Aplicación de nanopartículas fluorescentes para estudiar Remodelación del Sistema Endo-lisosomal por bacterias intracelulares

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la remodelación del sistema lisosomal final por bacterias intracelulares utilizando nanopartículas fluorescentes como trazadores. Esto se logra primero sembrando células de heela en un portaobjetos de cámara de ocho pocillos e incubándolas durante la noche. El segundo paso es infectar las células con salmonela y tarica.

A continuación, se realiza un marcaje de seguimiento de pulsos de las células huésped infectadas mediante incubación con nanopartículas de oro BSA Rumine. El paso final es observar las alteraciones del sistema endosomal de la célula huésped mediante microscopía confocal. En última instancia, la cuantificación de la distribución intracelular de las nanopartículas se realiza utilizando el paquete de software MRS.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como el inmunomicroscópico, es que se analizan n células infectadas con el método, lo que puede proporcionar información sobre el estilo de vida intracelular de la térica. Sin embargo, también se puede aplicar a otros patógenos intracelulares como las especies de Gaia, Ella Prolia o Mycobacterium tuberculosis. También se puede aplicar a otros tipos de células huésped, como micro feh, líneas celulares o células primarias.

La síntesis de nano partículas de oro de 10 nanómetros o NPS requiere dos soluciones: solución A y solución B.To preparar la solución A, agregue dos mililitros de cloruro de oro acuoso al 1% en 160 mililitros de agua mili Q. Prepare la solución B agregando ocho mililitros de citrato trisódico dihidratado al 1% y 160 microlitros de ácido tánico al 1% en 32 mililitros de agua mili Q. Caliente las soluciones A y B a 60 grados centígrados y luego mézclelas mientras revuelve.

Se debe observar un color azul oscuro inmediatamente después de unos 15 minutos. La solución debería volverse de color rojo en este punto. Calienta la solución a 95 grados centígrados.

Manténgalo a 95 grados centígrados durante cinco minutos y luego enfríe la solución a temperatura ambiente. Prepare la pieza dorada para el recubrimiento y el etiquetado agregando 900 microlitros de MPS de oro en un tubo einor de 1,5 mililitros y centrifugando a 15,000 Gs durante 30 minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 900 microlitros de agua MQ esterilizada.

Agregue 100 microlitros de una solución BSA y mezcle en un vórtice a 800 RPM durante 30 minutos. Eliminar el exceso de BSA centrifugando la preparación a 15.000 Gs durante 60 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el oro BSA NPS y 125 microlitros de PBS.

Añadir 12,5 microlitros de un molar de bicarbonato. La solución de éster de CIN R domine n hidroxi o NHS se prepara en DMSO inmediatamente antes. Úselo a 15 microlitros de solución R DOMINE N-H-S-D-M-S-O por 0,5 mililitros de la suspensión BSA NP dorada.

Incubar la reacción durante dos horas a temperatura ambiente mientras se mezcla a 800 RPM y se evita la exposición a la luz. A continuación, purifique el NPS de oro BSA rumine a través de diálisis contra PBS a cuatro grados Celsius con cinco cambios de tampón durante un período de 36 a 48 horas después de la purificación, estabilice el NPS agregando 10 microlitros de B-S-A-P-B-S en cada mililitro de oro BSA RUMINE NPS para eliminar la centrífuga BSA Rumine libre o liberada a 15, 000 GS durante 16 minutos a cuatro grados centígrados. Resus suspende el pellet en dos miligramos por mililitro de B-S-A-P-B-S después de medir la densidad óptica a 520 nanómetros o OD cinco 20.

Almacene el oro BSA Rod Domine NPS a cuatro grados centígrados, evitando la exposición a la luz de las células para este experimento expresan permanentemente una proteína fluorescente verde marcada con glicoproteína lisosomal lámpara una GFP y se cultivan en DMEM con 10% de suero fetal de ternera a 37 grados centígrados en una atmósfera que contiene 5% de dióxido de carbono semilla las células a una densidad de 50, 000 por pocillo en una cámara de ocho pocillos y se incuba durante la noche. La bacteria que infecta las células hela es el patógeno gastrointestinal humano, salmonella y tarica. A modo de comparación, se utilizan dos cepas mutantes.

Las tres cepas albergan un plásmido para la expresión constitutiva de GFP mejorada y se cultivan en caldo LB con los antibióticos apropiados para mantener los plásmidos para cada cepa. Inocular una sola colonia de bacterias en tres mililitros de caldo LB con el antibiótico adecuado y crecer durante la noche a 37 grados centígrados. En condiciones de agitación para la aireación al día siguiente, diluya cada cultivo de uno a 31 en caldo LB fresco y continúe creciendo durante tres horas y media.

Para comenzar este procedimiento, mida el OD 600 de las bacterias del subcultivo y diluya hasta un OD 600 de 0,2. En un mililitro de PBS, agregue cantidades apropiadas de bacterias a las células hela en el portaobjetos de 12 cámaras para lograr una multiplicidad de infección de 100. Incubar durante 30 minutos en la incubadora de celdas.

