Name: Aplicación de nanopartículas fluorescentes para estudiar Remodelación del Sistema Endo-lisosomal por bacterias intracelulares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Aprende a estudiar la remodelación del sistema endo-lisosomal por Salmonella enterica usando nanopartículas fluorescentes y microscopía confocal. Este método permite cuantificar la distribución intracelular en células HeLa.

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Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft por la subvención Z dentro de Sonderforschungsbereich 944 'Fisiología y Dinámica de los Microcompartimentos Celulares' y HE1964/18 dentro del programa prioritario 1580.

1. Síntesis de 10 nm nanopartículas de oro (Gold PN) 15 <ol><li> Preparar la solución A: añadir cloruro de oro acuosa 2 ml 1% en 160 ml Milli-Q, o doblemente destilada, agua. </li><li> Preparar la solución B: añadir 8 ml 1% tri-citrato de sodio x 2 H 2 O y ácido tánico 160 l 1% en 32 ml Milli-Q, o doble destilada, agua. </li><li> Calentar la solución A y B a 60 ° C y se mezclan con agitación. Observar un color azul oscuro de inmediato. Observe el color rojo después de unos 15 minutos. A continuación, calentar hasta 95 ° C, mantener 5 minutos y enfriar la solución a temperatura ambiente. </li><li> Añadir una gota de la suspensión NP en una rejilla recubierta de carbono y dejar secar al aire. Compruebe el tamaño y la morfología de los PN mediante microscopía electrónica de transmisión. </li></ol> 2. El recubrimiento de oro PN con BSA y Etiquetado con Rodamina N-hidroxisuccinimidilo Ester (NHS) 16 <ol><li> Añadir 900 l NP de oro en un tubo Eppendorf de 1,5 ml, se centrifuga a 15.000 xg durante 30 min. Opnalmente, preparar múltiples tubos pueden a la vez. </li><li> Descartar el sobrenadante, volver a suspender el sedimento en 900 l de agua esterilizada Milli-Q y añadir 100 l 2 mg / ml de BSA / PBS, mezclar en un Vortex a 800 rpm durante 30 min. </li><li> Para eliminar el exceso de BSA, centrifugar la preparación a 15.000 xg durante 60 min. </li><li> Descartar el sobrenadante y vuelva a suspender los PN oro-BSA en 125 l de PBS, añadir 12,5 l de 1 M de bicarbonato. </li><li> Inmediatamente antes de su uso, preparar una solución de 10 mg / ml de rodamina NHS / DMSO, añadir 30 l de solución de rodamina / DMSO NHS a 1 ml de la suspensión de oro-BSA NPs. Se incuba la reacción durante 2 horas (o O / N) a TA durante 800 rpm de mezcla, evitando la exposición a la luz. </li><li> Purifica los PN-oro BSA-rodamina través de diálisis contra PBS a 4 ° C con 5 cambios de tampón durante el período de 36 - 48 h. </li><li> Para estabilizar los PN, añadir 10 l de 200 mg / BSA / PBS ml en cada uno de los PN 1 ml de oro-BSA-rodamina. Para quitar la centrífuga libre o liberado BSA-rodamina, a los 15,000 g durante 60 min. Resuspender el precipitado en 2 mg / ml de BSA / PBS, medir OD 520, y se almacena a 4 ° C, evitando la exposición a la luz. </li><li> Diluir los PN 10 veces con Milli-Q o agua doblemente destilada, añadir una gota sobre una rejilla recubierta de carbono, y dejar secar al aire. Compruebe el tamaño y la morfología de los PN mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). NOTA: Todos los materiales utilizados para la preparación NP fueron esterilizados y la operación se llevó a cabo en una campana de cultivo celular o en un banco junto a una llama. </li></ol> 3. Cultura de células HeLa <ol><li> Células HeLa que expresan permanentemente LAMP1-GFP se cultivan en DMEM con 10% de suero de ternera fetal (FCS) y se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera que