Name: Utilizando diseño personalizado galvanotaxia Cámaras para Estudiar direccional migración de las células de la próstata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Aprende a evaluar la migración direccional de células prostáticas inmortalizadas usando cámaras de galvanotaxis personalizadas. Este método permite analizar la respuesta celular a campos eléctricos fisiológicos en tiempo real.

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Las líneas celulares de próstata se amablemente proporcionados por el Dr. Ling-Yu Wang y Dr. Hsing-Jien Kung en el Centro de Cáncer, la Universidad de California Davis. Este proyecto es apoyado por el NIH subvención galvanotaxia 4R33AI080604.

1. cultivar células de la próstata <ol><li> Cultura los PRN-1-1 y PNT2 próstata células en 100 mm cultura platos en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de SFB y antibióticos Antimycotic a 37 ° C con 5% de CO 2. Actualizar el medio de cultivo cada día hasta que las células alcanzan 80% de confluencia para los experimentos galvanotaxia. </li></ol> 2. Composición galvanotaxia Cámaras <ol><li> Montaje de cámaras inferiores <ol><li> Limpie una cámara galvanotaxia plástico con 2-propanol. Aplicar el sellador de silicona de grado marino alrededor de las aberturas circulares en la parte inferior de una cámara con una jeringa y adjuntar una gran cubreobjetos (Figura 1). Use la parte de atrás de un aplicador de algodón para empujar hacia abajo el cubreobjetos y limpie el exceso de pegamento con hisopos de algodón. Las aberturas circulares permiten el medio y la corriente eléctrica fluya sobre las células situadas entre los dos depósitos medianas interiores. </li><li> Corte un pequeño cubreobjetos para hacer 6 mm x 25 espaciadores mm con un marcador de punta de diamante. </li><li> Voltear la cámara. Aplicar 2 rayas de la cola de silicio con una jeringa y / o una espátula de metal para crear un x 25 mm superficie del canal 10 mm para la fijación celular entre las 2 aberturas circulares en el cristal inferior. Pegue 2 piezas de vidrio separador entre las 2 aberturas circulares. Use la parte de atrás de los aplicadores de algodón para empujar hacia abajo los espaciadores y limpie el exceso de pegamento con hisopos y / o palillos de algodón. </li><li> Seque la cámara durante 24 horas hasta que se cure el pegamento de silicona. Remojar la cámara durante la noche en agua destilada para eliminar el residuo de ácido acético a partir de la cola. Seque la cámara para su uso inmediato, o almacenar la cámara para su uso posterior en un recipiente limpio. <img alt="Diagrama de configuración de la cámara Galvanotaxis que detalla el ensamblaje con espaciadores de vidrio, vidrio de cubierta inferior." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Montaje de la cámara de la parte inferior galvanotaxia. A) Un gran cubreobjetos está unido a la parte inferior de una cámara limpia. B) Two piezas de separadores de cristal se pegan entre las 2 aberturas circulares para crear una 10 mm x 25 mm para el canal de las células se unan. </li></ol></li><li> Siembra de las células en las cámaras galvanotaxia <ol><li> Preparar el número requerir de cámaras galvanotaxia necesarios para el experimento. Cada línea o el tratamiento de células requiere una única cámara galvanotaxia. Limpie las cámaras galvanotaxia con 2-propanol. Lave las cámaras con estériles PBS 3 veces y compruebe el flujo de líquido entre las 2 aberturas circulares en las cámaras. </li><li> Incluya las cámaras en placas de cultivo de células estériles y dejar que se equilibren a 37 ° C durante 15 minutos. Separar las células de la próstata a partir de su plato de cultivo utilizando 5 ml 0,25% de tripsina-EDTA a 37 ° C durante 5 min. Neutralizar la tripsina-EDTA con 5 ml 10% de FBS en PBS. </li><li> Transferir las células a tubos de 15 ml y centrifugar las células durante 5 min a 200 xg, 37 ° C. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en 1 ml de medio de cultivo. </li><li> Tome 20 μl de solución de células para cargar a una cámara de recuento y calcular el número de células. Ajustar la concentración de células a 8 x 10 4 células / ml con medio de cultivo. </li><li> Tome las cámaras galvanotaxia de los 37 ° C incubadora. Semillas 350 l de la suspensión celular sobre cada cámara. </li><li> Se incuban las células en las cámaras durante la noche en la placa de cultivo con Kimwipe mojado o en una cámara de humedad en la incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2. </li></ol></li></ol><img alt="Diagrama de migración de células prostáticas con configuración de incubadora para análisis experimental a 37 ° C, 5% de CO2." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 2"> Figura 2:. Siembra de las células a la cámara de la cámara inferior se seca y limpia las células A) de próstata se tripsinizaron, se contaron y se transfirieron a la cámara y se incubaron durante la noche B) un cubreobjetos superior está unido a sellar la cámara antes de la filmación... <ol start="3"><li> Lassembling las cámaras superiores <ol><li> Montar la cámara superior antes de la filmación. El microscopio sólo puede acomodar imágenes de una sola cámara galvanotaxia al mismo tiempo. Calentar 10 ml de medio de cultivo a 37 ° C para cada cámara galvanotaxia. Transferir una cámara galvanotaxia de las incubadoras a una placa de calentamiento 37 ° C. </li><li> Enjuagar las células con medio de cultivo para eliminar las células no unidas. Deja 400 l de medio en la cámara. Utilice una jeringa para aplicar grasa de alto vacío en la parte superior de ambos separadores de vidrio. </li><li> Añadir una pequeña cubreobjetos para sellar la cámara. Presione suavemente el