Aislamiento y Caracterización cuantitativa inmunocitoquímica de células miogénicas Primarias y fibroblastos de músculo esquelético humano

El objetivo general de este procedimiento es separar las dos principales poblaciones celulares obtenidas de muestras de biopsia muscular humana con una alta eficiencia y rendimiento para permitir la evaluación de marcadores fenotípicos y de factores de transcripción específicos. Esto se logra disociando primero una muestra de biopsia de músculo humano en una suspensión de una sola célula en el segundo paso. Después de un cultivo de siete días, las células se separan mediante perlas inmunomagnéticas que se clasifican en CD 56 positivas, que son células miogénicas, y fracciones CD 56 negativas, que son los fibroblastos.

A continuación, las células se tiñen y se obtienen imágenes para obtener los marcadores fenotípicos y proteicos deseados de interés. En última instancia, la microscopía de inmunofluorescencia y el análisis cuantitativo de imágenes se pueden utilizar para medir la intensidad de los factores de transcripción localizados nucleares seleccionados dentro de las poblaciones celulares clasificadas. Las principales ventajas de esta técnica, que utiliza la clasificación de células inmunomagnéticas sobre los métodos existentes como la clasificación de células activadas por fluorescencia, son que es suave, permite una excelente clasificación de las células musculares primarias humanas con un alto rendimiento y viabilidad y se puede realizar rápidamente.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el aumento de nuestra comprensión de las bases celulares de la degeneración del músculo fibrograso observada en el envejecimiento, así como en una serie de patologías musculares para aislar las células precursoras derivadas del músculo lo antes posible después de obtener la biopsia. Primero, determine el peso de la muestra de tejido y luego hinche el músculo en medio basal varias veces para lavar la muestra y eliminar el exceso de sangre. Deje que el músculo se sedimente a temperatura ambiente durante 30 a 60 segundos y luego aspire todo el tubo, excepto los últimos dos o tres mililitros de medio.

A continuación, invierta el tubo en una placa de Petri estéril para permitir que el líquido restante lleve el músculo a la placa. Ahora limpie la muestra de cualquier pieza visible de cualquier grasa o tejido conectivo obvio. A continuación, gire el plato para movilizar el medio restante, y luego aspire todo el medio y agregue tres mililitros de una solución de colagenasa y enzima disbe por cada 100 a 400 miligramos de tejido, y corte la muestra de músculo en trozos cúbicos muy pequeños de uno a dos milímetros.

Cuando la muestra esté suficientemente picada. Utilice una pipeta de 25 mililitros para transferir los fragmentos de tejido y la solución enzimática a un tubo cónico estéril de 10 a 20 mililitros. Lave la placa con otros tres mililitros de solución enzimática y luego use una pipeta de 10 mililitros para transferir los fragmentos musculares restantes al tubo.

Coloque el tubo a 37 grados centígrados durante 60 minutos. Rehacer la suspensión de tejido cada 15 minutos con una pipeta de 10 mililitros. A continuación, termine la disociación enzimática con al menos una cantidad equivalente de medio de crecimiento fresco recalentado.

A continuación, pase la suspensión celular a través de un filtro de 100 micrómetros para eliminar cualquier pieza grande de desechos y luego centrifugue el resus. Suspenda el pellet en siete u ocho mililitros de medio de crecimiento y luego incube las células en un matraz de cultivo de tejidos T 25 sin recubrimiento. A 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante siete días.

Al final de la semana, la tripsina observa la monocapa celular durante tres minutos. Cuando las células se hayan desprendido, agregue de cinco a 10 mililitros de crecimiento del músculo esquelético, medio para evitar la digestión excesiva y aplique las células por centrifugación. Luego, después del recuento, reserve algunas de las células para la caracterización del marcador de linaje celular y lave las células restantes en 15 mililitros de ganancia de centrífuga PBS.

Esta vez, vuelva a suspender el pellet en 170 microlitros de tampón de clasificación máximo a temperatura ambiente y pipetee suavemente para resus. Suspender las células a 35 microlitros de micro perlas magnéticas conjugadas anti CD 56 anticuerpo anti CD 56 bien mezcladas. Mezcle la solución celular varias veces con pipeta e incube la mezcla durante 15 minutos a cuatro grados centígrados con vegetación suave.

A mitad de camino después de la incubación, lavar la celda y la solución de perlas con 10 mililitros de centrífuga tampón de clasificación y reus. Suspenda el pellet en un mililitro de tampón de clasificación fresco. A continuación, lubrique el filtro de separación de presos y la columna con 500 microlitros de tampón de abastecimiento.

Y luego mezcle y transfiera inmediatamente todo el mililitro de suspensión celular a través del filtro de separación pres y dentro de la columna, enjuague la columna tres veces con un mililitro de lavado a presión de tampón de abastecimiento, recogiendo la fracción de fibroblastos no retenida, pasando a través de la columna a un tubo cónico estéril de 50 mililitros que contiene una pequeña cantidad de medio de crecimiento. A continuación, retire la columna del imán y presione el émbolo en la parte superior de la columna para recoger la fracción de celda positiva CD 56. En un tubo cónico separado de 50 mililitros que contiene crecimiento caliente, se emite un medio de crecimiento medio desde este paso.

