Name: Una nueva técnica de análisis cuantitativos de la pérdida del pelo en ratones Uso del análisis de escala de grises (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Aprende a cuantificar la pérdida de pelo en ratones mediante análisis de escala de grises con un gel imager. Este método reproducible mide la absorción de luz para evaluar terapias contra la alopecia de forma objetiva.

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Nos gustaría agradecer al Departamento de Pediatría del Hospital Infantil de Montefiore por brindar apoyo a estos estudios. Nos gustaría agradecer a la Fundación Nacional de Alopecia Areata por proporcionar apoyo financiero para la realización de estudios con ratones injertados con C3H/HeJ.

Declaración de Ética: Todos los estudios con animales deben ser aprobados por el IACUC de la institución (por los datos que siguen, los protocolos fueron aprobados por el Montefiore IACUC, protocolo # 11-6-240 y # 13-7-100). Animales se proporcionan anestesia luz como se indica con la única finalidad de mantenerlos quietos durante la fotografía, no hay procedimientos dolorosos requeridos para este protocolo. 1. Adquisición de fotografías <ol><li> Ajuste el enfoque y campo de visión para reproductor de imágenes de gel utilizando papel con el texto impreso. Verificar la uniformidad de la fuente de luz en toda la región fotografiada. Para ayudar a asegurar la uniformidad, utilice un generador de imágenes de gel con un sistema incorporado en la fuente de luz para la fotografía reflexiva. No utilice una fuente de luz transiluminación, ya que esto crearía una silueta del animal que no es adecuado para su posterior análisis en escala de grises. NOTA: Esto colocará el ratón ligeramente fuera de foco, que proporciona un promedio óptica a través de la región de interés (ROI) y la voluntadayudar a reducir los errores cuánticos para regiones muy pequeñas (es decir, &lt;10 píxeles) de interés. Regiones más grandes de interés no se verán afectados por esta menor centrándose ajuste, ni serán afectados por las diferencias en el tamaño del animal. </li><li> Anestesiar a los animales, utilizando ketamina (100 mg / ml) / xilazina (20 mg / ml) (2: 1), ya que esto proporciona un efecto de la anestesia rápida y recuperación rápida y es óptimo para fotografiar múltiples animales. NOTA: La anestesia se confirmó cuando el animal es todavía suficiente para permitir la fotografía. Como los animales se recuperan de esta luz anestesia dentro de 10-15 minutos, el veterinario no ha recomendado el uso de ungüentos para los ojos. </li><li> Coloque los animales anestesiados en gel de imágenes en alineación vertical (tan cerca como sea posible a paralelo). <ol><li> Para las fotografías dorsales, colocar los animales en decúbito prono, con los miembros extendidos. </li><li> Para las fotografías ventrales, colocar los animales en decúbito supino, con cuidado de que los animales no se rotan lateralmente. </li&gt; </ol></li><li> Coloque estándar en escala de grises en la región fotografiada. </li><li> Cierre la puerta de acceso. Importante: La luz ambiental puede introducir variaciones en la exposición. </li><li> Establecer F-stop a una exposición que sitúa a la región de interés dentro del rango lineal de adquisición (lectura F-parada). NOTA: La mayoría de los sistemas se mostrarán donde la imagen está saturado. </li><li> Tome la fotografía. </li><li> Cambio F-parar a otro ajuste de exposición que sitúa a la región de interés dentro del rango lineal aumentando o