Name: Osteoclastos Derivación de médula ósea de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Aprenda a aislar osteoclastos a partir de médula ósea de ratón en grandes cantidades mediante separación por gradiente de densidad. Este protocolo permite cultivar células in vitro para estudiar biología ósea y enfermedades relacionadas.

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Queremos agradecer el apoyo de subvenciones del NIH R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, la Fundación Oak y el Laboratorio Hagey Pediátrica Medicina Regenerativa.

NOTA: Declaración de Ética: Toda la investigación con animales vertebrados se realizó en los protocolos de Accordance aprobados por el grupo administrativo de expertos de Stanford en Cuidado de Animales de Laboratorio (APLAC). 1. Preparación <ol><li> Permitir 10 ml de medio de separación de células en gradiente de densidad disponible comercialmente (que contiene polysucrose y diatrizoato de sodio, ajustadas a una densidad de 1,077 g / ml) para llegar a RT en un tubo cónico de 50 ml. </li><li> Preparar citometría de flujo (FACS) de tampón de fosfato 1x con solución salina tamponada (PBS) y suero de ternera fetal al 2% (FCS). Tomar una parte alícuota de 50 ml y mantener esta alícuota a temperatura ambiente para su uso durante el paso de los medios de separación de células en gradiente de densidad. </li><li> Tener un cubo de hielo listo para mantener el tejido y las células aisladas durante el procedimiento de aislamiento. </li></ol> 2. Prepare Medios de Cultivo <ol><li> Preparar medio basal: MEM (medio esencial mínimo), sin rojo de fenol (500 ml), glutamato (1x), FCS (10x), 10.000 unidades / ml penicillin (1x). </li><li> Filtra medio basal con un filtro de 0,22 micras. </li><li> Preparar los medios de comunicación de la médula ósea de los macrófagos de inducción: <ol><li> Tomar 50 ml de los medios basales preparado en la etapa 2.1. </li><li> Añadir prostaglandina E2 (PGE2, Sr. 352.465 g / mol) a 10 -7 M concentración final. </li><li> Añadir macrófagos factor estimulante de colonias (M-CSF) a 10 ng / ml. </li><li> No filtrar la solución final de los macrófagos de médula ósea estimulando los medios de comunicación. </li></ol></li><li> Preparar los medios de inducción de los osteoclastos: <ol><li> Tomar 50 ml de los medios basales preparado en la etapa 2.1. </li><li> Añadir prostaglandina E2 (PGE2, Sr. 352.465 g / mol) a 10 -7 M concentración final </li><li> Añadir macrófagos factor estimulante de colonias (M-CSF) a 10 ng / ml. </li><li> Añadir RANKL a 10 ng / ml. </li><li> No filtrar la solución final de los medios de inducción de los osteoclastos. </li></ol></li></ol> 3. Aislamiento de Médula Ósea <ol><li> La eutanasia a un ratón C57BL / 6usando el método de inhalación de dióxido de carbono, seguido por dislocación cervical. NOTA: Los roedores deben ser sacrificados por personal capacitado utilizando una técnica, equipos y agentes apropiados. </li><li> Coloque y asegure el ratón sobre una tabla de disección y rociar con alcohol al 70%. </li><li> Diseccionar el fémur, la tibia, el húmero y la columna vertebral. <ol><li> Comience con el ratón en la posición supina. Hacer una incisión vertical a lo largo de la extremidad inferior y comenzar mediante la disección a lo largo de la longitud del fémur y la tibia dividiendo los archivos adjuntos de tejidos blandos. Por último, dislocar huesos de la articulación de la rodilla y de la cadera para liberar a los huesos del esqueleto completo. </li><li> Proceder a realizar una incisión a lo largo de la longitud de la extremidad superior para aislar el húmero. Dislocar el húmero en las articulaciones del hombro y del codo mediante la disección suave inserción capsular tejido. </li><li> Por último, gire el ratón sobre, por lo que el ratón está en decúbito prono. Hacer una incisión en la piel a lo largo de la longitud de la columna vertebral, en la línea