Osteoclastos Derivación de médula ósea de ratón

El objetivo general de este procedimiento es aislar osteoclastos de la médula ósea de ratón en grandes cantidades. Esto se logra primero recolectando huesos de ratones sacrificados. A continuación, las células se liberan de la médula ósea mediante el uso de un mortero para triturar los huesos en un tampón de hechos.

Luego, la solución de médula ósea se coloca en capas sobre el medio de separación celular en gradiente de densidad y se lleva a cabo la separación celular en gradiente de densidad. Finalmente, se aspira la capa que contiene las células de interés y las células se colocan en el medio de inducción de micrófagos de la médula ósea. En última instancia, la tinción trampa se utiliza para mostrar la presencia de un gran número de osteoclastos.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia las enfermedades asociadas a la alteración de la función de los osteoclastos, cuya gravedad puede variar desde la enfermedad neonatal letal debido a la incapacidad de formar un espacio medular para la hematopoyesis hasta patologías más comunes como la osteoporosis porque produce un método fiable para aislar un gran número de osteoclastos de la médula ósea del ratón. Para comenzar, lleve 10 mililitros de separación celular en gradiente de densidad disponible comercialmente, medio a temperatura ambiente en un tubo cónico de 50 mililitros. Coloque una alícuota de 50 mililitros de búfer de fax a temperatura ambiente para utilizarla con el medio de separación de células de gradiente de densidad.

Después de preparar medios adicionales y sacrificar un ratón C 57 black six, de acuerdo con el protocolo de texto, coloque el ratón en una tabla de disección y use etanol al 70%. Para rociarlo, cosecha el ojo y el lomo hum de fera tibia. A continuación, coloque los huesos en un tampón de datos sobre hielo.

A continuación, con papel de seda limpio, retire el músculo y el tejido blando de los huesos. Coloque los huesos en un mortero con tres mililitros de tampón y tritúrelos suavemente. A continuación, aspira el líquido manchado de sangre y pásalo a través de un colador de 70 micrómetros a un tubo cónico de 50 mililitros.

Agregue cinco mililitros adicionales de tampón de efectos al hueso triturado y triture aún más antes de transferir el líquido a través del colador al tubo de 50 mililitros. Continúe con este proceso hasta que el líquido ya no se manche de rojo antes de peletizar la médula ósea a 200 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Para realizar una separación en gradiente, aspire los sobrenadantes del pellet de la celda y use 10 mililitros de tampón de fax para reutilizar.

Suspenda el pellet, incline el tubo cónico del medio de separación celular de gradiente de densidad a temperatura ambiente a unos 30 grados y use una pipeta eléctrica con la punta de la pipeta contra la superficie superior interna del tubo. Coloque lentamente la solución de médula ósea en capas sobre el medio utilizando una centrífuga a temperatura ambiente sin aceleración ni desaceleración. Gira el degradado a 200 Gs durante 15 minutos.

A continuación, aspire la capa intermedia turbia, que contiene las células de interés, y transfiéralas a un nuevo tubo cónico. Agregue 20 mililitros de tampón de fax helado para lavar las celdas. A continuación, utilice un mililitro de medio estimulante de micrófagos de médula ósea para resuspender la pastilla celular final después del recuento celular.

Colocó dos mililitros de medio estimulante de micrófagos en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. A continuación, añada 200.000 células a cada pocillo, una densidad celular que garantizará un adecuado cultivo in vitro de osteoclastos. Agitar suavemente la placa e incubar a 37 grados centígrados sin cambiar el medio durante tres días.

Después del tercer día, cambie el medio a medio de inducción de osteoclastos de médula ósea y comience a cambiarlo diariamente durante cinco a siete días. En ese momento deberían ser visibles los osteoclastos multinucleados de gran tamaño. Consulte el protocolo de texto para la tinción y el ensayo de reabsorción, como se ve aquí.

Un alto número de osteoclastos puede confirmarse mediante un ensayo resistente al tartrato. Los osteoclastos que tiñen con fosfatos se visualizan como grandes células púrpuras con múltiples núcleos utilizando el protocolo que se muestra en este video. Es común aislar osteoclastos con hasta 30 núcleos por célula.

El uso de una superficie mineralizada se considera el método de referencia para evaluar la actividad de reabsorción de osteoclastos in vitro. En esta figura, la microscopía de campo claro con un aumento de 10x muestra un porcentaje de superficie mineralizada o pozos de reabsorción que se forman delineados en negro, lo que permite determinar la capacidad de resorción de osteoclastos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar de manera confiable una gran cantidad de osteoclastos de la médula ósea del ratón.