disminuyendo la ventanilla F por 1, de manera que tanto la norma y la región de interés se mantienen en un rango lineal de adquisición (referencia F- deténgase). </li><li> Tome la fotografía. </li><li> Una vez que la fotografía se ha completado, colocar los animales en una mesa de calentamiento y monitorear hasta que puedan mantener decúbito esternal. Vuelta de los animales a sus jaulas. Devuelva el grupo de animales para el vivero, una vez que todos los animales están completamente recuperados. </li></ol> 2. Cuantificación de absorción de la luz &lt;/ P&gt; <ol><li> Marcar las regiones de interés en las imágenes de los animales utilizar el software proporcionado por imager gel. <ol><li> Para vista dorsal animal completo, utilice una imagen rectangular u oval que se extiende desde los miembros superiores a las extremidades inferiores, que se extiende lateralmente tanto como sea posible de tal manera que ninguna parte de la caja se extiende más allá de la parte posterior del animal, como se muestra en la Figura 1A. NOTA: También se podría marcar el área de interés utilizando una herramienta de dibujo a mano alzada. </li><li> Para el conjunto de vista ventral animal, utilizar 2 rectángulos: uno que cubre la región pélvica y uno que cubre la zona del pecho, como se muestra en la Figura 1B. </li><li> Para una región más pequeña de interés, es decir, la ubicación de la administración del fármaco, marca, según corresponda. </li></ol></li><li> Marcos región (s) de interés en el estándar de absorción de escala de grises. </li><li> Absorción registro de cada una de las regiones marcadas de interés. </li></ol> 3. Análisis Niveles de absorción obtained para las regiones de interés puede necesitar ser normalizados a la norma de fondo para la comparación entre las fotografías. La relación de la exposición a la absorción es log-log (es decir, la relación es lineal entre log (exposición) y log (absorción)). Usando esta relación, la absorción de la región de interés puede ser normalizado a un valor de fondo estándar, que permitirá absorciones que deben compararse directamente entre diferentes fotografías, incluidas las tomadas en diferentes puntos de tiempo (es decir, mediciones en serie dentro de un protocolo de estudio). El procedimiento para realizar estas correcciones se detalla en los pasos opcionales 3.1 y 3.2. <ol><li> (Opcional) curva Parcela de registro (exposición) vs log (absorción) utilizando los valores obtenidos de la norma de absorción de escala de grises. </li><li> (Opcional) ajustar las variaciones en el nivel de cada fotografía como sigue: <ol><li> Seleccione F-stop para la lectura (según lo determinado en el paso 1.6) y F-stop para referencia (como se determina en sTEP 1,8). </li><li> Calcular la absorción media de la norma en todas las fotografías en la lectura de F-stop. Este promedio es el estándar de referencia Valor (RSV). </li><li> Calcular la diferencia en la absorción entre la lectura y de referencia configuración F-stop en cada fotografía para el estándar (delta-S) y para cada ROI definido (delta-ROI-1, delta-ROI-2 ... ..delta-ROI-X) </li><li> Calcular la absorción corregido para cada ROI de la siguiente manera: la absorción corregida (ROI-X) = Absorción (ROI-X) en la lectura de F-stop + (RSV - absorción de la norma en la lectura de F-stop) * (delta-ROI-X / delta-S) </li></ol></li><li> Recopilar datos experimentales y realizar análisis de datos utilizando técnicas estadísticas estándar para las variables continuas (es decir, ANOVA, t-test). </li></ol>