media. Observe el suave paravertebraltejido en cada lado de la columna vertebral y de incisión a lo largo del borde óseo de la columna vertebral, la disección a través de la masa de tejido blando paravertebral. Usando unas tijeras, hacer un corte horizontal a través de la columna vertebral en la base del cuello, y al final de la columna vertebral, justo proximal a la inserción de la cola, liberando la columna vertebral de la fijación del tejido blando. </li></ol></li><li> Una vez que los huesos se cosechan, mantenerlos en tampón FACS en el hielo. </li><li> Utilice un pañuelo de papel para limpiar el músculo y los tejidos blandos de los huesos. </li><li> Coloque los huesos limpios en un mortero con 3 ml de tampón FACS. </li><li> Aplastar los huesos suavemente en el mortero. </li><li> Aspirar el líquido manchado de sangre y la transferencia en un tubo cónico de 50 ml pasando la solución a través de un filtro de células de 70 micras. </li><li> Añadir 5 ml de tampón FACS al hueso triturado y aplastar aún más. Una vez más, extraer el líquido con una pipeta y transferir al tubo cónico de 50 ml a través de un filtro de 70 micras. </li><li> Normalmente aplastar el twi huesosce a tres veces en tampón FACS fresco, utilizando un mortero y mano de mortero, añadiendo cada vez otros 5 ml de tampón de FACS fresca, hasta que el líquido no mancha roja. </li><li> Centrifugar la solución de médula ósea a 200 xg durante 5 min a 4 ° C para producir un sedimento celular. </li></ol> 4. Separación de degradado de células de médula ósea <ol><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender en 10 ml de tampón de FACS (mantenida a temperatura ambiente). </li><li> Tome el tubo cónico de 50 ml que contiene 10 ml de medio de separación de células en gradiente de densidad disponible comercialmente (RT). </li><li> Capa de la solución de la médula ósea en los medios de separación de células en gradiente de densidad. Haga esto lentamente utilizando una pipeta eléctrica. Ángulo de la punta de la pipeta contra la superficie interior cerca de la parte superior del tubo cónico y inclinar el tubo cónico a aproximadamente 30 °. El uso de un ajuste de velocidad lenta en la pipeta, expulsar suavemente la solución de la médula ósea a fin de no perturbar el medio de separación de células en gradiente de densidad. NOTA: En última instancia habráser una definición clara entre las dos soluciones (solución celular y medios de solución de separación de células en gradiente de densidad). </li><li> El uso de una centrífuga RT, centrifugar los medios de separación de células de gradiente de densidad y solución de células en una centrífuga equilibrada a 200 xg durante 15 min. Además, eliminar la aceleración y desaceleración en la centrífuga para garantizar la separación de fases adecuada utilizando el gradiente de densidad de gradiente de medios de separación de células. </li><li> Después de la centrifugación, aspirar fuera de la capa media nublado que contiene las células de médula ósea de interés. </li><li> Transferir estas células en un nuevo tubo cónico. Añadir 20 ml de tampón de FACS adicional (mantener en hielo) para lavar las células. </li><li> Centrifugar a 200 xg durante 5 min a 4 ° C para producir un sedimento celular. </li><li> Resuspender el sedimento celular final en 1 ml de macrófagos estimulante de los medios de comunicación para permitir el recuento de células usando un hemocitómetro. </li></ol> 5. Conteo Celular <ol><li> Tomar 10 l de la solución de células y mezclarcon 10 l de azul de tripano. Cargar 10 l de la mezcla resultante en un hemocitómetro y obtener el recuento de células por ml de solución. </li></ol> El cultivo 6. celular <ol><li> Coloque 2 ml de medio de macrófagos estimulante en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. </li><li> Añadir 200.000 células a cada pocillo. NOTA: En nuestra experiencia, la densidad celular de galvanoplastia es uno de los