contiene 5% de CO 2. </li><li> Semillas de las células a una densidad de 50.000 por pocillo en un porta con cámara de 8 pocillos (ibidi) e incubar O / N. </li></ol> 4. Cultura de bacterias <ol><li> Uso Salmonella enterica serotipo Typhimurium NCTC 12023 wilde tipo d (WT) cepa. Para la comparación, utilizar cepas mutantes Δ ssaV defectuosos en el SPI2-T3SS y Δ SIFA carecen efector clave SIFA para SIF. Utilice las cepas que albergan plásmido pFPV25.1 para la expresión constitutiva de una mayor GFP. NOTA: cepas bacterianas son cultivadas de forma rutinaria en caldo Luria-Bertani (LB) con la adición de 50 mg / ml de carbenicilina (WT) y LB con la adición de 50 mg / ml de carbenicilina y / o 50 mg / ml de kanamicina (Δ ssaV, Δ SIFA ) del requerido para mantener plásmidos. </li><li> Inocular una colonia de bacterias en 3 ml de LB con los antibióticos apropiados y crecer O / N a 37 ºC bajo condiciones de agitación para la aireación, luego diluido 1:31 en LB fresco y continuar el crecimiento durante 3,5 horas. En este punto del tiempo, los cultivos alcanzan la fase logarítmica tardía y las bacterias son altamente invasivos. A 'tambor rodillo' es conveniente para incubar cultivos en tubos de ensayo con aireación. </li></ol> 5. La infección de células HeLa porSalmonella y Gold-BSA-Rodamina PN pulso Chase-etiquetado (véase la figura 1 para el esquema) <ol><li> Mida OD 600 de las bacterias sub-cultivaron y diluir a OD 600 = 0.2 en 1 ml de PBS (~ 3 × 10 8 ufc / ml), añadir cantidades apropiadas de las bacterias a las células HeLa en portaobjetos de cámara de 8 pocillos para lograr una multiplicidad de infección (MOI) de 100. </li><li> Incubar durante 30 min en la incubadora de células, lavar 3 veces con PBS para eliminar las bacterias no internalizados (este punto de tiempo se establece como 0 horas después de la infección, o 0 hr pi). Añadir 300 l de medio de cultivo fresco que contiene 100 mg / ml de gentamicina y mantener durante 1 hora. A continuación, sustituir el medio con medio fresco que contiene 10 mg / ml de gentamicina para el resto del tiempo de incubación. </li><li> Después de la incubación con medio de cultivo que contiene 100 mg / ml de gentamicina durante 1 h, el medio se sustituye por medio de la formación de imágenes (Eagles MEM sin FCS, L-glutamina, fenol rojo y bicarbonato de sodio, con 30 mM HEPES, pH 7,4) containing 10 mg / ml de gentamicina. NPS-oro BSA-rodamina se añaden a células HeLa para obtener una concentración final de OD 520 = 0,1. NOTA: NPs Gold-BSA-rodamina También se puede añadir a las células antes de la infección, o en diversos puntos de tiempo pi </li><li> Después de 1 h de incubación, retirar el medio, lavar 3 veces con PBS, y añadir 300 l de medio de formación de imágenes fresco que contiene 10% de FCS y 10 mg / ml de gentamicina para el resto del tiempo de incubación. NOTA: La duración de la incubación puede variar dependiendo de la concentración de NP y las líneas celulares utilizadas. Para macrófagos RAW264.7, se observó que 30 min de incubación con NPs a una concentración de 520 OD = 0,05 permitido suficiente internalización. </li></ol> 6. Imaging <ol><li> Utilice un sistema de imagen confocal tal como un láser de barrido confocal (CLSM) o disco giratorio (SD) microscopio con una cámara de ambiente humidificado para imágenes de alta resolución en diferentes puntos de tiempo. </li><li> Encienda la temperatura control sistema y espere hasta que se estabilice. Optimizar los ajustes de imagen como la ampliación, la velocidad de escaneo, resolución, Z-stack etc. Utilice los ajustes de excitación / emisión apropiados para