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<li>Rossi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1+mg+daily+administration+on+male+androgenetic+alopecia+in+different+age+groups%3A+10-year+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatol+Ther%22%5BJournal%5D)">1 mg daily administration on male androgenetic alopecia in different age groups: 10-year follow-up.</a> Dermatol Ther. 24 (4), 455-461 (2011).</li>
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<li>The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale*. , Imatest. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.imatest.com/docs/q13/">http://www.imatest.com/docs/q13/</a> Forthcoming.</li>
<li>Freyschmidt-Paul, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+alopecia+areata+in+C3H%2FHeJ+mice+with+the+topical+immunosuppressant+FK506+%28Tacrolimus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Treatment of alopecia areata in C3H/HeJ mice with the topical immunosuppressant FK506 (Tacrolimus).</a> Eur J Dermatol. 11 (5), 405-409 (2001).</li>
<li>Katikaneni, R., Ponnapakkam, T., Matsushita, O., Sakon, J., Gensure, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+and+prevention+of+chemotherapy-induced+alopecia+with+PTH-CBD%2C+a+collagen-targeted+parathyroid+hormone+analog%2C+in+a+non-depilated+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Drugs%22%5BJournal%5D)">Treatment and prevention of chemotherapy-induced alopecia with PTH-CBD, a collagen-targeted parathyroid hormone analog, in a non-depilated mouse model.</a> Anticancer Drugs. 25 (1), 30-38 (2014).</li>
<li>Peters, E. M., Foitzik, K., Paus, R., Ray, S., Holick, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+for+modulating+chemotherapy-induced+alopecia%2C+using+PTH%2FPTHrP+receptor+agonist+and+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A new strategy for modulating chemotherapy-induced alopecia, using PTH/PTHrP receptor agonist and antagonist.</a> J Invest Dermatol. 117 (2), 173-178 (2001).</li>
<li>Katikaneni, R., Ponnapakkam, T., Seymour, A., Sakon, J., Gensure, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parathyroid+hormone+linked+to+a+collagen+binding+domain+promotes+hair+growth+in+a+mouse+model+of+chemotherapy+induced+alopecia+in+a+dose-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Anti-cancer+drugs%22%5BJournal%5D)">Parathyroid hormone linked to a collagen binding domain promotes hair growth in a mouse model of chemotherapy induced alopecia in a dose-dependent manner.</a> Anti-cancer drugs. 25 (7), 819-825 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este informe una descripción detallada se proporciona de una nueva técnica para la cuantificación de la pérdida de cabello en los roedores. Esta técnica utiliza un generador de imágenes de gel para la adquisición y análisis de imágenes, equipo que está fácilmente disponible en la mayoría de los laboratorios. Las mediciones han demostrado ser robusto a las variaciones menores en la técnica (Figuras 4 - 5), y están bien correlacionados con el grado de pérdida de cabello visual en los m...