requisitos más importantes para la adecuada en el cultivo in vitro de los osteoclastos. </li><li> Agitar suavemente la placa y el lugar en una incubadora normal a 37 ° C. </li><li> No cambie los medios de comunicación durante 3 días. </li><li> Después de 3 días en los medios de comunicación de macrófagos estimulante, cambiar los medios de comunicación para medios de comunicación de los osteoclastos. </li><li> De aquí en adelante, cambiar los medios de comunicación al día durante 5-7 días, y en ese momento, grandes osteoclastos multinucleadas, debe ser visible en la placa de cultivo. </li></ol> 7. La tinción con tartrato resistente a la fosfatasa ácida (TRAP) <ol><li> Después de 5-7 días de in vitro cultura, aspirar los medios de comunicación desde la cultura también. </li><li> Lave los pozos suavemente con 1x PBS tres veces. </li><li> Fijar las células mediante la adición de solución de paraformaldehído al 4% y se deja durante 1 hora a 4 ° C. </li><li> Durante este tiempo, preparar la mancha TRAP (que está disponible comercialmente) por el pre-calentamiento a 37 ° C. </li><li> Después de 1 hora en paraformaldehído, aspirar fuera de paraformaldehído y lavar suavemente 3 veces con PBS 1x. </li><li> Añadir 1 ml de tinción TRAP pre-calentado en cada pocillo de la placa para ser teñido. </li><li> Colocar la placa en una incubadora a 37 ° C durante 1 hora, protegida de la luz. </li><li> Después de 1 hora, aspirar fuera de la mancha TRAP. </li><li> Lavar los pocillos 3 veces con agua desionizada precalentada. </li><li> Contratinción el bien con hematoxilina de Gill (PRECAUCIÓN) durante 1-2 minutos. </li><li> Osteoclastos imagen usando microscopía de campo brillante. </li><li> Lavar los pocillos con agua desionizada hasta una intensidad de color adecuada de la mancha se logra, típicamente cuando los núcleos aparecen blue. </li></ol> 8. La resorción de osteoclastos ensayo <ol><li> Utilice una placa de cultivo comercialmente disponible de poliestireno de 24 pocillos que se pre-recubrieron con sustrato óseo o un recubrimiento de fosfato de calcio cristalino inorgánico. </li><li> Coloque 2 ml de medio de macrófagos estimulante en cada pocillo. </li><li> Añadir 200.000 células de médula ósea recién aisladas obtenidos al final de la etapa 2 a cada pocillo. </li><li> Agitar suavemente la placa antes de colocarlo en una incubadora a 37 ° C durante 3 días. </li><li> El día 3, cambiar los medios de comunicación para medios de comunicación diferenciación de los osteoclastos. </li><li> Realizar cambios de medios de comunicación diaria con los medios de comunicación diferenciación de los osteoclastos durante 5-7 días. </li></ol> 9. Cuantificación de osteoclastos Reabsorción Actividad <ol><li> Después de 5-7 días de cultivo in vitro en medios de diferenciación de los osteoclastos sobre un sustrato mineralizado, analizar la superficie mineralizada, como se describe a continuación, para evaluar la capacidad de los osteoclastos para formar resorptien pozos, un indicador de la actividad osteoclástica. </li><li> Aspirar los medios de comunicación a partir de la placa de ensayo de resorción y añadir 100 l de solución de lejía al 10% a cada pocillo. </li><li> Se incuban las células con la solución de lejía al 10% durante 15 min a TA. </li><li> Lavar los pocillos 3 veces con agua destilada. </li><li> Aspirar fuera de cualquier resto de agua y sacuda el exceso de agua de la placa y dejar secar al aire durante 3-5 horas. </li><li> Contratinción la placa con un kit de tinción de Von Kossa disponible comercialmente para permitir la fácil visualización del sustrato un-reabsorbido. </li><li> Utilice la microscopía de campo claro para tomar imágenes de partes representativas de la superficie reabsorbido. </li><li> El uso de software de análisis de imagen, calcular el porcentaje de la superficie reabsorbido para permitir la cuantificación de la actividad de resorción osteoclástica. </li></ol>

