe los datos a una aplicación de base de datos para calcular los resultados combinados. En este experimento representativo de Galván Axxis a líneas de células prostáticas se determinó que migraban a velocidades similares en el transcurso de dos horas.

Sin embargo, la direccionalidad al campo eléctrico fue de 0.7 más menos 0.3 para el PRNS de una línea, y de 0.2 más menos 0.8 para el PNT de dos líneas, lo que indica una diferencia significativa en el eje de Galván de estas dos líneas celulares, lo que sugiere que sus mecanismos de señalización celular dirigen las respuestas de migración diferencial al campo eléctrico después del desarrollo del método de Govan Texas. Esta técnica ayuda a los investigadores a explorar los mecanismos de la migración celular direccional en el campo eléctrico.