La alopecia (caída del cabello) puede ser un evento psicológicamente y emocionalmente angustiante con múltiples causas. Calvicie de patrón masculino es la causa más común de alopecia, que afecta a aproximadamente dos tercios de los hombres a los 35 años 1. Un patrón similar de pérdida de cabello se puede observar en las mujeres con síndrome de ovario poliquístico. En ambos de estos trastornos, la pérdida de cabello es de andrógenos mediada. Alopecia también puede ocurrir como una enfermedad autoinmune, alopecia areata, que afecta a 1,7% de la población 2. La alopecia puede ocurrir como efecto secundario de algunos tratamientos médicos, como la quimioterapia 3. Un alto porcentaje (65-85%) de los pacientes de quimioterapia experimentan algún grado de alopecia 4,5. Las consecuencias psicológicas de la pérdida de cabello se han estudiado bien en el entorno de la quimioterapia. Alopecia inducida por la quimioterapia puede provocar ansiedad, depresión, una imagen corporal negativa, baja autoestima y un sentido reducido de bienestar 6,7. Un alto percentaje (47-58%) de los pacientes de cáncer femeninas consideran la pérdida del cabello a ser el aspecto más traumática de la quimioterapia, y hasta 8% de tratamiento de disminución por temor a 4,6 pérdida de cabello. También hay evidencia en la alopecia androgénica para apoyar a la terapia para reducir las consecuencias psicológicas y médicas, incluso de 8,9 pérdida de cabello. Asimismo, se ha informado de la alopecia areata tener graves consecuencias psicológicas 2, y de la naturaleza irregular de la pérdida de cabello puede conducir a un resultado cosmético más desagradable que la mayoría de otras causas de pérdida de cabello. Mientras que las drogas con efectos anti-androgénicos leves (es decir, espironolactona) se habían utilizado con éxito limitado como tratamiento para la alopecia, el primer medicamento eficaz para la alopecia fue minoxidil 10. Este antihipertensivo tiene un efecto secundario observado de causar el crecimiento del cabello, y ahora se utiliza como terapia tópica para muchas formas de alopecia. Sin embargo, las respuestas son a menudo incompletos, con algunos temas mostrando sólo lentaing de pérdida de cabello en lugar de rebrote real 10. Finasteride es un antagonista competitivo de tipo II 5α-reductasa que bloquea la conversión de testosterona a dihidrotestosterona, que resulta en mejoras en la alopecia androgénica, a expensas de bloqueo parcial de andrógenos sistémica. Las tasas de respuesta con a largo plazo (10 años), la terapia son alrededor del 50% 11. En general, a pesar de una considerable investigación en esta área, aún no existe una terapia adecuada para la pérdida del cabello. Durante décadas, los científicos y los médicos han examinado métodos de medición de crecimiento del pelo del cuero cabelludo en ensayos clínicos. Con el desarrollo de medicamentos que tratan la alopecia, ha habido una mayor necesidad de medios fiables, económicas y mínimamente invasivos de medición de crecimiento del cabello y, específicamente, la respuesta a la terapia. La tecnología de análisis de imágenes para una cuantificación precisa de la densidad del pelo en pacientes con trastornos de pérdida de cabello produjeron resultados coherentes y válidos en el pasado usando una variedad de techniquES, incluyendo el análisis de imágenes digitalizadas 12, análisis de imágenes de los pelos individuales y las lesiones de la piel 13, y el escaneo microscópico para cuantificar la masa de pelo del cuero cabelludo en una región definida 14. Desafortunadamente, mientras que las metodologías anteriores han proporcionado una mejor evaluación de la eficacia para el cabello intervenciones en los ensayos clínicos promotora del crecimiento, estos métodos no han sido aplicados a los estudios con roedores en investigaciones preclínicas. Nuestro objetivo es desarrollar un método consistente y fiable para cuantificar la pérdida de cabello en ratones, lo que permitirá a los investigadores a evaluar con mayor precisión y comparar nuevos enfoques terapéuticos para diversas formas de alopecia. Hemos desarrollado una metodología utilizando equipos disponibles en la mayoría de los laboratorios que permitirán la cuantificación rápida y fiable de la densidad del pelo en ratones con pelo marrón o negro. Esta metodología ha sido probada en modelos de ratón de la alopecia inducida por quimioterapia, alopecia areata y la alopecia de waxing. Un protocolo detallado se presenta para realizar estas mediciones, incluidos los datos de validación de C57BL / 6 y C3H / HeJ cepas de ratones. Como esta técnica se basa en la detección de la absorción de luz a partir de pigmentos en el eje del pelo, no puede ser utilizado para detectar el crecimiento del cabello en ratones blancos o ratones albinos.