cubreobjetos con el lado posterior de un aplicador de algodón. Limpie el medio exceso con hisopos de algodón. </li><li> Seque la superficie del vidrio y aplicar grasa de alto vacío para sellar la brecha entre el cubreobjetos y la cámara. Use una espátula de metal para extender la grasa. Añadir 4 ml de medio de cultivo para los depósitos internos y comprobar el flujo de líquido entre los embalses. </li></ol></li><li> Haga agarpuentes <ol><li> Corte un par de tubos de PVC de 2 pulgadas de largo (503/16 ID x 5.16 OD x 1/16 Wall), dar la vuelta e insertarlos en un vaso de 100 ml. </li><li> Mide 200 mg Bacto-Agar y agregarlo en un matraz de 50 ml con medio de cultivo de 10 ml de hacer 2% en gel de agar. Microondas durante 30 segundos. Cargue el gel de agar para el tubo de plástico con una pipeta de transferencia. Deje los puentes de agar a temperatura ambiente durante 10 min para solidificar el agar. </li><li> Añadir 2 ml de medio de cultivo a los depósitos exteriores de la cámara galvanotaxia. Inserte los puentes de agar a los embalses medianas interior y exterior para conducir la corriente. </li></ol></li></ol><img alt="Diagrama del experimento de Galvanotaxis que muestra la configuración de la cámara con puentes de agar y alimentación de CC para la migración celular." fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig3highres.jpg" width="350" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 3"> Figura 3:. El rodaje de las células en la cámara de un diagrama para demostrar el montaje final de la cámara de galvanotaxia. La cámara está completamente sellado con grasa de alto vacío. El medio se añadió to llenar los depósitos, y dos puentes de agar se insertan en la cámara. A continuación, la cámara de galvanotaxia se transfiere a la platina del microscopio y los electrodos están unidos a aplicar el campo eléctrico. Vista lateral de la cámara de galvanotaxia ensamblado se muestra para demostrar que la corriente eléctrica fluye sobre las células a través de los puentes de agar y el espacio entre el vidrio de cubierta. Imaging 3. Time-lapse <ol><li> Encender la cámara ambiental a 37 ° C con 5% de CO2 en el aire que circula 2 hr antes de la imagen. </li><li> Encienda el microscopio e iniciar el software de adquisición de imagen. Calibrar la platina del microscopio y seleccione el objetivo de 10X. </li><li> Transferir las cámaras galvanotaxia a la platina del microscopio, asegure la cámara con cinta y se centran en las células. Introducir los electrodos galvanotaxia a los depósitos exteriores con cátodo en el lado derecho. Fije el cable y los electrodos con cinta. </li><li> Encienda el bo poderx para aplicar un campo eléctrico a la cámara. Mida el voltaje de salida con el voltímetro a través de la cámara de alcanzar 2,5 voltios para la cámara de 25 mm de largo (100 mV / mm). Mantener la intensidad de campo durante el experimento mediante el ajuste de la corriente de salida. </li><li> Seleccione 10 puntos a través de la cámara para filmar en el software para generar diez películas a intervalos. Configurar las condiciones de adquisición a intervalos de 10 minutos durante 2 horas. </li><li> Iniciar el rodaje y ajustar la corriente de salida, según sea necesario. </li><li> Al final del experimento, retire la cámara desde el escenario y fijar las células con 95% de alcohol. Rompa la cámara con una hoja de afeitar para limpiar y volver a usarlo. </li></ol> 4. Cuantificación de Galvanotaxis <ol><li> Gire las películas a intervalos y reorientar el cátodo a la parte superior de las imágenes. Exportar las películas para el software de seguimiento de la célula. </li><li> Rastrear manualmente el (x, y), la posición de 10 a 20 células en cada punto de tiempo de cada película (Figura 4 A, B).Las distancias de migración y los ángulos relativos a la dirección norte-sur, la misma orientación del campo eléctrico, se calcularán en el software de seguimiento de la célula (Figura 4C). NOTA: La velocidad media de migración se convierte de la distancia de migración total y el tiempo total de rodaje. La direccionalidad se convierte de los ángulos en el valor del coseno. Si las células migran con direccionalidad al azar, el promedio de coseno neto será cercano a cero. Si las células migran directamente hacia el cátodo, el valor del coseno será 1. Si las células migran directamente hacia el ánodo, el valor del coseno será -1. </li></ol><img alt="Comparación de migración celular, migración aleatoria vs galvanotaxis, diagrama con ecuación de coseno para dirección." fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig4highres.jpg" width="400" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 4"> Figura 4: seguimiento de la célula para medir la direccionalidad A) Superposición de las líneas de seguimiento con imágenes de células.. Los (x, y) posiciones de las células son manually rastreado en las películas a intervalos. . Si las células migran al azar, el coseno promedio es cercano a cero B) Sin embargo, si las células migran hacia el cátodo o el ánodo, el valor del coseno media es de cerca de + (cátodo) o -. (Ánodo) 1,0 C ) La direccionalidad es presentado por el valor del coseno, que se convierte a partir de los ángulos de migración (θ). El coseno (θ) es igual a la relación de la distancia a (la distancia de migración) la distancia b (la distancia proyectada a la dirección del campo eléctrico). <ol start="3"><li> Guarde las mediciones. Importe los datos a una aplicación de base de datos para el cálculo de los resultados combinados. </li><li> Exportar los datos combinados de la velocidad media de migración y el valor promedio del coseno de una hoja de cálculo para trazar los gráficos de barras (Figura 5). </li></ol>

