Desarrollo de un modelo humano de preclínico de osteoclastogénesis de monocitos de sangre periférica cultivadas conjuntamente con líneas de células de cáncer de mama

Este protocolo describe el desarrollo de un en vitro preclínicos modelo humano de osteoclastogénesis de monocitos de sangre periférica con líneas de celulares de cáncer de mama para imitar la interacción de osteoclastos células de cáncer. El modelo podría utilizarse para mejorar nuestra comprensión de la formación de metástasis ósea y mejorar las opciones terapéuticas.

El objetivo general de este modelo preclínico humano in vitro de osteoclastogénesis derivado de monocitos de sangre periférica, o PBMC, cultivados con líneas celulares de cáncer de mama es imitar las interacciones de los osteoclastos de las células cancerosas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la metástasis ósea sobre los efectos de la interacción entre las células cancerosas y las células óseas dentro del microambiente óseo. La principal ventaja de esta técnica es que se trata de un modelo preclínico totalmente humano.

Además, este método puede proporcionar información sobre la metástasis ósea. También se puede aplicar al estudio de otros mecanismos patológicos relacionados con los huesos, como la osteoporosis. Las personas nuevas en este método pueden tener dificultades debido a la variabilidad entre los donantes sanos y en la selección de la densidad de células PBMC adecuada.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que necesitan ver nuestros pasos de selección y siembra de PBMC requieren cierta experiencia manual antes de que se pueda lograr la competencia. Comience diluyendo al menos 20 mililitros de sangre entera de donante sano en EDTA en una proporción de uno a uno en PBS. Después de mezclar bien, divida la solución sanguínea en alícuotas de 30 mililitros en tubos cónicos de 50 mililitros.

Aplique cuidadosamente 15 mililitros de medio de separación de linfocitos en el fondo de cada tubo. Separar las células mediante centrifugación en gradiente de densidad. Y coloque la célula mononuclear blanca que contiene capas leucocitarias en un nuevo tubo de 15 mililitros.

Lave las células recolectadas dos veces en 20 mililitros de PBS por lavado, seguido de la lisis de los glóbulos rojos con cinco mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos durante tres a cinco minutos, en hielo. Detenga la reacción con 20 mililitros de PBS y recoja los glóbulos blancos por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet y complete alpha M-E-M para contar.

A continuación, coloque las células en una concentración de siete coma cinco veces 10 por cinco PBMC por centímetro cuadrado en cada pocillo de una placa de 24 pocillos para su incubación a 37 grados centígrados y cinco por ciento de CO2. Después de unas tres horas, retire el sobrenadante, los desechos, las células sueltas y los eritrocitos no lisados de los cultivos. Y agregue medio fresco, complementado con MCSF.

Catorce días después de la siembra, lave las células dos veces con PBS y fíjelas en paraformaldehído al cuatro por ciento durante 20 minutos a temperatura ambiente. Realice la tinción de trampas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células tipo osteoclasto serán positivas para TRAP con al menos cuatro núcleos.

Cuente las células similares a los osteoclastos manualmente bajo el microscopio con un aumento de 10X. Para la diferenciación osteoclástica inducida por células cancerosas, cuando las células cancerosas alcanzan el noventa por ciento de confluencia, se separan por tripsinización y se siembran en inserciones de poros de cuatro micrómetros de punto cero a una concentración de cuatro veces 10 por centímetro cuadrado en alfa MEM fresco. Al día siguiente, coloque los insertos sembrados sobre cultivos de células mononucleares en placa indiferenciadas de un día en alfa M-E-M completo, y cambie el medio cada dos o tres días.

A continuación, 11 días después del inicio del cocultivo, transfiera los insertos a una nueva placa que contenga el reactivo adecuado para el análisis posterior deseado. Las células de cáncer de mama pueden mantener la osteoclastogénesis, ya que el número de osteoclastos en los pocillos inducidos por las células cancerosas es similar al obtenido en los pocillos de control con factor de crecimiento positivo. Sin embargo, el número de osteoclastos observados en todos los cultivos se reduce cuando las células se tratan con un fármaco antitumoral.

Curiosamente, las áreas superficiales de los osteoclastos maduros derivados de factores de crecimiento son mayores que las inducidas por las células cancerosas. Este efecto no se observa en cultivos tratados con fármacos antitumorales. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en siete ocho horas si se realiza correctamente.

Después de este procedimiento, se pueden realizar análisis posteriores adicionales como análisis de expresión génica, Western Blot, análisis de inmunofluorescencia o ELISA para responder preguntas adicionales sobre las interacciones entre las células cancerosas y las células óseas o sobre los mecanismos de los fármacos antitumorales. Tras su desarrollo, esta técnica abrió el camino para que los investigadores en el campo de la metástasis ósea estudiaran el microambiente óseo, en un modelo preclínico totalmente humano. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cocultivar monocitos, someterse a la diferenciación con células cancerosas.

No olvide que trabajar con muestras biológicas y medicamentos puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y batas de laboratorio mientras se realiza este procedimiento.