GFP y PN oro-BSA-rodamina. Para este protocolo, utilizar una velocidad de exploración de 400 Hz, resolución de 512 x 512 píxeles y tamaño de Z a paso de 0,25 micras. Excite GFP y oro-BSA-rodamina usando un láser Ar (488 nm) y un láser de HeNe (543 nm), respectivamente. Incluir un (BF) del canal de campo brillante para observar la forma de las células. Por otro sistemas de microscopía y condiciones de infección, el ajuste tiene que ajustarse en consecuencia. NOTA: Utilice el mismo láser Ar como fuente de luz de canal BF y la señal fue detectada con un detector fotomultiplicador (PMT). </li><li> En indicado puntos de tiempo pi, montar los portaobjetos de cámara de 8 pocillos que contienen células infectadas en la platina del microscopio y grabar imágenes. </li></ol> 7. Análisis de Imágenes <ol><li> Utilice microscopía software de análisis de imágenes (ver Salmonella. Abra los datos haciendo clic en "Abrir" y elegir el archivo. NOTA: De forma alternativa, los paquetes de software de código abierto como ImageJ o FIJI se pueden utilizar para imagen análisis cuantitativos. </li><li> En la barra de herramientas de objetos de la vista Surpass clic en el icono <img alt="Icono" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon1.jpg"> añadir un nuevo elemento de superficie. Hacer clic en <img alt="Icono" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg"> (Siguiente). </li><li> Para analizar una región de interés (ROI), seleccione un segmento de retorno de la inversión. En un área de visualización, una sección rectangular con bordes superpuestos en la imagen representa el retorno de la inversión. Introduzca los valores en las direcciones x correspondiente, y-, y campos, z, o hacer clic directamente sobre las flechas en el rectángulo de vista previa para modificar el tamaño y la posición del ROI. Luego haga clic en <img alt="Icono" fo:content-width=".1in" src> = "/ Files / ftp_upload / 52058 / 52058icon2.jpg" /&gt; (Siguiente). </li><li> Como canal de origen, seleccione el canal 3 (señal de Oro-BSA-Rodamina PN). Marque la opción suave para establecer la suavidad de la superficie resultante. Defina un valor manualmente o acepte el valor generado automáticamente. En Umbral, seleccione la opción Intensidad absoluta. </li><li> Para el ajuste de umbral, seleccione la opción manual y establecer un valor. En el área de visualización, una vista previa umbral de superficie se muestra en gris. </li><li> En la ficha Clasificar Superficies la superficie resultante se puede filtrar por diversos criterios. Un filtro por defecto es 'número de voxels&gt; 10', y otros filtros también se puede incluir haciendo clic en 'añadir'. Si un filtrado no es necesario, a continuación, eliminar todos los filtros haciendo clic en el botón de eliminar. Haga clic en <img alt="Icono" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg"> (Siguiente). </li><li> Para completar la creación de superficie, haga clic en/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg "/&gt; (Finalizar). En la lista de objetos, ahora se elimina la marca de la caja para el Volumen elemento y nueva superficie creada se muestra en el área de visualización. </li><li> Exportar las estadísticas. Ahora, en la vista Superar el color de los temas varían de púrpura a rojo en función de su área. Y la mesa 'Números Parcela' muestra la información estadística (por ejemplo, número de identificación y el área de los objetos). Exportar todas las estadísticas de superficie 1 a un archivo de Excel con un clic <img alt="Icono" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon4.jpg"> (Guardar). </li></ol>