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<li>Mukerjee, E. V., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R., Collins, S. D., Smith, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedle+array+for+measuring+wound+generated+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Conf+Proc+IEEE+Eng+Med+Biol+Soc%22%5BJournal%5D)">Microneedle array for measuring wound generated electric fields.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 4326-4328 (2006).</li>
<li>Nuccitelli, R., Nuccitelli, P., Li, C., Narsing, S., Pariser, D. M., Lui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electric+field+near+human+skin+wounds+declines+with+age+and+provides+a+noninvasive+indicator+of+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Rep.+and+Reg%22%5BJournal%5D)">The electric field near human skin wounds declines with age and provides a noninvasive indicator of wound healing.</a> Wound Rep. and Reg. 19, 645-655 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El análisis de la respuesta galvanotaxia de una célula ha sido un indicador funcional importante para muchos migratoria o crecimiento celular procesa 27, 28. Aquí se utiliza una cámara de medida con la superficie de vidrio a la película dos líneas celulares de próstata. Estas líneas celulares demostraron diferentes grados de galvanotaxia, y especulan que la localización intracelular o la activación de las proteínas galvanotaxia-mediación pueden ser interferidas durante el proceso de generación de las líneas c...

Campos eléctricos endógenos se detectan en varios tejidos, como la piel 1, 32, 33 y el cerebro 2. El campo eléctrico fisiológica sirve funciones biológicas específicas, incluyendo la dirección de desarrollo del embrión 3, 4, guiando la consecuencia de los procesos neuronales 5, 6 y la promoción de cierre de la herida epitelial corneal y 1, 7. In vitro, la aplicación de un campo eléctrico de corriente directa a las células cultivadas imita el campo eléctrico fisiológica e induce la migración celular direccional, o galvanotaxia. Galvanotaxis se ha estudiado en fibroblastos, queratinocitos 8 de pescado 9, epitelial humano y queratinocitos corneales 10-12, linfocitos 13, neuroblastos 2, y células progenitoras neuronales 14. Cuando se expone al campo aplicado, la mayoría de las células estudiadas migran direccionalmente hacia el catódica polo (-). Sin embargo, varias células cancerosas, incluyendo altamente metastásicocélulas de cáncer de mama humano y la próstata humana línea celular de cáncer PC-3M, se mueven a la anódica polo (+) 15, 16. Se proponen varios mecanismos para mediar galvanotaxia o para explicar la capacidad de las células para detectar el campo eléctrico, incluyendo la activación de los receptores de EGF 12, el canal de sodio epitelial 17, PI3K y PTEN 18, y la liberación de iones de calcio 15, 19. El mecanismo no es todavía plenamente comprendida y es posible que múltiples vías de señalización están implicadas en galvanotaxia. El método galvanotaxia 2-dimensional se demuestra aquí es útil para caracterizar la migración direccional de adherente, células móviles, ya sea para controlar la migración de células individuales 10, 12, 17 o la migración de una hoja de células confluentes 18, 20. Esta técnica se modifica desde Peng y Jaffe 21 y Nishimura et al. 10 con, cámaras de PVC claras a medida, con coversl extraíbleips permitiendo la recuperación de células fácil después galvanotaxia para el análisis secundario, como las imágenes de inmunofluorescencia. La superficie de vidrio de las cámaras galvanotaxia es compatible con óptica, que permite la grabación a alta magnificación y con células marcadas con fluorescencia. También permite que el diseño experimental con la modificación de la superficie de vidrio, tales como cambiar el revestimiento de la superficie o cargos. Los espaciadores hechos de No. 1 cubreobjetos se utilizan en las cámaras para minimizar el flujo de corriente a través de las células; por lo tanto el calentamiento por efecto Joule, que es proporcional al cuadrado del flujo de corriente, no sobrecalentar las células durante el experimento. Los puentes de conexión de agar evitar el contacto directo de los electrodos con las células y prevenir el cambio del pH del medio o la concentración de iones durante galvanotaxia. Dos no tumorigénicas líneas celulares de próstata humano se examinaron por su respuesta galvanotaxia en este estudio. Los PRN-1-1 22 y PNT2 23 son ambos SV40 inmortalizadas, dependientes de factor de crecimiento de líneas celulares que expresan los marcadores epiteliales citoqueratina 5, 8, 18 y 19 con baja o ninguna expresión de la específica de antígeno de la próstata (PSA). Ambas líneas celulares mantienen la morfología poligonal de las células epiteliales normales, pero anomalía cromosómica se observó en el cariotipo 22, 24. Aunque PRN-1-1 y PNT2 comparten comportamientos similares en la mayoría de los experimentos, muestran diferencias en la formación de la estructura acinar y en galvanotaxia. En una matriz de 3-D, Matrigel, los PRN-1-1 células acinares formar estructuras huecas con lúmenes se asemejan a la tejido de la glándula próstata normal 25. Sin embargo, las células PNT2 formar esferoides sólidos sin un lumen o epitelio polarizado 26. Las células PRN-1-1 también demuestran una respuesta galvanotactic más alta que la PNT2 en el estudio actual. La correlación entre la formación de la estructura acinar y galvanotaxia en PRN-1-1 sugiere que las señales galvanotactic pueden jugar un papel en la organización de la prmovimientos de tejido de la glándula ostate en respuesta a campos eléctricos endógenos, y ofrece características adicionales para discriminar entre estas 2 líneas celulares.