Name: Medición de la estabilidad de proteínas en la sala de embriones de pez cebra Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Aprende a medir la estabilidad de proteínas en embriones de pez cebra utilizando FDAP. Este método fotoconvertible permite determinar semividas intracelulares y extracelulares en tiempo real.

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Los autores desean agradecer a Jeffrey Farrell, James Gagnon, y Jennifer Bergmann para comentarios sobre el manuscrito. KWR fue apoyada por el Programa de Becas de la Fundación Nacional de Ciencia de Posgrado de Investigación durante el desarrollo del ensayo FDAP. Este trabajo fue apoyado por becas de los NIH para AFS y por becas de la Fundación Alemana de Investigación (Programa de Emmy Noether), la Sociedad Max Planck, y el Programa de Human Frontier Science (Premio de carrera) a PM.

1. Generación de un fotoconvertible Fusión Construir y Inyectar dechorionated embriones de pez cebra <ol><li> Generar una construcción funcional que contiene la proteína de interés fusionada a una proteína fotoconvertible de verde a rojo (ver Discusión), a continuación, utilizar la transcripción in vitro para generar cubiertas de ARNm que codifica la proteína de fusión como en Müller et al., 2012 19. </li><li> Utilice pronasa para eliminar los chorions de aproximadamente 30 embriones de pez cebra en la etapa de una célula. Alternativamente, dechorionate manualmente embriones utilizando fórceps 28. Nota: Los embriones deben dechorionated para la imagen posterior. Si se desea, los embriones se pueden inyectar a través del corion y dechorionated más tarde, justo antes de la imagen. <ol><li> Hacer una solución de 5 mg / ml de stock de pronasa a partir de Streptomyces griseus en medio de embrión de pez cebra 19 estándar. Roca la solución suavemente a TA durante 10 min para permitir que la proteasa se disuelva. Alícuota 2 ml en tubos de microcentrífuga y congelar a -20 ° C. </li><li> De transferencia de fase de una célula embriones a un vaso de diámetro 5 cm o placa Petri de plástico de agarosa-recubierta que contiene ~ 8 ml de medio de embrión. Añadir 2 ml de solución de pronasa Stock descongelado al plato y se incuba a temperatura ambiente durante 5 a 10 minutos. </li><li> Evite la exposición de los embriones al aire o de plástico, ya que el contacto con cualquiera de los dos hará que los embriones dechorionated la rotura. Llene un vaso de vidrio de 200 ml con medio embrión. La transferencia de los embriones al vaso de precipitados por la inclinación de la placa de Petri mientras sumerge en el medio. </li><li> Después de los embriones han depositado en el fondo del vaso de precipitados, se vierte la mayor parte del medio de embrión, luego verter medio de embrión fresco en el vaso de precipitados. El remolino suave del medio de verter en el vaso de precipitados provoca embriones pierdan sus chorions debilitados. </li><li> Repita el paso 1.2.4. </li></ol></li><li> La transferencia de los embriones dechorionated a un plato de inyección de agarosa recubiertas con 29 utilizando una pipeta Pasteur de vidrio con una punta flameado. Llameantela punta de la pipeta evita que los bordes dentados de embriones hiriendo. </li><li> Co-inyectar el ARNm y un 3 kDa Alexa488-dextrano conjugado 29,30 (Figura 1B; véase la discusión para sugerido ARNm y cantidades Alexa488-dextrano). Inyectar directamente en el centro de la célula (no la yema) para asegurar una distribución uniforme de ARNm y colorante fluorescente una vez que comienza la escisión. Nota: La señal Alexa488 se utilizará durante el análisis de datos para generar máscaras compartimentales con el fin de distinguir entre la fluorescencia intracelular y extracelular. </li><li> Transferencia de embriones inyectados a un pozo de agarosa recubiertas de 1-2% de un plato de seis pocillos de plástico llena de medio de embrión. Incubar en la oscuridad a 28 ° C hasta que los embriones han alcanzado esfera última etapa 31 (aproximadamente después de la fecundación 5 h). Compruebe embriones cada uno a 2 horas bajo un microscopio estereoscópico y eliminar los residuos generados por los embriones que han muerto. </li></ol> 2. Montaje embriones de pez cebra para Photoconversion e Imagen en un microscopio confocal invertido <ol><li> Utilice un estereomicroscopio para identificar cuatro y cincuenta y nueve embriones sanos, y utilizar una pipeta Pasteur de vidrio con una punta de flameado para eliminarlos de la placa. </li><li> Expulsar suavemente los embriones en un tubo de microcentrífuga que contiene ~ 1 ml de derretida 1% agarosa de bajo punto de