Si se va a realizar una doble clasificación, contemple las fracciones de células positivas y negativas recolectadas. Si se requiere una doble fuente para obtener una pureza adicional, no coloque medios en el tubo de recolección positivo CD 56 en la primera clasificación, sino que repita los pasos comenzando desde el filtro y la lubricación de la columna en el punto final experimental apropiado. Fije los cultivos celulares positivos CD 56 en su medio de cultivo, utilizando un volumen equivalente de formaldehído caliente al 8%.

Los 10 minutos con vegetación suave. A continuación, aspire el fijador y lave las células dos veces con PBS para inmunoteñir los antígenos de la superficie celular. Bloquee las células durante al menos una hora en 1%BSA en PBS y, a continuación, etiquete las células con los anticuerpos primarios y secundarios relevantes.

Optimice la ganancia del detector, la potencia del láser y los ajustes de exposición relevantes para su microscopio y tinción. Antes de la obtención de imágenes, las células toman las imágenes de las células en el número deseado de canales de detección y en más de seis campos de visión diferentes. Para el análisis, abra los archivos de imagen TIFF apropiados y arrastre las imágenes entre sí para superponer los canales correspondientes apropiados.

Cada canal aparecerá como una capa separada en el panel de capas. A continuación, en la ventana de análisis, elija seleccionar puntos de datos y, a continuación, personalizar y seleccionar las mediciones deseadas. Para analizar la intensidad de la fluorescencia nuclear, abra el cuadro de diálogo de la gama de colores y seleccione los colores muestreados en el menú desplegable.

A continuación, manteniendo pulsada la tecla Mayús, seleccione los tonos específicos de los núcleos etiquetados. Haga clic en Guardar para almacenar esta máscara de selección de gama de colores para utilizarla con otras imágenes seleccionadas en la misma sesión. Una vez seleccionados los núcleos, escriba clic y seleccione relleno.

A continuación, elija negro en el menú desplegable y confirme que la opacidad está establecida en 100%Siguiente, haga clic en seleccionar e invertir. A continuación, haz clic con el botón derecho del ratón y elige Relleno de nuevo y elige un relleno blanco en el menú desplegable. Realice un algoritmo de cuenca hidrográfica para separar cualquier núcleo parcialmente superpuesto en la capa nuclear ahora binaria.

Vaya a seleccionar, luego a la gama de colores y luego a las sombras para seleccionar los núcleos separados individuales. A continuación, transfiera la selección a la capa que contiene una imagen en escala de grises de 16 bits del marcador deseado y haga clic en registrar medidas. Por último, exporte las mediciones seleccionadas como archivos de texto al software de análisis adecuado para su posterior procesamiento del aceite.

tinción roja de las poblaciones celulares purificadas en combinación con la inmunotinción para marcadores de linaje adipogénicos y miogénicos revela que solo la fracción de fibroblastos es capaz de una diferenciación epigénica con la acumulación masiva de grasa por parte de los fibroblastos visible a simple vista y con una demostración adicional de su transformación completa por la fuerte expresión de PPAR gamma nuclear por estas células en el día 15 de tratamiento. estas células han liberado cualquier antígeno del tejido conectivo TE siete A restante en su sustrato. Por el contrario, las células miogénicas mantienen su fenotipo normal, incluida su expresión de desmina y cadena pesada de miosina sin regulación positiva de la expresión gamma nuclear de PPAR. En esta figura, se muestra un ejemplo del análisis cuantitativo de un campo de células miogénicas positivas de Desmond y el campo del que se obtuvieron estos datos, lo que ilustra la variación de la expresión miogénica en núcleos individuales en esta densidad de siembra y punto de tiempo específicos.

En este gráfico, se demuestra la utilidad del método para comparar directamente los niveles de factores de transcripción en diferentes tipos de células a nivel de célula por célula. Por ejemplo, estos fibroblastos musculares CD 56 negativos expresan un alto nivel del factor de transcripción adipogénico nuclear, PPAR gamma, mientras que las células miogénicas CD 56 positivas mantienen solo niveles muy bajos de factor de transcripción del receptor nuclear después de la exposición al medio inductor de adipocitos. Esta técnica permite a los investigadores en el campo de la biología muscular explorar los mecanismos de las decisiones sobre el destino celular en muestras de músculo humano sanas o patológicas.

Después de ver este video, debe tener, en primer lugar, una buena comprensión de cómo obtener altos rendimientos de células derivadas de músculo humano purificadas y bien caracterizadas y, en segundo lugar, cómo realizar un análisis cuantitativo objetivo de los constituyentes celulares identificados por tinción inmunofluorescente.