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cells</td></tr><tr><td>pRNS-1-1 células</td><td></td><td></td> prostáticas <td>Lee, et al. (1994)</td></tr><tr><td>Células prostáticas PNT2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95012613-1VL</td><td>Berthon, et al. (1995)</td></tr><tr><td colspan="4">Medium and solutions</strong</td></tr><tr><td>>RPMI 1640 medium&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td>calentamiento hasta 37 &deg; C antes de usar</td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino - Premium</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>10% en PBS, calentar hasta 37 &deg; C antes de usar</td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>15240</td><td>añadir 5 ml a 500 ml</td></tr> medio <tr><td>2-propanol</td><td>VWR</td><td>BDH1133-5GL</td><td></td></tr><tr><td>PBS-</td><td></td><td>-</td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4 y 1,5 mM KH2PO4 en 1.000 ml de H2 O, pH a 7.4 y autoclave, calentamiento hasta 37 &deg; C antes de usar</td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td>calentamiento hasta 37 &deg; C antes de usar, tratar las células durante 3-5 minutos a 37 &deg; C</td></tr><tr><td colspan="4"><dispositivo > fuerteGalvanotaxis</fuerte></td></tr><tr><td>cámaras de Galvanotaxis</td><td>Precision Plastics Inc, CA</td><td></td><td>Cámaras de PVC transparentes y no tóxicas diseñadas a medida (1/4" x 2" x 3,5"), no tóxicas. Póngase en contacto con los autores para conocer las especificaciones de diseño.</td></tr><tr><td>Electrodos Galvanotaxis Electrodos</td><td>UCD Electric shop</td><td></td><td>Electrodos en espiral de platino con cordones flexibles</td></tr><tr><td>Caja de alimentación Galvanotaxis</td><td>Substrate Engineering, CA</td><td></td><td>Salida de alimentación de CC diseñada a medida con voltímetro</td></tr><tr><td>Cubierta de microscopio Vidrio, grande, 45 x 50 mm, n.º 1,5</td><td>Fisher</td><td>12-544-F</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos para microscopio, pequeño, 25 x 25 mm, n.º 1</td><td>ThermoScientific</td><td>3307</td><td></td></tr><tr><td>Marcador de punta de diamante</td><td>ThermoScientific</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>Sellador de silicona de grado marino, transparente</td><td>3M</td><td>051135-08019</td><td></td></tr><tr><td>Grasa de alto vacío</td><td>Dow Corning</td><td>2021846-0807</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 6 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-561-64</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Nichiryo, 1,5 ml</td><td>Nichiryo</td><td>SG-M</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores de algodón</td><td>Productos Médicos Purtian</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Qtips</td><td>Johnson & Tubería de PVC Johnson</td><td>729389</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 180&nbsp;</td><td>Nalgene</td><td>8000-9030</td><td>503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Pared</td></tr><tr><td>Bacto-Agar</td><td>Difco</td><td>0140-01</td><td>hacer una solución de agar al 2%</td></tr><tr><td>Cuchilla de afeitar</td><td>Personna</td><td>74-0001</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipos y Software</td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>operada con un rotor A-4-62</td></tr><tr><td>Celómetro Auto T4</td><td>Nexcelom</td> Cámaras de conteo de celómetro <td>Auto T4</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100-002</td><td>carga 20 &#956; l soluciones de celda para contar</td></tr><tr><td>la placa de calentamiento Culture Temp</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>370150000</td><td>para mantener las cámaras de galvanotaxis a 37 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopio Eclipse TE-2000 con platina motorizada y cámara ambiental</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Fluor 10X/0.30 len objetivo</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Retiga EX Cámara CCD&nbsp;</td><td>Qimaging</td><td></td><td>Cámara CCD refrigerada, monocolor, 12 bits</td></tr><tr><td>Aire comprimido con 5% de CO2</td><td>Airgas</td><td></td><td>pedido especial</td></tr><tr><td>Volocity 6.3</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Software de adquisición de imágenes</td></tr><tr><td>Improvision OpenLab 5.5.2</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Software de seguimiento de células y personalizado para medir ángulos de migración</td></tr><tr><td>FileMaker Pro Advanced, 8.0</td><td>FileMaker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2008 para Mac</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

