Desarrollo de un modelo humano de preclínico de osteoclastogénesis de monocitos de sangre periférica cultivadas conjuntamente con líneas de células de cáncer de mama
13 de septiembre de 2017
Este protocolo describe el desarrollo de un en vitro preclínicos modelo humano de osteoclastogénesis de monocitos de sangre periférica con líneas de celulares de cáncer de mama para imitar la interacción de osteoclastos células de cáncer. El modelo podría utilizarse para mejorar nuestra comprensión de la formación de metástasis ósea y mejorar las opciones terapéuticas.
El objetivo general de este modelo preclínico humano in vitro de osteoclastogénesis derivado de monocitos de sangre periférica, o PBMC, cultivados con líneas celulares de cáncer de mama es imitar las interacciones de los osteoclastos de las células cancerosas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la metástasis ósea sobre los efectos de la interacción entre las células cancerosas y las células óseas dentro del microambiente óseo. La principal ventaja de esta técnica es que se trata de un modelo preclínico totalmente humano.
Además, este método puede proporcionar información sobre la metástasis ósea. También se puede aplicar al estudio de otros mecanismos patológicos relacionados con los huesos, como la osteoporosis. Las personas nuevas en este método pueden tener dificultades debido a la variabilidad entre los donantes sanos y en la selección de la densidad de células PBMC adecuada.
La demostración visual de este método es fundamental, ya que necesitan ver nuestros pasos de selección y siembra de PBMC requieren cierta experiencia manual antes de que se pueda lograr la competencia. Comience diluyendo al menos 20 mililitros de sangre entera de donante sano en EDTA en una proporción de uno a uno en PBS. Después de mezclar bien, divida la solución sanguínea en alícuotas de 30 mililitros en tubos cónicos de 50 mililitros.
Aplique cuidadosamente 15 mililitros de medio de separación de linfocitos en el fondo de cada tubo. Separar las células mediante centrifugación en gradiente de densidad. Y coloque la célula mononuclear blanca que contiene capas leucocitarias en un nuevo tubo de 15 mililitros.
Lave las células recolectadas dos veces en 20 mililitros de PBS por lavado, seguido de la lisis de los glóbulos rojos con cinco mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos durante tres a cinco minutos, en hielo. Detenga la reacción con 20 mililitros de PBS y recoja los glóbulos blancos por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet y complete alpha M-E-M para contar.
A continuación, coloque las células en una concentración de siete coma cinco veces 10 por cinco PBMC por centímetro cuadrado en cada pocillo de una placa de 24 pocillos para su incubación a 37 grados centígrados y cinco por ciento de CO2. Después de unas tres horas, retire el sobrenadante, los desechos, las células sueltas y los eritrocitos no lisados de los cultivos. Y agregue medio fresco, complementado con MCSF.
Catorce días después de la siembra, lave las células dos veces con PBS y fíjelas en paraformaldehído al cuatro por ciento durante 20 minutos a temperatura ambiente. Realice la tinción de trampas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células tipo osteoclasto serán positivas para TRAP con al menos cuatro núcleos.
Cuente las células similares a los osteoclastos manualmente bajo el microscopio con un aumento de 10X. Para la diferenciación osteoclástica inducida por células cancerosas, cuando las células cancerosas alcanzan el noventa por ciento de confluencia, se separan por tripsinización y se siembran en inserciones de poros de cuatro micrómetros de punto cero a una concentración de cuatro veces 10 por centímetro cuadrado en alfa MEM fresco. Al día siguiente, coloque los insertos sembrados sobre cultivos de células mononucleares en placa indiferenciadas de un día en alfa M-E-M completo, y cambie el medio cada dos o tres días.
A continuación, 11 días después del inicio del cocultivo, transfiera los insertos a una nueva placa que contenga el reactivo adecuado para el análisis posterior deseado. Las células de cáncer de mama pueden mantener la osteoclastogénesis, ya que el número de osteoclastos en los pocillos inducidos por las células cancerosas es similar al obtenido en los pocillos de control con factor de crecimiento positivo. Sin embargo, el número de osteoclastos observados en todos los cultivos se reduce cuando las células se tratan con un fármaco antitumoral.
Curiosamente, las áreas superficiales de los osteoclastos maduros derivados de factores de crecimiento son mayores que las inducidas por las células cancerosas. Este efecto no se observa en cultivos tratados con fármacos antitumorales. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en siete ocho horas si se realiza correctamente.
Después de este procedimiento, se pueden realizar análisis posteriores adicionales como análisis de expresión génica, Western Blot, análisis de inmunofluorescencia o ELISA para responder preguntas adicionales sobre las interacciones entre las células cancerosas y las células óseas o sobre los mecanismos de los fármacos antitumorales. Tras su desarrollo, esta técnica abrió el camino para que los investigadores en el campo de la metástasis ósea estudiaran el microambiente óseo, en un modelo preclínico totalmente humano. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cocultivar monocitos, someterse a la diferenciación con células cancerosas.
No olvide que trabajar con muestras biológicas y medicamentos puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y batas de laboratorio mientras se realiza este procedimiento.