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Ninguno de los autores tiene divulgación o conflicto de intereses que declarar.

Una capacidad de aislar fácilmente y cultivar un gran número de osteoclastos in vitro ha sido responsable de ayudar a avanzar en la comprensión de la biología del hueso y los osteoclastos mediada por enfermedades. Era la identificación de RANKL que conducen a esto, cuando se identificó recientemente como el principal regulador de la formación de osteoclastos, la diferenciación y la supervivencia 16-18. Ha sido nuestra experiencia que el cultivo in vitro de los os...

El remodelado óseo es dinámico e implica el acoplamiento de la formación de hueso con la resorción ósea 1. Este proceso estrechamente regulado es responsable de mantener el esqueleto durante la homeostasis normal, y en respuesta a la lesión y la enfermedad. Los osteoclastos son células multinucleadas únicos, que son capaces de resorción tanto las matrices orgánicas e inorgánicas de hueso. Los osteoclastos se derivan del linaje de monocitos / macrófagos de la médula ósea 2-5. Las anormalidades en la función o la formación de osteoclastos puede resultar en una variedad de patologías clínicas, incluyendo las condiciones comunes como la osteoporosis. La capacidad de generar los osteoclastos in vitro ha permitido importantes avances en nuestra comprensión de la biología del hueso 6. Como resultado, los nuevos agentes terapéuticos están surgiendo para tratar enfermedades relacionadas con osteoclastos que son responsables de morbilidades y mortalidades significativas 7 </sarriba&gt;. Mantenimiento homeostático de la masa ósea y la fuerza requiere la acción concertada de los osteoblastos forman el hueso y los osteoclastos de resorción ósea 8,9. La homeostasis ósea está alterado en un número de enfermedades, incluyendo la osteoporosis post-menopáusica, en el que aumentó la actividad de los osteoclastos conduce a la pérdida patógena de masa y densidad ósea 10. Con el aumento de la disponibilidad de modelos murinos transgénicos de enfermedades humanas, hay más oportunidades para descifrar la función de los osteoclastos en la enfermedad ósea humana 11-13. Numerosos protocolos para técnicas de cultivo de osteoclastos aparecen en la literatura, con muchas variaciones describen 9,12,14. Xing y sus colegas describen metodología similar con el protocolo descrito a continuación, en su descripción de los ensayos de osteoclastogenic a partir de células de médula ósea murina. Sin embargo, para liberar las células de la médula ósea después de la cosecha de los huesos largos, Xing et al. Enjuagar la cavidad ósea con α-MEM medio completo14. Catalfamo examina el efecto de la hiperglucemia sobre la función de los osteoclastos y describe un método en el que todas las células movilizadas por lavado de la médula ósea se cultivan durante 24 h, momento en el cual las células no adherentes se descartan 12, una técnica también utilizada por Boyle et al . 9 Estos protocolos publicados anteriormente requieren la práctica de lavado de la médula ósea, una práctica tediosa, que también introduce el riesgo de una lesión por pinchazo de aguja y la pérdida de valiosa médula ósea, como se debe cortar en ambos extremos del hueso. El protocolo, que se describen, implementa el uso de un mortero y mano de mortero para aislar los osteoclastos, que es similar al método de aislamiento de macrófagos descrito por Weischenfeldt et al. 15 Nuestra experiencia, sin embargo, es que el aislamiento de los osteoclastos y cultivo in vitro usando técnicas de resultados previamente publicados en los resultados variables en términos de producción de los osteoclastos, resultando a menudoen una incapacidad para cultivar los osteoclastos. Por lo tanto, hemos ideado un protocolo que permite el aislamiento consistente de médula ósea de ratón para producir un gran número de osteoclastos multinucleados in vitro, con un rendimiento aproximado del 70-80% de células sembradas inicialmente la formación de macrófagos y osteoclastos, posteriormente, en presencia de medios de inducción de los osteoclastos.