utilizando diseño personalizado galvanotaxia cámaras para estudiar direccional migración de las células de la próstata

Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells

El campo eléctrico fisiológica sirve funciones biológicas específicas, tales como la dirección de la migración celular en el desarrollo del embrión, consecuencia neuronal y la curación de la herida epitelial. La aplicación de un campo eléctrico de corriente directa a las células cultivadas in vitro induce la migración celular direccional, o galvanotaxia. El método galvanotaxia 2-dimensional se demuestra aquí se modifica con cámaras de poli por encargo (cloruro de vinilo) (PVC), superficie de vidrio, electrodos de platino y el uso de una etapa motorizada en la que se crean imágenes de las células. Las cámaras de PVC y electrodos de platino presentan baja citotoxicidad y son asequibles y re-usable. La superficie de vidrio y la platina del microscopio motorizado mejorar la calidad de las imágenes y permiten posibles modificaciones a la superficie de vidrio y tratamientos para las células. Filmamos la galvanotaxia de dos líneas de células no tumorigénicas SV40 inmortalizado próstata, PRN-1-1 y PNT2. Estas dos líneas celulares muestran velocidades de migración similares y ambos migran haciael cátodo, pero muestran un grado diferente de direccionalidad en galvanotaxia. Los resultados obtenidos a través de este protocolo sugerir que los PRN-1.1 y las líneas celulares PNT2 pueden tener diferentes características intrínsecas que gobiernan sus respuestas migratorias direccionales.