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Visión general
Este protocolo describe el desarrollo de un modelo preclínico humano in vitro de osteoclastogénesis a partir de monocitos de sangre periférica cultivados con líneas celulares de cáncer de mama para imitar la interacción célula cancerosa-osteoclastos. Este modelo puede ayudar a responder preguntas clave sobre la metástasis ósea y mejorar las opciones terapéuticas.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Osteoclastogénesis
- Metástasis ósea
- Interacciones de células cancerosas
Antecedentes
- El modelo utiliza monocitos de sangre periférica (PBMCs).
- Tiene como objetivo replicar las interacciones entre células cancerosas y osteoclastos.
- Esta investigación es importante para entender patologías relacionadas con los huesos.
- La variabilidad entre donantes sanos puede afectar los resultados.
Propósito del estudio
- Imitar las interacciones célula cancerosa-osteoclastos.
- Investigar los efectos de estas interacciones dentro del microambiente óseo.
- Proporcionar información sobre la metástasis ósea y condiciones relacionadas.
Métodos utilizados
- Cultivo de PBMCs con líneas celulares de cáncer de mama.
- Evaluación de la osteoclastogénesis.
- Evaluación de las interacciones entre células cancerosas y células óseas.
- Análisis de la variabilidad en la densidad celular de PBMCs.
Resultados principales
- El modelo imita con éxito las interacciones célula cancerosa-osteoclastos.
- Los conocimientos adquiridos pueden informar estrategias terapéuticas para la metástasis ósea.
- Las aplicaciones potenciales se extienden a otras enfermedades relacionadas con los huesos.
- Los desafíos incluyen la variabilidad de los donantes y la selección de la densidad celular adecuada.
Conclusiones
- Este modelo preclínico humano es valioso para estudiar la metástasis ósea.
- Mejora la comprensión de las interacciones de las células cancerosas en el microambiente óseo.
- Estudios futuros pueden aprovechar este modelo para aplicaciones más amplias en patología ósea.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This fully human preclinical model enables mechanistic de-risking of osteoclastogenic pathways in bone metastasis by recapitulating cancer cell-osteoclast crosstalk in a physiologically relevant system. It supports target validation and assay development for anti-tumor therapeutics by providing quantitative readouts of osteoclast differentiation and function. The model enhances predictive confidence in lead identification by allowing direct observation of reciprocal interactions and downstream analysis of both cell types under drug treatment conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding tumor-induced osteoclastogenesis and pathway clarification in the bone microenvironment.
- Operational Value: Supports biological de-risking and functional target validation by modeling osteoclast differentiation from primary human monocytes under defined co-culture conditions.
- Scientific Value: Facilitates predictive confidence and portfolio triage by quantifying osteoclast formation in response to cancer cell stimuli versus growth factor controls.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows through standardized osteoclast differentiation from PBMCs using RANKL and MCSF.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility via fixed cell density seeding (7.5×10⁵ PBMC/cm²) and timed differentiation (14 days) with TRAP-based osteoclast quantification.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation by testing drug effects on osteoclastogenesis in both indirect (conditioned medium) and direct co-culture formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease relevance modeling for osteoporosis and other bone conditions through adaptation of the osteoclastogenesis assay.
- Operational Value: Ensures translational continuity by using fully human cells, reducing species translation risk in preclinical-to-clinical extrapolation.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by measuring changes in osteoclast number and surface area as pharmacodynamic biomarkers of drug efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for bone-targeted therapies and bone microenvironment modulators.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cancer cell-derived factors in osteoclast activation and pathway clarification of RANKL-independent osteoclast induction mechanisms.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized monocyte isolation, differentiation, and co-culture with breast cancer cell lines on permeable inserts for paracrine and juxtacrine signaling studies.
- Analytics: Provides quantitative osteoclast readouts via TRAP staining, multinucleated cell counting, and morphometric analysis (surface area) to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling study of drug effects on the metastatic bone microenvironment using clinically relevant breast cancer cell lines.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for studying osteoclast modulation across multiple cancer types and bone pathologies beyond breast cancer.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in osteoclast-cancer cell interactions.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined PBMC isolation, seeding density, and cytokine supplementation protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of drug effects on osteoclast formation and function, reducing late-stage biological risk in bone metastasis programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by quantifying osteoclastogenic potential of compounds and guiding advancement based on bone microenvironment modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human cell isolation, culture, and differentiation techniques, including PBMC separation and monocyte adherence.
- Depends on instrumentation for cell counting, centrifugation, microscopy (10X magnification for osteoclast counting), and incubation (37°C, 5% CO₂).
- Necessitates cross-team standardization of PBMC donor sourcing, cell density optimization (7.5×10⁵ PBMC/cm²), and co-culture timing (11 days post-cancer cell seeding) to minimize variability.
- Involves adaptation considerations when extending to non-breast cancer cell lines or alternative osteoclast stimuli beyond RANKL/MCSF.
- Includes practical limitations such as donor variability in osteoclast differentiation potential and the need for manual proficiency in PBMC seeding and co-culture setup.