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No se declaran conflictos de intereses.

El sistema de endo-lisosomal de las células de mamíferos controles importantes procesos fisiológicos, incluyendo la absorción de nutrientes, la transducción de señales mediada por la hormona, la vigilancia inmune, y la presentación de antígeno 17. Hasta ahora, una variedad de marcadores se han utilizado para el etiquetado de los estudios de la vía endocítica y seguimiento. Por ejemplo, las sondas son sondas LysoTracker acidotropic fluorescentes desarrollados por Molecular Probes (Life Technologies, EE.UU.) pa...

Nanopartículas fluorescentes (PN), incluidos los PN de metal, puntos cuánticos, polímeros PN, PN sílice, puntos de carbono, etc., han atraído una atención considerable durante las últimas décadas 1,2. En comparación con los tintes orgánicos tradicionales, NPs fluorescentes muestran propiedades químicas deseables, ópticas y mecánicas, tales como fuerte intensidad de la señal, la resistencia a photobleaching y alta biocompatibilidad 3,4. Estas ventajas que el método de elección para la detección intracelular y imágenes de células vivas hacen. Además, una variedad de NPs electrón-densos son visibles por microscopía electrónica (EM), facilitando su uso para el análisis microscópico correlacionada, que permite la combinación de células vivas de seguimiento con microscopía de luz (LM) y mayor resolución a nivel ultraestructural con EM 5. Por ejemplo, los NPs de oro han sido mucho tiempo utilizado eficientemente como biosensores en células sensibles para el diagnóstico de vida, así como en el campo de la inmuno-etiquetado 6. S recientesos estudios indican que NP de oro con diferente tamaño y forma pueden ser fácilmente captación por una gran variedad de líneas celulares y transportar de forma rutinaria a través de la vía endosomal, por lo tanto tienen un gran potencial de ser aplicado para el seguimiento de la vesícula de transporte intracelular y el sistema de etiquetado endo-7,8 lisosomal . Patógenos microbianos, como Salmonella enterica, Shigella flexneri y Listeria monocytogenes, se han desarrollado diferentes mecanismos para invadir las células huésped no fagocíticas 9. Después de ser interiorizado, los agentes patógenos, ya sean localizadas en el citosol o secuestradas en compartimentos de membrana, interactuando con su entorno de acogida y modulan estos para favorecer su propia supervivencia 10. Por ejemplo, Salmonella enterica reside y se replica dentro de un compartimiento intracelular phagosomal denomina -Con vacuola Salmonella (SCV) después de la infección 11. El SCV maduracióntráficos hacia el aparato de Golgi, sufriendo continuas interacciones con la vía endocítica, e induce la formación de estructuras tubulares extensos, tales como Salmonella filamentos inducidos (SIF), clasificación túbulos nexina, Salmonella portadoras secretora inducida por proteínas de membrana (3) SCAMP3 túbulos, etc. . 12-14. Estudiando cómo estos patógenos bacterianos manipulan las vías de la célula huésped es esencial para la comprensión de las enfermedades infecciosas. Aquí, NPs de oro-BSA-rodamina fueron utilizados como trazadores de fluidos para etiquetar el sistema de endo-lisosomal celular del huésped, y el patógeno gastrointestinal Salmonella enterica serovar Typhimurium humana (Salmonella) se utilizó como un modelo de bacteria para estudiar las interacciones del patógeno con la acoger vía endocítica. PN oro-BSA-rodamina intracelular en las células no infectadas y las células infectadas con WT Salmonella o cepas mutantes se obtuvieron imágenes de un microscopio de escaneo láser confocal (CLSM).Entonces software Imaris se utilizó para cuantificar la distribución de los NPs, lo que indica que la infección por Salmonella inducida reordenamiento extremo de los endosomas / lisosomas. Después de la descripción de este método, los experimentos análogos pueden ser diseñados para rastrear el destino a largo plazo de los NPs internalizadas y para investigar la influencia de diferentes sustancias exógenas o factores endógenos en la vía endocítica de las células eucariotas.