Dos líneas de células de la próstata (PRN-1-1 y PNT2) se investigaron con este método. Las células en ambas líneas migran a velocidades similares de 1,0 +/- 0,3 micras / min durante el transcurso de 2 horas (figura 5A). Sin embargo, la direccionalidad al campo eléctrico es 0,7 +/- 0,3-PRN para la línea 1-1, y 0,2 +/- 0,8 para la línea PNT2 (Figura 5B). Los resultados muestran una diferencia significativa en la galvanotaxia de estas dos líneas celulares (p &lt;0,01, 100 células fueron se...

Presentamos un método para aplicar un campo eléctrico fisiológico a las células prostáticas migratorias e inmortalizadas en una cámara de galvanotaxis hecha a medida. Usando este método, demostramos que 2 líneas de células prostáticas no tumorigénicas muestran diferentes grados de direccionalidad de migración en el campo.

Utilizando diseño personalizado galvanotaxia Cámaras para Estudiar direccional migración de las células de la próstata

The physiological electric field serves specific biological functions, such as directing cell migration in embryo development, neuronal outgrowth and ...

El objetivo general de este procedimiento es realizar Galvan Axxis, un ensayo para evaluar la migración direccional de las células en un campo eléctrico aplicado. Esto se logra ensamblando primero y luego sembrando una cámara Galvan axxis con las celdas de interés. En el segundo paso, se sella la cámara y se aplica un campo eléctrico para obtener imágenes de lapso de tiempo.En el paso final, se realiza un seguimiento de la velocidad de migración de las celdas individuales y el ángulo relativo al campo eléctrico. En última instancia, cosignatario. Se puede utilizar para mostrar cómo responden las células al campo eléctrico y si migran direccionalmente al cátodo.La principal ventaja de esta técnica es la fácil recuperación de células después de la administración de Texas para análisis secundario y la facilidad con la que la migración se puede filmar a gran aumento y con células marcadas con fluorescencia. La visualización de este método es fundamental, ya que los pasos de ensamblaje de una cámara son difíciles de aprender sin una demostración para ensamblar las cámaras inferiores. Comience limpiando una cámara de plástico galvan axxis con dos propanol.Luego use una jeringa para aplicar un sellador de silicona de grado marino alrededor de las aberturas circulares en la parte inferior de la cámara. Coloque un cubreobjetos grande sobre el sellador y presiónelo en su lugar con el extremo de un aplicador de algodón, limpiando el exceso de pegamento con el hisopo de algodón. A continuación, utiliza un rotulador de punta de diamante para cortar un pequeño cubreobjetos y hacer espacios de seis por 25 milímetros y voltear la cámara.A continuación, utilice una jeringa para aplicar dos tiras de silicona, creando una superficie de canal de 10 por 25 milímetros para la fijación de las células entre las dos aberturas circulares del cristal inferior. A continuación, pega dos espacios de cristal entre las aberturas circulares, empujando los espacios hacia abajo con un nuevo aplicador de algodón y limpiando el exceso de pegamento como se acaba de demostrar. Pruebe la cámara durante 24 horas hasta que el pegamento de silicona esté curado.Al día siguiente, remoje la cámara en agua destilada durante la noche para eliminar los residuos de ácido acético del pegamento antes de sembrar las células en la cámara. Seque y limpie las cámaras con dos propanol como se acaba de demostrar. Lávelos con PB S3 estéril varias veces y luego verifique el flujo de líquido entre las dos aberturas circulares de las cámaras.Después de confirmar que las cámaras están en buenas condiciones de funcionamiento, enciérrelas en placas de cultivo estériles y coloque las cámaras a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Mientras las cámaras están en equilibrio, separe las células prostáticas de su placa de cultivo con cinco mililitros de tripsina EDTA a 37 grados centígrados. Después de cinco minutos, neutralizar la reacción con cinco mililitros de 10%FBS.En PBS, transfiera las celdas separadas a tubos de 15 mililitros y luego centrifugue durante cinco minutos. A 200 veces, G, aspire el medio y luego vuelva a suspender el pellet en un mililitro de medio. Luego, después de contar las células, ajuste la concentración de células a ocho por 10 a las cuatro células por mililitro con medio de cultivo y semilla.350 microlitros de suspensión de la célula en cada cámara. Incubar las