<table><tbody><tr><td>Sistema de imagenología KODAK Gel Logic 100</td><td>Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA</td><td></td><td>Equipo de imagenología para geles para obtener y analizar fotografías; debe tener una fuente de luz integrada para fotografía reflectiva.</td></tr><tr><td>Escala de grises Kodak/Tiffen Q-13</td><td><a href="http://www.imatest.com/docs/q13/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Imatest</a></td><td></td><td>Patrón de escala de grises</td></tr><tr><td>Ratones C57BL/6J</td><td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine</td><td></td><td>Ratones para estudio representativo</td></tr><tr><td>Ratón injertado C3H/HeJ</td><td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine</td><td></td><td>Ratones para estudio representativo</td></tr></tbody></table>

una nueva técnica de análisis cuantitativos de la pérdida del pelo en ratones uso del análisis de escala de grises

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

La alopecia es una forma común de pérdida de cabello que puede ocurrir en muchas condiciones diferentes, incluyendo la pérdida de cabello de patrón masculino, el síndrome de ovario poliquístico, y la alopecia areata. Alopecia también puede ocurrir como un efecto secundario de la quimioterapia en pacientes con cáncer. En este estudio, nuestro objetivo fue desarrollar un método consistente y fiable para cuantificar la pérdida del pelo en ratones, lo que permitirá a los investigadores a evaluar con precisión y comparar los nuevos enfoques terapéuticos para estas diversas formas de alopecia. El método utiliza un generador de imágenes de gel estándar para obtener y procesar imágenes de los ratones, la medición de la absorción de la luz, que se produce en una proporción aproximada a la cantidad de pelo negro (o gris) en el ratón. Los datos que han sido cuantificados de esta manera se pueden analizar utilizando técnicas estadísticas estándar (es decir, ANOVA, t-test). Esta metodología fue probada en modelos de ratón de la alopecia inducida por quimioterapia, alopecia areata y la alopecia de la depilación. En este informe, el protocolo detallado es presentados para realizar estas mediciones, incluidos los datos de validación de C57BL / 6 y C3H / HeJ cepas de ratones. Esta nueva técnica ofrece una serie de ventajas, incluyendo la relativa simplicidad de aplicación, la confianza en el equipo que está fácilmente disponible en la mayoría de los laboratorios de investigación, y la aplicación de una evaluación objetiva, cuantitativa que es más robusto que las evaluaciones subjetivas. Las mejoras en la cuantificación del crecimiento del pelo en ratones mejorarán estudio de los modelos de alopecia y facilitar la evaluación de nuevas terapias prometedoras en estudios preclínicos.

Esta técnica fue validada utilizando / HeJ injertadas C3H, el modelo de ratón de la alopecia areata 16. Estos animales desarrollan la pérdida mundial de cabello que progresa gradualmente con el tiempo. Sin embargo, la pérdida de cabello se produce en parches, y puede variar de un ratón a la siguiente, la introducción de una variabilidad considerable y obstaculizando evaluaciones cualitativas. Este modelo proporciona una oportunidad para poner a prueba las correlaciones entre las mediciones de densidad óptica ...

La alopecia es una forma común de pérdida de cabello que puede ocurrir en muchas condiciones diferentes, incluso como efecto secundario de la quimioterapia. Hemos desarrollado un método para cuantificar la pérdida de cabello en ratones, utilizando un generador de imágenes en gel estándar para realizar un análisis en escala de grises, para facilitar el estudio de nuevas terapias prometedoras para la alopecia.

Una nueva técnica de análisis cuantitativos de la pérdida del pelo en ratones Uso del análisis de escala de grises

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar una cuantificación de la densidad del cabello mediante la absorción de luz. Esto se logra fotografiando primero a los animales en un generador de imágenes en gel. Los siguientes pasos son definir una región de interés en la fotografía y determinar la absorción de luz dentro de la región de interés.Luego, la absorción de luz se compara con un estándar fotográfico. En última instancia, la absorción de luz se puede promediar entre animales tratados de manera similar para mostrar los efectos de una intervención en el crecimiento del cabello. Las principales ventajas de esta técnica son que es imparcial, cuantificable y reproducible.Esto es extremadamente importante porque le permite utilizar estándares, técnicas estadísticas como Inova para determinar la significación estadística de los resultados. Para este protocolo, utilice un generador de imágenes de gel con una fuente de luz incorporada para la fotografía reflectante. Esto garantiza una buena uniformidad de la luz, mientras que la iluminación trans crea siluetas inadecuadas para el análisis.Comience preparando el generador de imágenes en gel, establezca el enfoque y el camp

a-new-technique-for-quantitative-analysis-hair-loss-mice-using

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Tejido análisis específico de un modelo de regeneración del folículo del pelo utilizando lentivirus para mediar ganancia o pérdida de función.