<table><tbody><tr><td>MEM, sin glutamina, sin rojo fenol</td><td>Gibco</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF, ratón recombinante</td><td>Gibco</td><td>PMC2044</td><td></td></tr><tr><td>Ratón recombinante TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expresado)</td><td>R& D Systems</td><td>462-TEC-010</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandina E2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Kit de fosfatasa ácida, lecocitos (TRAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Placas de reabsorción ósea de osteoensayo, placas de 24 pocillos</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3987</td><td></td></tr></tbody></table>

osteoclastos derivación de médula ósea de ratón

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

<html> Los osteoclastos son células altamente especializadas que se derivan del linaje de monocitos / macrófagos de la médula ósea. Su capacidad única para reabsorber tanto las matrices orgánicas e inorgánicas de hueso significa que juegan un papel clave en la regulación de la remodelación esquelética. Juntos, los osteoblastos y los osteoclastos son responsables para el proceso de acoplamiento dinámico que implica tanto la resorción ósea y la formación ósea actuando juntos para mantener el esqueleto normal durante la salud y la enfermedad. Como la célula de resorción ósea principal en el cuerpo, los cambios en la diferenciación o la función de los osteoclastos pueden resultar en efectos profundos en el cuerpo. Enfermedades asociadas con la función de los osteoclastos alterada pueden variar en severidad de la enfermedad neonatal letal debido a un fallo para formar un espacio para la hematopoyesis de la médula, a patologías tales como la osteoporosis, en la que la resorción ósea osteoclástica excesiva predispone a la fractura de la formación observado más comúnmente. ent &quot;&gt; Una capacidad de aislar los osteoclastos en grandes cantidades in vitro ha permitido avances significativos en la comprensión del ciclo de remodelación ósea y ha allanado el camino para el descubrimiento de nuevas estrategias terapéuticas que combaten estas enfermedades. A continuación, describimos un protocolo para aislar y cultivar los osteoclastos de médula ósea de ratón que producirá un gran número de osteoclastos.

El objetivo de este método fue aislar fácilmente un gran número de osteoclastos in vitro, normalmente en una semana. Éxito en el aislamiento de un gran número de osteoclastos se confirmó mediante la tinción de fosfatasa ácida resistente al tartrato (Figura 1A). Las grandes osteoclastos se visualizan como células grandes de color púrpura con múltiples núcleos (normalmente ≥ 3 núcleos). Usando este protocolo, es común para aislar los osteoclastos con hasta 30 núcleos por los osteoclastos ...

Los osteoclastos son las células de resorción ósea principal en el cuerpo. La capacidad para aislar los osteoclastos en grandes cantidades ha resultado en avances significativos en el entendimiento de la biología de los osteoclastos. En este protocolo, se describe un método para el aislamiento, cultivo y la cuantificación de la actividad de los osteoclastos in vitro.

Osteoclastos Derivación de médula ósea de ratón

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar osteoclastos de la médula ósea de ratón en grandes cantidades. Esto se logra primero recolectando huesos de ratones sacrificados. A continuación, las células se liberan de la médula ósea mediante el uso de un mortero para triturar los huesos en un tampón de hechos.Luego, la solución de médula ósea se coloca en capas sobre el medio de separación celular en gradiente de densidad y se lleva a cabo la separación celular en gradiente de densidad. Finalmente, se aspira la capa que contiene las células de interés y las células se colocan en el medio de inducción de micrófagos de la médula ósea. En última instancia, la tinción trampa se utiliza para mostrar la presencia de un gran número de osteoclastos.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia las enfermedades asociadas a la alteración de la función de los osteoclastos, cuya gravedad puede variar desde la enfermedad neonatal letal debido a la incapacidad de formar un espacio medular para la hematopoyesis hasta patologías más comunes como la osteoporosis porque produce un método fiable para aislar un gran número de osteoclastos de la médula ósea del ratón. Para comenzar, lleve

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este video, demostramos el aislamiento y cultivo de células estromales de médula ósea a partir de huesos largos de ratones. Las BMSC adherentes aisladas se pueden utilizar para un análisis posterior.

Aislamiento y cultivo de células estromales de médula ósea de una tibia de ratón

Notch de 'jove_content es una forma de comunicación celular que se basa en el contacto directo entre células. Para inducir correctamente la señalización de Notch in vitro, los ligandos de Notch deben presentarse a las células en un estado inmovilizado. Este protocolo describe los métodos para la estimulación in vitro de la señalización de Notch en precursores de osteoclastos de ratón.