células en la cámara durante la noche en una placa de cultivo con una toallita Kim húmeda a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, comience el montaje de las cámaras superiores calentando primero 10 mililitros de cultivo, medio a 37 grados Celsius para cada cámara AXS galvan.Mientras el medio se calienta, transfiera una cámara Galvan axxis de la incubadora a una placa de calentamiento de 37 grados Celsius y enjuague la cámara con medio de cultivo. Para eliminar las celdas sueltas, deje 400 microlitros de medio en la cámara y luego use una jeringa para aplicar grasa de alto vacío en la parte superior de ambos espacios de vidrio. Selle la cámara con un cubreobjetos y un aplicador de algodón, y luego seque la superficie del vidrio.A continuación, aplique la grasa de alto vacío con una jeringa para sellar el espacio entre el cubreobjetos y la cámara. Y luego agregue el medio de cultivo a los depósitos internos. Retire las burbujas y verifique el flujo de líquido entre los depósitos.Para hacer los puentes de agar, corta un par de tubos de PVC de dos pulgadas, dales la vuelta y luego coloca las piezas en un vaso de precipitados de 100 mililitros. A continuación, agregue 200 miligramos de agar bact toe en un matraz de 50 mililitros con 10 mililitros de medio de cultivo para hacer un gel de agar al 2%. Después de calentar en el microondas durante 30 segundos, use una pipeta de transferencia para cargar el gel de agar en el tubo de plástico y deje los puentes de agar a temperatura ambiente durante 10 minutos para solidificar el agar.A continuación, añada dos mililitros de medio de cultivo a los depósitos exteriores de la cámara de gal e inserte los puentes de agar en los depósitos de medio interior y exterior para conducir la corriente y realizar imágenes de lapso de tiempo de la migración. Comience transfiriendo la cámara de Galván a una cámara ambiental de 37 grados Celsius en la etapa del microscopio, asegurando la cámara con cinta adhesiva y enfocándose en las celdas bajo un objetivo de 10x. A continuación, inserte los electrodos Galvan Axxis en los depósitos exteriores con el cátodo en el lado derecho, asegurando el cable y los electrodos con cinta adhesiva.A continuación, encienda la caja de alimentación para aplicar un campo eléctrico a la cámara y utilice un medidor de voltaje para medir el voltaje de salida en la cámara para alcanzar los 2,5 voltios para la cámara de 25 milímetros de largo. Ahora seleccione 10 puntos en la cámara para generar 10 películas de lapso de tiempo y establezca las condiciones de adquisición en intervalos de 10 minutos durante dos horas. Luego comience a filmar y ajuste la corriente de salida según sea necesario para mantener la intensidad del campo durante el experimento.Al final del experimento, retire la cámara del escenario y fije las células en alcohol al 95%. A continuación, abra la cámara. El comprobante se puede guardar para más tarde.Tinción e imagenología. Limpie la cámara para los años futuros. Para cuantificar el Galvan Axxis, gire los vídeos time-lapse para orientar el cátodo a la parte superior de las imágenes.Exporte las películas al software de seguimiento de celdas y rastree manualmente la posición XY de 10 a 20 celdas en cada punto de tiempo de cada película, las distancias de migración y los ángulos relativos a la dirección norte sur, la misma orientación del campo eléctrico se calculará en el software de seguimiento de celdas. Finalmente, guarde las mediciones e importe los datos a una aplicación de base de datos para calcular los resultados combinados. En este experimento representativo de Galván Axxis a líneas de células prostáticas se determinó que migraban a velocidades similares en el transcurso de dos horas.Sin embargo, la direccionalidad al campo eléctrico fue de 0.7 más menos 0.3 para el PRNS de una línea, y de 0.2 más menos 0.8 para el PNT de dos líneas, lo que indica una diferencia significativa en el eje de Galván de estas dos líneas celulares, lo que sugiere que sus mecanismos de señalización celular dirigen las respuestas de migración diferencial al campo eléctrico después del desarrollo del método de Govan Texas. Esta técnica ayuda a los investigadores a explorar los mecanismos de la migración celular direccional en el campo eléctrico.

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Research

Investigación

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Biology

Biología

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