Una nueva técnica de análisis cuantitativos de la pérdida del pelo en ratones Uso del análisis de escala de grises

La alopecia es una forma común de pérdida de cabello que puede ocurrir en muchas condiciones diferentes, incluso como efecto secundario de la quimioterapia. Hemos desarrollado un método para cuantificar la pérdida de cabello en ratones, utilizando un generador de imágenes en gel estándar para realizar un análisis en escala de grises, para facilitar el estudio de nuevas terapias prometedoras para la alopecia.

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar una cuantificación de la densidad del cabello mediante la absorción de luz. Esto se logra fotografiando primero a los animales en un generador de imágenes en gel. Los siguientes pasos son definir una región de interés en la fotografía y determinar la absorción de luz dentro de la región de interés.

Luego, la absorción de luz se compara con un estándar fotográfico. En última instancia, la absorción de luz se puede promediar entre animales tratados de manera similar para mostrar los efectos de una intervención en el crecimiento del cabello. Las principales ventajas de esta técnica son que es imparcial, cuantificable y reproducible.

Esto es extremadamente importante porque le permite utilizar estándares, técnicas estadísticas como Inova para determinar la significación estadística de los resultados. Para este protocolo, utilice un generador de imágenes de gel con una fuente de luz incorporada para la fotografía reflectante. Esto garantiza una buena uniformidad de la luz, mientras que la iluminación trans crea siluetas inadecuadas para el análisis.

Comience preparando el generador de imágenes en gel, establezca el enfoque y el campo de visión. Usando algo de texto impreso, el mouse puede estar ligeramente desenfocado, ya que esto realmente funciona. Para reducir los errores cuánticos en pequeñas regiones de interés, verifique la uniformidad de la fuente de luz en la región fotografiada con el objetivo de obtener un excelente promedio óptico en la región de interés.

A continuación, prepara al animal. Seleccione un anestésico de inicio rápido y corta duración de la acción y administre lo suficiente para mantener a los animales quietos para la fotografía. Ahora coloque los animales en el generador de imágenes verticalmente y lo más cerca posible del paralelo.

Para las fotografías dorsales, coloque a los animales en posición prona con las extremidades extendidas. Para las fotografías ventrales, coloque a los animales en posición supina. Asegúrese de que no estén girados lateralmente.

Los valores de absorción se pueden extraer entre imágenes, pero esto no es para lo que se diseñó la máquina. Por lo tanto, agregar un estándar de escala de grises nos permite normalizar los valores de absorción al compilar los datos. Ahora coloque el estándar de escala de grises en la región fotografiada.

A continuación, cierre la cámara y reduzca la iluminación ambiental que pueda entrar en la cámara de la cámara. Establezca el número F en una exposición que haga que el área de interés no esté sobresaturada ni subexpuesta. A continuación, toma una fotografía.

Si se elige el número F de manera que la imagen esté saturada, el valor de la escala de grises se fijará en el valor y B de ninguna utilidad. A continuación, cambie el F.Stop por uno, manteniendo el área de interés y el estándar en un rango de exposición lineal, y tome una segunda fotografía con la fotografía completada. Coloque a los animales en una mesa de calentamiento y vigílelos hasta que se recuperen.

Esternal recostado. Luego, devuelva a los animales a sus jaulas y, finalmente, al vivero para su recuperación completa. Para cuantificar la absorción de luz utilizando el software de imágenes en gel, marque las regiones de interés en las imágenes de los animales para obtener una vista dorsal de todo el animal.

Use una imagen rectangular, una imagen ovalada o una herramienta de mano libre para delinear un espacio desde las extremidades superiores hasta las extremidades inferiores, extendiéndolo lateralmente tanto como sea posible. Manténgalo dentro de los márgenes de la espalda del animal para obtener una vista ventral de todo el animal. Usa dos rectángulos.

Uno para cubrir la región pélvica, que está arreglada, y otra para cubrir la zona del pecho, que no está arreglada. Las regiones de interés más pequeñas, como el lugar donde se administró un medicamento, también se pueden marcar como necesarias. En segundo lugar, marque la región de interés en el estándar de absorción de la escala de grises.

A continuación, registre la absorción de cada región de interés marcada para compararla entre fotografías. Normalice los niveles de absorción al estándar de fondo utilizando una relación logarítmica de exposición a la absorción. Para ello, trace una curva del logaritmo de exposición frente al logaritmo de absorción.

Utilizando los valores obtenidos del estándar de absorción de la escala de grises, ajuste las variaciones en el estándar de cada fotografía de la siguiente manera. En primer lugar, seleccione el número F para la lectura del ROI y el número F para la referencia y calcule la absorción media del estándar en todas las fotografías en el número F de lectura. Este promedio es el valor estándar de referencia o el VRS.

A continuación, calcule la diferencia de absorción entre los ajustes de F-Stop de lectura y referencia en cada fotografía y realice los mismos cálculos para el estándar y para cada ROI definido. Ahora, utilizando los datos de un F-stop, calcule la absorción corregida para cada ROI utilizando la fórmula que se muestra. A continuación, se aplicaron métodos estadísticos estándar para analizar los datos de los ratones injertados C3 HHEJ, cuyo modelo de alopecia ADA se analizó utilizando el método descrito a diferentes exposiciones.

Las variaciones en el ROI no superpuesto se correlacionaron estrechamente como se esperaba. Comparaciones similares produjeron la misma correlación estrecha durante un período de tres semanas. Se tomaron imágenes de los ratones para cuantificar la pérdida de pelo que esperaban.

El 80% de los ratones fotografiados mostraron pérdida de cabello en este período de tiempo. En comparación, los ratones C 57 negros seis normales no mostraron ninguna pérdida de pelo en el mismo período de tiempo. En un segundo estudio, se cuantificó la alopecia inducida por quimioterapia mediante la técnica descrita.

Los ratones fueron tratados con ciclofosfamida durante tres semanas y después de dos meses mostraron una pérdida de cabello significativa en comparación con los controles. Una vez dominada, cada imagen puede ser analizada en menos de cinco minutos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar la cantidad de crecimiento de pelo en roedores utilizando un sistema de imágenes de gel estándar.