Lave las células de hela tres veces con PBS para eliminar las bacterias no internalizadas. Este punto de tiempo se establece como cero horas después de la infección o cero horas pi. Agregue 300 microlitros de medio de cultivo fresco que contenga 100 microgramos por mililitro de gentamicina a las células y manténgalo durante una hora.

Después de una hora. Reemplace el medio con un medio de imagen que contenga 10 microgramos por mililitro de gentamicina. Añadir oro BSA rumina NPS a las células hela para obtener una concentración final de OD cinco 20 de 0,1.

Incubar durante una hora después de una hora. Retire el medio y lave tres veces con PBS. Por último, añadir 300 microlitros de medio de imagen fresco que contenga un 10% de FCS y 10 microgramos por mililitro de gentamicina.

Durante el resto del tiempo de incubación, se logran imágenes de alta resolución de las células en diferentes puntos de tiempo utilizando un sistema de imágenes confocal, como un escaneo láser confocal o un microscopio de disco giratorio con una cámara de ambiente humidificado, encienda el sistema de control de temperatura y espere hasta que esté estable. Optimice la configuración de la imagen, como el escaneo de ampliación, la velocidad, la resolución y el tamaño del paso Z. Utilice los ajustes de emisión de excitación apropiados para GFP y NPS ruminal BSA de oro en los puntos de tiempo indicados después de la infección.

Monte el portaobjetos A de 12 cámaras que contiene células infectadas en la platina del microscopio y grabe imágenes para analizar las imágenes y estudiar la remodelación del sistema endosomal por salmonela intracelular. Utiliza un software de análisis de imágenes. Abra los datos haciendo clic en abrir y eligiendo el archivo en la barra de herramientas de objetos de la vista de repaso.

Haga clic en el icono para agregar un nuevo elemento de superficie. Para analizar una región de interés o ROI, seleccione segmentar solo una región de interés y, a continuación, haga clic en siguiente como canal de origen. Seleccione el canal tres.

Marque la opción de suavizado para configurar la suavidad del área resultante. Defina un valor manualmente o acepte el valor generado automáticamente. Para el umbral.

Seleccione la opción de intensidad absoluta para el ajuste del umbral. Seleccione la opción manual y establezca un valor en el área de visualización. Una vista previa del umbral de superficie se muestra en gris.

Haga clic en siguiente en la pestaña Clasifica superficies. La superficie resultante se puede filtrar por varios criterios. Un filtro predeterminado es el número de agujeros en V mayor que 10, también se pueden incluir otros filtros haciendo clic en agregar.

En este ejemplo, se utiliza el filtro predeterminado para completar la creación de la superficie. Haga clic en finalizar en la lista de objetos. Desmarque la casilla del volumen del artículo.

Ahora se muestra una nueva superficie creada en el área de visualización. En rojo, exporte las estadísticas a un archivo de Excel haciendo clic en guardar. Las NPS de oro sintetizadas por este protocolo tenían forma casi esférica y un tamaño aproximado de 10 nanómetros.

El recubrimiento BSA y el marcaje rho domine no influyeron en su morfología ni tamaño. Estudiar la remodelación del sistema endosomal celular del huésped por salmonela intracelular. Las células Hela fueron simuladas infectadas o infectadas con salmonela de tipo salvaje o dos cepas mutantes y se persiguieron el pulso con oro de 10 nanómetros.

BSA rod domine n guisantes en células no infectadas, el NPS distribuido uniformemente en endosomas tardíos o lisosomas. Por el contrario, las NPS en las células infectadas con salmonela de tipo salvaje se reorganizaron en gran medida a las ocho horas posteriores a la infección. Se formó una red estabilizada de filamentos o tamices inducidos por salmonela, y la mayoría de los mps se encontraron acumulados dentro de las estructuras tubulares.

Las cepas mutantes mostraron comportamientos distintos ocho horas después de la infección. La cepa mutante SSAV estaba confinada dentro de la salmonela que contenía VAE o SCV. Si bien no se formaron tamizs, la mayoría de los mps todavía se localizaron en endosomas tardíos libres o lisosomas para el sif.

Se produjo un escape de una cepa mutante de salmonela en el citoplasma y no se observó asociación entre NPS y bacterias. Cuando se examinó la accesibilidad del sistema lisosomal final en varias fases de la infección por salmonela, los resultados muestran que en todos los casos, la mayoría de las NPS internalizadas se acumularon en el SCV o SIFs después de este procedimiento. Otros métodos, se puede realizar la transmisión microscópica del cuello.

Esto puede responder a preguntas adicionales como la ultraestructura o los compartimentos de membrana en algunas células huésped nanoinfectadas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar nanopartículas fluorescentes. Estos se pueden utilizar para etiquetar compartimentos del huésped modificados por salmonela intracelular.