La estimulación de la señalización de Notch en el ratón osteoclastos precursores

Este protocolo describe el desarrollo de un en vitro preclínicos modelo humano de osteoclastogénesis de monocitos de sangre periférica con líneas de celulares de cáncer de mama para imitar la interacción de osteoclastos células de cáncer. El modelo podría utilizarse para mejorar nuestra comprensión de la formación de metástasis ósea y mejorar las opciones terapéuticas.

Desarrollo de un modelo humano de preclínico de osteoclastogénesis de monocitos de sangre periférica cultivadas conjuntamente con líneas de células de cáncer de mama

Este manuscrito describe un protocolo para aislar y la cultura osteoclastos en vitro de médula ósea de ratón y para estudiar el papel de lo mamíferos/mecanicista Diana de la rapamicina 1 complejo en la formación de osteoclastos.

Una base de RANKL osteoclasto cultura ensayo de médula ósea de ratón para investigar el papel de mTORC1 en la formación de osteoclastos

En este artículo se presentan métodos para aislar y diferenciar las células estromales de médula ósea y células madre hematopoyéticas de los huesos largos de ratón. Dos protocolos diferentes presentan rendimiento diferentes poblaciones celulares adecuadas para la expansión y diferenciación a osteoclastos, osteoblastos y adipocitos.

Aislamiento, cultivo y diferenciación de células estromales de médula ósea y progenitores de los osteoclastos de los ratones

El número de nuevos biomateriales ingeniería para reparar las lesiones del hueso grande está en continua expansión con el objetivo de acelerar la cicatrización ósea y superar las complicaciones asociadas con el trasplante de hueso. Aquí, presentamos una estrategia multidisciplinaria para las pruebas de biocompatibilidad preclínico de Biomateriales para la reparación de hueso.

Perfil de compatibilidad biológica de Biomateriales para regeneración ósea

Los osteoclastos son policaryones de macrófagos específicos de los tejidos derivados del linaje de monocitos y macrófagos de las células madre hematopoyéticas. Este protocolo describe cómo aislar las células de la médula ósea de manera que se obtengan grandes cantidades de osteoclastos reduciendo el riesgo de accidentes encontrados en los métodos tradicionales.

Aislamiento, purificación y diferenciación de los precursores de osteoclastos de la médula ósea de rata

Los osteoclastos son células clave de reabsorción ósea en el cuerpo. Este protocolo describe un método fiable para la diferenciación in vitro de osteoclastos a partir de monocitos de sangre periférica humana. Este método se puede utilizar como una herramienta importante para comprender mejor la biología de los osteoclastos en la homeostasis y en las enfermedades.

Diferenciación de osteoclastos funcionales de monocitos CD14+ de sangre periférica humana

Este protocolo presenta la diferenciación de osteoclastos humanos de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) y describe métodos para la caracterización de osteoclastos y precursores de osteoclastos.

Diferenciación y caracterización de osteoclastos a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas

El presente protocolo describe un método rentable para purificar, expandir y caracterizar células madre mesenquimales de médula ósea (BMSC) altamente homogéneas de ratones. Este enfoque facilita la adquisición de grandes cantidades de BMSCs con alto potencial de proliferación y diferenciación, apoyando modelos de ratón y avanzando en la investigación preclínica.

Fenotipado basado en purificación, expansión y citometría de flujo de células madre mesenquimales de médula ósea derivadas de ratón

El modelo de lesión de la médula ósea murina es una herramienta útil para estudiar la osteogénesis postnatal a través de la osificación intramembranosa. Este protocolo quirúrgico simplificado describe el procedimiento de ablación de la médula ósea para la evaluación posterior de la formación de hueso nuevo y las respuestas celulares después de una lesión.

Metodología mejorada para el estudio de la osteogénesis postnatal mediante osificación intramembranosa en un modelo de lesión de médula ósea murina

Aprenda a aislar osteoclastos a partir de médula ósea de ratón en grandes cantidades mediante separación por gradiente de densidad. Este protocolo permite cultivar células in vitro para estudiar biología ósea y enfermedades relacionadas.

Osteoclastos Derivación de médula ósea de ratón

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