Análisis cuantitativo de la migración desordenada de las células mediante microscopía de Time-lapse vídeo

El objetivo general del siguiente experimento es medir cuantitativamente la migración de células en tiempo real utilizando microscopía de lapso de tiempo de video. Esto se logra recubriendo primero una placa de cultivo de seis pocillos con colágeno y luego sembrando escasamente las células de interés en la placa recubierta. Como segundo paso, se crea una herida en la placa con una punta de pipeta, lo que garantiza un amplio espacio para la migración.

A continuación, se configura el microscopio y se capturan las imágenes a intervalos regulares utilizando un sistema de control de temperatura para permitir el monitoreo continuo de las células migratorias en tiempo real. En última instancia, el protocolo de seguimiento de partículas se utiliza para evaluar las diferencias en la velocidad media y el desplazamiento total de las celdas de prueba y control. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el ensayo de migración en cámara evitativa, es que no se basa en mediciones cuantitativas de migración de punto final.

En cambio, permite monitorear y calcular diferentes parámetros de forma continua. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del cáncer, como ¿cómo afectan determinados genes o fármacos a la migración de las células tumorales? Dos días antes del procedimiento, agregue 1,5 mililitros de colágeno diluido en medios ópticos a cada pocillo de una placa de cultivo de seis pocillos, y luego incube la placa durante la noche a cuatro grados centígrados un día antes del procedimiento.

Resuspenda las células de interés en dos mililitros de DMEM más FBS por pocillo y transfiera las células a cada pocillo de la placa recubierta de colágeno ENC, incubando las células durante la noche a 37 grados centígrados. El día del procedimiento. Utilice una punta de pipeta para crear una herida en las células cultivadas durante la noche y lave cada pocillo con PBS para eliminar cualquier residuo que se haya formado como resultado de la herida.

Agregue DMEM más FBS a los pocillos enjuagados y luego verifique bajo el microscopio para confirmar que se ha creado un espacio limpio para la herida. Después de encender la cámara del microscopio y el aparato de imágenes de células vivas, coloque la placa sobre la platina del microscopio. Cubra la placa con la nueva cámara de control ambiental de celda viva y configure el termostato a 37 grados Celsius y el dióxido de carbono a 5%Ahora abra el software del libro de diapositivas en la barra de menú.

Seleccione el control de enfoque haciendo clic en el botón F dentro de un círculo. En el cuadro de objetivo, use la ventana desplegable para definir el objetivo En el cuadro de conjunto de filtros, seleccione la configuración para dirigir la ruta de luz a la pieza I. Seleccione el filtro apropiado para la iluminación de campo claro y luego haga clic en abrir Brillante.

Para abrir el obturador de campo claro. Ahora seleccione el filtro de campo claro en la torreta y visualice la muestra a través del ocular para encontrar los campos apropiados y enfocar la muestra. Luego mueva la torreta del filtro para cambiar la ruta de la luz a la cámara Para la captura de imágenes en el software del libro de diapositivas, haga clic en el control de enfoque, seleccione XY para seleccionar diferentes posiciones a través de la pieza I y, a continuación, haga clic en establecer punto para bloquear cada ubicación.

Para la captura de imágenes, ajuste manualmente el enfoque de la imagen de la cámara que se visualiza en la pantalla y, a continuación, utilice las herramientas de la ventana de controles de enfoque para ajustar la posición Z del escenario. Para obtener los mejores resultados, concéntrese en las protuberancias celulares planas cerca del contacto con la placa para ayudar con el enfoque. Utilice el control deslizante para ajustar los tiempos de exposición para que estén en un rango adecuado para enfocar.

Si se han seleccionado varias posiciones XY, ajuste el enfoque para cada posición individual seleccionando el control de enfoque. Luego xy, luego punto de visita. En el libro de diapositivas, seleccione el gráfico de la cámara en la barra de menús, seleccione el tipo de captura y, a continuación, el lapso de tiempo para seleccionar el período de tiempo del experimento.

En el menú desplegable, escriba el retraso deseado entre el comienzo de un punto de tiempo y el comienzo del siguiente. En los campos de intervalo, el tercer campo se calculará automáticamente a partir de los valores introducidos manualmente. En Captura XY múltiple, seleccione la lista de varios puntos para los experimentos con más de una posición XY.

Finalmente, asigne un nombre al archivo para guardar el archivo, vaya a control de captura y seleccione avanzado, luego cola de impresión. A continuación, capture en la memoria y guarde en el archivo de cola después de cada punto de tiempo. Comience haciendo clic en la imagen.

En la barra de menú del libro de diapositivas, seleccione importar en el menú desplegable y luego haga clic en cola de libro de diapositivas. Seleccione los archivos de libro de diapositivas deseados generados a partir del experimento de migración para varios campos y puntos de tiempo. Abra el primer archivo, luego seleccione máscara en la barra de menú y elija protocolo de seguimiento de partículas en el menú desplegable.

En el menú de seguimiento de partículas, elija el protocolo de seguimiento manual de partículas. Aparecerá una ventana con puntos de tiempo de inicio y finalización Para analizar la migración aleatoria, seleccione máscara y, a continuación, protocolo de seguimiento de partículas. De nuevo, para determinar las coordenadas del centro del objeto, seleccione centro del área.

A continuación, haga clic en rastrear y continuar. Ahora elija las estadísticas deseadas para cada camino, como el desplazamiento y la velocidad promedio. Como se muestra aquí, haga clic en calcular para ver las estadísticas.

En este cuadro se muestra un ejemplo de un análisis de migración aleatoria cuantificado en términos de velocidad. En el gráfico de Bigotes, en este experimento, hubo un aumento en la velocidad promedio en las células M-D-A-M-B 2 31 con un gen supresor de tumores derribado. En comparación con las células de control M-D-A-M-B 2 31 aquí, se analizó la migración aleatoria de las células de la primera figura en términos de desplazamiento celular.

Una vez más, el grupo de knockdown de genes supresores de tumores totales tuvo un mayor desplazamiento celular en comparación con el control M-D-A-M-B 2 31. Las células en este control de película de microscopía de video de lapso de tiempo MDA MB 2 31 células se asentaron sobre colágeno durante la noche. Luego, las imágenes se tomaron a intervalos de una hora durante un total de 18 horas durante la migración aleatoria.

Observe cómo las celdas se alejan de sus posiciones originales con el tiempo. En esta película, se registró y analizó la migración de las células de prueba M-D-A-M-B 2 31 después de la siembra nocturna en colágeno. Tenga en cuenta que las celdas de prueba son más migratorias en comparación con las celdas de control de la película anterior.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la invasión celular y las dynas para responder preguntas adicionales como, ¿cuáles son las funciones de las células en la metástasis del cáncer después de su desarrollo? Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular exploraran la migración celular utilizando líneas celulares cancerosas aisladas.