fusión en medio de embrión de 1x Danieau (ver Lista de Materiales) (Figura 2A). Nota: Agarosa debe tener una temperatura entre 40 y 42 ° C; temperaturas más altas podrían dañar los embriones. </li><li> Dibujar los embriones de nuevo en la pipeta junto con algunos de agarosa. Expulsar suavemente la agarosa y embriones en el cristal de la cubierta de un plato de fondo de vidrio (Figura 2B). Asegúrese de que el espesor de la cubierta de vidrio es compatible con el objetivo en el microscopio confocal. <ol><li> Re-utilizar la pipeta de vidrio si se desea. Para limpiar la agarosa residual de la pipeta y evitar la obstrucción, de forma rápida medio embrión pipeta hacia arriba y abajo.Colocar un tubo de 15 ml lleno de ~ 5 ml de medio de embrión junto al estereomicroscopio para este propósito. </li></ol></li><li> Utilice una sonda de metal para colocar los embriones de modo que el polo animal (blastodermo) se enfrenta a la cubierta de vidrio. Trabaje con rapidez ya que la agarosa se solidificará en 20-30 segundos. Utilice el microscopio estereoscópico para supervisar las posiciones de los embriones y reajustar si es necesario hasta que la agarosa se endurece. </li><li> Repetir los pasos 2.1 a 2.4 hasta que se ha montado el número deseado de embriones. Nota: En un experimento típico, cuatro gotas de agarosa que contienen cuatro o cinco embriones cada una caben fácilmente en la cubierta de vidrio. Alrededor de 16 embriones se pueden obtener imágenes durante un solo experimento ideales (Figura 2C). </li><li> Cuando la agarosa se ha solidificado, llenar el plato de fondo de vidrio con medio embrión de 1x Danieau. </li></ol> 3. Photoconverting y medición de la disminución de la señal Photoconverted Uno de los objetivos 25X o 40X agua is apropiado para el tamaño y el índice de refracción de embriones de pez cebra. Es mejor utilizar aceite de inmersión con el mismo índice de refracción que el agua en lugar de agua real es, ya que el agua se evaporará durante el curso del experimento de cinco horas. Asegúrese de que el aceite de inmersión está diseñado para ser utilizado con un agua (no aceite) objetivo. <ol><li> Colocar una gota grande de aceite de inmersión en el objetivo de garantizar que la película de aceite entre el objetivo y la cubierta de vidrio no se romperá como la etapa se mueve a diferentes posiciones embrión durante la formación de imágenes. Coloque de forma segura el plato con fondo de cristal en el escenario para que el plato no se mueva cuando el escenario se mueve. Si es posible, utilice una etapa se calienta a 28 ° C, la temperatura óptima para el desarrollo del pez cebra. </li><li> Definir la posición de cada embrión en el paquete de software del microscopio confocal. Ajuste la profundidad z para cada embrión, y tratar de apuntar a más o menos el mismo plano en cada embrión. Nota: Sobre 30 micras desde el polo animal es un irprofundidad desde ya que en esta profundidad la capa envolvente del embrión se puede evitar, área de imagen se maximiza, y dispersión de la luz es mínimo. Una sola rebanada óptico con un espesor de ~ 3,3 micras proporciona datos suficientes; no hay necesidad de adquirir una pila z (véase la sección 5). </li><li> Recoger dos señales durante el experimento: la señal de &quot;verde&quot; de la Alexa488-dextrano conjugado que se utilizará durante el análisis de datos para aislar extracelular e intracelular de fluorescencia y la señal de &quot;red&quot; de la proteína de fusión después de que se photoconverted. <ol><li> Excite Alexa488 utilizando un láser de 488 nm, y recoger la fluorescencia emitida entre ~ 500 y 540 nm. Nota: Después de fotoconversión, muchos de verde a rojo proteínas fotoconvertible (por ejemplo, Dendra2) puede ser excitado con un láser de 543 nm y emiten fluorescencia entre ~ 550 y 650 nm. Ajuste según sea necesario en función de la proteína fotoconvertible utilizado. </li></ol></li><li> Adquirir &quot;pre-fotoconversión&quot;Las imágenes, y configurar el software del microscopio confocal de imagen cada una de las posiciones previamente definidas (desde el paso 3.2) con las condiciones de imagen apropiadas cada 10 o 20 minutos para un curso de tiempo de cinco horas (ver sección 5 y Discusión). </li><li> Para photoconvert la proteína de fusión, cambiar a un objetivo de 10X y exponer grupos de embriones a la luz UV de una lámpara de arco de mercurio con un filtro de ~ 300-400 nm de excitación en la salida 100% durante 2 min. Cambiar el enfoque a lo largo del eje z para promover fotoconversión uniforme (véase la Sección 5). Asegúrese de que el aceite de inmersión no gotee sobre el objetivo 