<table><tbody><tr><td>Cloruro de oro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>Ácido tánico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>403040</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trisódico</td><td>Sigma</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Rhodamine</td><td>Pierce</td><td>46406</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Applichem</td><td>A1492</td><td></td></tr><tr><td>Kanamcyin</td><td>Roth</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Roth</td><td>6344</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de cámara de 8 pocillos</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>cultivo de tejidos tratado, estéril</td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Bitplane</td><td>versión 7.6</td><td>varias configuraciones disponibles</td></tr></tbody></table>

aplicación de nanopartículas fluorescentes para estudiar remodelación del sistema endo-lisosomal por bacterias intracelulares

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Nanopartículas fluorescentes (PN) con química deseable, propiedades ópticas y mecánicas son herramientas prometedoras para etiquetar orgánulos intracelulares. Aquí, presentamos un método que utiliza oro-BSA-rodamina PN para etiquetar el sistema endo-lisosomal de las células eucariotas y supervisar la manipulación de las vías celulares de acogida por el patógeno intracelular Salmonella enterica. Los parlamentos nacionales se internalizan fácilmente por las células HeLa y localizados en endosomas tardíos / lisosomas. Infección por Salmonella indujo reordenamiento de las vesículas y la acumulación de los PN en estructuras de membrana Salmonella inducidos. Desplegamos el paquete de software Imaris para análisis cuantitativos de imágenes de microscopía confocal. El número de objetos y su distribución de tamaño en las células no infectadas eran distintos de los de las células infectadas por Salmonella, lo que indica extremadamente remodelación del sistema de endo-lisosomal por WT Salmonella.

NP de oro se han generado a través de un método bien establecido a través de la reducción del ácido cloroaúrico por el citrato y ácido tánico. Como se muestra en la Figura 2A, los NPs de oro sintetizados eran casi de forma esférica con un tamaño de aproximadamente 10 nm. BSA-recubrimiento y rodamina-etiquetado no influyeron en su morfología o tamaño (Figura 2B). Se ha informado de que NPs de oro pueden ser fácilmente absorbidos por las diversas células de ma...

Este artículo describe métodos para la síntesis y marcaje fluorescente de nanopartículas (NPs). Los NPs se aplicaron en los experimentos de pulso-caza para etiquetar el sistema de endo-lisosomal de las células eucariotas. La manipulación del sistema de endo-lisosomal por las actividades del patógeno intracelular Salmonella enterica fueron seguidos por imágenes de células vivas y cuantificada.

Aplicación de nanopartículas fluorescentes para estudiar Remodelación del Sistema Endo-lisosomal por bacterias intracelulares

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la remodelación del sistema lisosomal final por bacterias intracelulares utilizando nanopartículas fluorescentes como trazadores. Esto se logra primero sembrando células de heela en un portaobjetos de cámara de ocho pocillos e incubándolas durante la noche. El segundo paso es infectar las células con salmonela y tarica.A continuación, se realiza un marcaje de seguimiento de pulsos de las células huésped infectadas mediante incubación con nanopartículas de oro BSA Rumine. El paso final es observar las alteraciones del sistema endosomal de la célula huésped mediante microscopía confocal. En última instancia, la cuantificación de la distribución intracelular de las nanopartículas se realiza utilizando el paquete de software MRS.La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como el inmunomicroscópico, es que se analizan n células infectadas con el método, lo que puede proporcionar información sobre el estilo de vida intracelular de la térica. Sin embargo, también se puede aplicar a otros patógenos intracelulares como las especies de Gaia, Ella Prolia o Mycobacterium tuberculosis. También se puede aplicar a otros

application-fluorescent-nanoparticles-to-study-remodeling-endo

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Zhang, Y., et al. Aplicación de nanopartículas fluorescentes para estudiar la remodelación del sistema endolisosomal por bacterias intracelulares. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra el uso de nanopartículas fluorescentes para visualizar la remodelación endo-lisosomal en células epiteliales humanas infectadas por bacterias intracelulares. Después de la invasión bacteriana, los patógenos manipulan el citoesqueleto del huésped y el sistema endolisosomal, formando vacuolas con...