El análisis genético rápido de epitelio-mesenquimal de señalización durante la regeneración del cabello

Este video muestra un método para injertar piel humana en un ratón inmunodeficiente con una respuesta de neutrófilos suprimida. El método consiste en aplicar piel humana de espesor dividido al lecho de injerto del ratón, sellarlo y cubrirlo para su recuperación. Eventualmente, la piel humana se adhiere a la piel del ratón, estableciendo la vascularización y la circulación, lo que resulta en un xenoinjerto de piel exitoso.

Una técnica para el injerto de piel humana en un modelo de ratón

Este video muestra el registro combinado de la salida aferente estimulada mecánicamente y el etiquetado de terminales nerviosos en los folículos pilosos de un pabellón auricular de ratón. Describe los pasos involucrados en la estimulación mecánica de las terminales nerviosas de los folículos pilosos antes y después de la exposición a un tinte de membrana fluorescente, el registro electrofisiológico de los potenciales de acción generados y la visualización del etiquetado de las terminales...

Registro combinado de la salida aferente estimulada mecánicamente y el marcaje de terminales nerviosas en folículos pilosos de ratón

Piel de los mamíferos contiene una amplia gama de estructuras - tales como los folículos pilosos y las terminaciones nerviosas - que exhiben patrones distintivos de organización espacial. El análisis de la piel como montura plana se aprovecha de la geometría de 2 dimensiones de este tejido para producir de espesor total de imágenes de alta resolución de las estructuras de la piel.

Flat Mount Imaging de ratón de la piel y su aplicación al análisis del folículo del pelo Patrones y sensorial Axon Morfología

Aquí, describimos en profundidad un método, que se basa en la tomografía microcomputarizada, para segmentar y medir modelos 3D de huesos craneomaxilofaciales en ratones, para una mejor evaluación del desarrollo óseo craneomaxilofacial en ratones que lo que es posible con los métodos actuales.

Análisis de Malformaciones Craneomaxilofaciales en Ratones mediante Tomografía Microcomputarizada Tridimensional

La capilaroscopia es una herramienta accesible para la visualización directa, económica y no invasiva de la microvasculatura. El objetivo de este protocolo es permitir a los investigadores utilizar la capilaroscopia para la visualización de la morfología microvascular periférica en los lechos ungueales de ratones.

Visualización no invasiva de la morfología microvascular del lecho ungueal en ratones mediante capilaroscopia

El objetivo del presente protocolo es proporcionar instrucciones y pautas para evaluar la fragilidad física en ratones de laboratorio C57Bl / 6x129J. Se explican detalles específicos sobre cada medida utilizada en el índice de fragilidad física. También se presentan varios métodos para informar los resultados de fragilidad.

Evaluación de la fragilidad en un modelo de ratón envejecido

Este estudio presenta un enfoque in vivo de imagen de dos fotones para visualizar las estructuras de terminales axonales de mecanorreceptores de bajo umbral (LTMR) en la piel de la pata delantera de ratones. Utilizando imágenes repetidas y de alta resolución de axones individuales, este método proporciona una nueva plataforma para estudiar la estructura y función del circuito sensorial cutáneo durante el desarrollo y en adultos.

Imagen intravital de dos fotones de la morfología del axón sensorial táctil en piel de ratón

Este protocolo describe la fabricación, caracterización y aplicación de parches de microagujas disolubles cargados con 3BDO para la administración transdérmica de fármacos en un modelo de regeneración del vello en ratón.

Fabricación y caracterización de parches de microagujas disolubles cargados con 3BDO para el crecimiento del cabello en ratones C57BL/6

Este artículo describe un nuevo protocolo y el reactivo conjunto diseñado para la medición sensible de los efectos neurotóxicos de los compuestos y los tratamientos en co-cultivos de neuronas y astrocitos utilizando el análisis de contenido de alta. Los resultados demuestran que el análisis de contenido de alta tecnología representa una apasionante novela para la evaluación de la neurotoxicidad.

A neuronales y astrocitos Co-cultivo de ensayo para el análisis de alto contenido de neurotoxicidad

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