El aislamiento de las poblaciones celulares distinto del cerebelo en desarrollo por Microdissection

Progenitores nestina que expresan son una población recientemente identificado de progenitores neuronales en el cerebelo en desarrollo. Utilizando la técnica de microdisección se presenta aquí en combinación con la clasificación de células activadas por fluorescencia-, esta población de células puede purificarse sin contaminación de otras regiones del cerebelo y puede ser cultivado para estudios posteriores.

El objetivo general de este procedimiento es aislar poblaciones celulares específicas del cerebelo en desarrollo. Esto se logra primero recolectando cerebelo de ratones neonatos portadores de proteínas fluorescentes. El segundo paso del procedimiento es obtener secciones de tejido vivo utilizando un vibrato.

El tercer paso es microdiseccionar la capa germinal externa del cerebelo bajo un microscopio de disección fluorescente. Los pasos finales son disociar el tejido en una sola suspensión celular y recolectar células mediante clasificación de células activadas fluorescentes. En última instancia, los resultados pueden mostrar que se pueden aislar poblaciones celulares específicas del cerebelo.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la captura láser, la microdisección, es que las células están vivas y se pueden cultivar. Para una mayor experimentación Para este procedimiento, esterilice las herramientas quirúrgicas con un autoclave. Obtenga aros frescos o recalentados al 3% de bajo punto de fusión listos para usar en un baño de agua a 37 grados centígrados.

Prepare las soluciones necesarias para la disociación celular basada en papayan. Prepare medios de cultivo NBB 27 frescos. Luego filtre, esterilice y almacene en una incubadora.

Prepare el búfer de fax y prepare los cubreobjetos de poli de lycine. Primera capa de cubreobjetos de autoclave con 100 microgramos de poli de licina por mililitro de agua estéril. A continuación, incubar las cubreobjetos durante dos horas a 37 grados centígrados o toda la noche a temperatura ambiente.

Más tarde, lave los cubreobjetos con agua destilada seguido de medios NBB 27 antes de usar los cubreobjetos. Sécalos por completo. Esto tomará al menos una hora antes de comenzar.

Primero prepare el área de disección. Límpialo con etanol al 70%. A continuación, cúbrelo con una almohadilla absorbente.

En segundo lugar, retire las herramientas de la bolsa de esterilización y colóquelas para su uso. En tercer lugar, cargue un plato con DPBS estéril helado con una tira de bolígrafo al 1% y colóquelo en hielo. Disecciona el cerebro de una cría de P 4 que expresa marcadores fluorescentes.

Luego transfiéralo al plato preparado de DPBS. Use fórceps para separar cuidadosamente el cerebelo del resto del cerebro. Estas cerebelas expresan los marcadores math one, GFP, y anidan en CFP en las que la EGL expresa GFP y la capa molecular es positiva para CFP.

A continuación, llene un molde de inclusión de dos centímetros cúbicos con la solución agrícola. Asegúrate de que no esté a más de 37 grados centígrados. Toma un cerebelo con una cuchara perforada y sécalo con un suave toque de pañuelo.

Luego, con pinzas, colóquelo en el molde. Use una aguja para colocar el cerebelo en orientaciones verticales. Una vez que se cargan unos cuatro en el molde.

Coloque el molde en hielo para que se solidifique rápidamente con una cuchilla de afeitar. Recorte el bloque para reducir el tiempo de seccionamiento. A continuación, pega el bloque a la placa orientado de forma que los cerebelos queden verticales.

Cargue la bandeja de llenado con DPBS helado con correa 1%pent y coloque hielo debajo de la bandeja para que se mantenga fría. Ahora secciona los bloques con un vibrador. Corte y recoja secciones de 600 micras.

Retírelos de la bandeja de hielo con una cuchara perforada y transfiéralos a un plato lleno de A-D-P-B-S con hielo. Bajo microscopio de disección fluorescente. Examina las rodajas lo más rápido posible.

Separe cuidadosamente el EGL del resto de la sección cerebelosa. Utilice pinzas finas para diseccionar entre la capa molecular positiva para CFP y la capa molecular positiva para GFP. Sea muy conservador durante la microdisección para evitar la contaminación de las regiones adyacentes.

Transfiera el tejido EGL positivo para GFP a un nuevo plato lleno de DPBS con hielo. Evite incluir cualquier tejido de capa molecular, ya que esto contaminará el cultivo con anidación que expresa la glía de Bergman. A continuación, retire los agros que rodean el tejido EGL aislado.

El EGL ahora se puede disociar usando un protocolo basado en paan para una suspensión de una sola celda. Una vez completado, vuelva a suspender las celdas en el búfer de fax. Proceda con la recopilación de las celdas CFP mediante fax.

Clasifíquelos con un citómetro de alta velocidad y un filtro CFP y colóquelos en un búfer de fax helado. Se deben obtener alrededor de 100.000 NPS por P cuatro cerebelos. A continuación, centrifugar las células agrupadas a 300 G durante cinco minutos.

Hacer uso inmediato de las células para cultivarlas resus. Suspenderlos en medios NBB 27 precalentados. A continuación, cárguelos en los cubreobjetos recubiertos de lisina poly D.

Las rebanadas de bella de celda se prepararon a partir de P cuatro matemáticas y un nido de GFP en ratones CFP. El análisis de los hechos mostró que más del 85% de las células en el EGL eran GNP convencionales. Las NEP se aislaron de las partes profundas del EGL por microdisección, seguidas de hechos.

Estas células representaron alrededor del 5% de las células en el EGL cuatro días de cultivo. Los hechos aislados de NPS dieron lugar a neuronas expresoras de beta tubulina. Esto es característico de las células progenitoras neuronales restringidas al linaje.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe trabajar rápidamente y mantener el tejido en hielo tanto como sea posible.