Visualización mediada por nanopartículas de la remodelación endolisosomal en células infectadas por bacterias

Se describen los métodos de formación de imágenes que utilizamos para investigar la distribución y la movilidad de las proteínas fluorescentes transfectadas residentes en el retículo endoplásmico (RE) por medio de la imagen confocal de células vivas. También analizamos ultraestructuralmente el efecto de su expresión en la arquitectura de este compartimento subcelular.

Visualización del retículo endoplasmático subdominios en células cultivadas

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Estudio de fagolisosoma Biogénesis en macrófagos en directo

Este artículo presenta dos protocolos: uno para medir las bacterias anaeróbicas que pueden invadir y sobrevivir con éxito dentro del huésped, y el otro para visualizar las bacterias anaeróbicas interactuando con las células huésped. Este estudio se puede aplicar a cualquier anaerobio cultivable y a cualquier tipo de célula eucariota.

Porphyromonas gingivalis como organismo modelo para la evaluación de la interacción de bacterias anaerobias con células huésped

La investigación del tráfico de membranas es crucial para entender las funciones neuronales. Aquí, se introduce un método para la cuantificación de la motilidad vesicular en las neuronas. Este es un método conveniente que puede adaptarse a la cuantificación del tráfico de membranas en el sistema nervioso.

Cuantificación de endosomas y de las motilidades de los lisosomas en neuronas cultivadas utilizando sondas fluorescentes

Transporte retrógrado de proteínas de la superficie de la célula al Golgi es esencial para mantener la homeostasis de la membrana. Aquí, describimos un método para analizar bioquímicamente transporte de superficie de Golgi de la célula de proteínas recombinantes utilizando nanobodies funcionalizados en células HeLa.

Análisis de absorción endocíticas y transporte retrógrado a la red Trans-Golgi en células cultivadas de Nanobodies funcionalizados

Este artículo proporciona una guía paso a paso para investigar la dinámica de localización subcelular de proteínas y para monitorear los cambios morfológicos usando microscopía de fluorescencia de alta resolución en Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus.

Microscopía de Fluorescencia de Células Vivas para Investigar la Localización de Proteínas Subcelulares y Cambios de Morfología Celular en Bacterias

Los endosomas de reciclaje forman parte de la red tubular endosomal. Aquí presentamos un método para cuantificar la dinámica del reciclaje de endosomas utilizando GFP-STX13 como marcador de orgánulos.

El ensayo basado en microscopía para estudiar y analizar los endosomas de reciclaje utilizando el tráfico de SNARE

El transporte endocítico y retrógrado de proteínas desde la membrana plasmática a la red trans-Golgi es esencial para mantener la homeostasis de la membrana y regular la señalización. Aquí, describimos un método para obtener imágenes y cuantificar el transporte endocítico de proteínas de carga transmembrana mediante microscopía de células vivas utilizando nanocuerpos anti-GFP derivados en células HeLa.

Imágenes de células vivas del transporte endocítico utilizando nanocuerpos funcionalizados en células cultivadas

Se describe un método multiplex para la detección de microorganismos en una muestra utilizando oligonucleótidos junto perlas fluorescentes. Amplificación de todos los organismos dentro de una muestra se hibridó con un panel de cuentas, junto sonda. Un instrumento Luminex o Bio-Plex se utiliza para consultar cada cuenta para el tipo de cuentas y la señal de hibridación.

Multiplex detección de bacterias en el complejo de muestras clínicas y ambientales utilizando oligonucleótidos de acoplamiento de microesferas fluorescentes

Aprende a estudiar la remodelación del sistema endo-lisosomal por Salmonella enterica usando nanopartículas fluorescentes y microscopía confocal. Este método permite cuantificar la distribución intracelular en células HeLa.

Aplicación de nanopartículas fluorescentes para estudiar Remodelación del Sistema Endo-lisosomal por bacterias intracelulares

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