10x durante fotoconversión. Nota: El cambio de enfoque durante fotoconversión podría ser automatizado con el fin de evitar la variabilidad entre los experimentadores. </li><li> Cambie de nuevo al objetivo 25X o 40X inmediatamente después fotoconversión. Asegúrese de que las posiciones previamente definidas desde el paso 3.2 siguen siendo precisa. Si el plato se desplazó durante photoconversión, vuelva a definir las posiciones de los embriones. <ol><li> Inicie el programa creado en el paso 3.4 y permite imágenes de continuar durante 5 horas. Tenga en cuenta el tiempo transcurrido entre fotoconversión y el inicio de formación de imágenes para cada embrión. </li></ol></li><li> Comprobar de vez en cuando en el experimento. Controle el nivel de medio de Danieau y añadir más si es necesario. Reinicie el software si se ha estancado. </li><li> Con el fin de determinar los valores de fluorescencia de fondo que se utilizará durante el análisis de datos para estimar la asíntota de un modelo exponencial decreciente, incluir algunos embriones que han sido inyectados con Alexa488-dextrano pero no mRNA en el experimento. Para determinar el ruido del instrumento, que también se utiliza durante el análisis posterior de los datos, adquirir una imagen en ausencia de una muestra. </li></ol> 4. El análisis de los datos mediante PyFDAP <ol><li> Inspeccione visualmente el tiempo de los conjuntos de datos curso de cada embrión. Deseche los conjuntos de datos a partir de embriones que murieron durante imaging, que cambió de manera significativa, que tienen muy bajos niveles de señal photoconverted, o que contienen regiones de células con aspecto inusual y han dejado de moverse y dividiendo (típico de embriones heridos o enfermos). Nota: En ocasiones, las burbujas en el aceite de inmersión u otros artefactos aparecerán en una o dos imágenes en un conjunto de datos de otra forma utilizable. Nota alguna de las imágenes que contienen artefactos; que serán descartados después, y los puntos de tiempo restante desde un conjunto de datos tales todavía pueden ser analizados. </li><li> Utilice el paquete de software PyFDAP basado en Python para analizar los datos FDAP. PyFDAP calcula vidas medias mediante la determinación de la intensidad media de fluorescencia roja intracelular y extracelular en cada imagen y ajuste de los datos con una función exponencialmente decreciente 56 (Figura 3). <ol><li> Descarga PyFDAP (ver Lista de Materiales). </li><li> Uso PyFDAP para separar la señal intracelular y extracelular photoconverted (Figura 3A, B). Nosotrose la señal Alexa488, que es estrictamente intracelular, para crear una máscara de intracelular. Aplique esta mascarilla para la imagen del canal rojo correspondiente para evitar píxeles intracelulares de ser considerado en el cálculo de la intensidad media extracelular. Para medir la intensidad media intracelular, invertir la máscara. </li><li> En PyFDAP, mostrar las imágenes enmascaradas generados en el paso 4.2.2. Inspeccione visualmente estas imágenes y descarte los conjuntos de datos en la que las máscaras no distinguen con precisión intracelular desde el espacio extracelular (esto debe ser raro; en cuenta que las membranas celulares se incluyen en imágenes en las que el espacio extracelular se ha enmascarados, pero podrían ser eliminados por alterar el umbral algoritmo o mediante la introducción de una máscara de membrana (por ejemplo, usando la membrana PPC)). También deseche cualquier imágenes individuales que contienen artefactos (por ejemplo, las burbujas en el aceite de inmersión) identificados en el paso 4.1. </li><li> Utilice PyFDAP para calcular la media intensidad de fluorescencia extracelulares e intracelulares para each imagen. PyFDAP calcula los promedios sumando las intensidades de los píxeles que caen fuera de la máscara y dividiendo por el número total de píxeles sumadas. </li><li> Coloque los datos de fluorescencia (Figura 3C) con la siguiente función exponencial: <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52266/52266eq1.jpg" width="159" /> donde t es el tiempo post-fotoconversión, c (t) es la intensidad a un valor dado de t, c 0 es la intensidad en t = 0, k es la constante de velocidad de eliminación, e y 0 es la asíntota que la función se acerca como fluorescencia disminuye (Figura 1D). y 0 puede ser limitado basado en las mediciones en el paso 3.8 19. </li><li> Utilice PyFDAP para calcular la vida media de la proteína extracelular e intracelular (τ) de las constantes de velocidad de aclaramiento (k) utilizando la siguiente relación: <img fo:content-width = src &quot;1in&quot; = &quot;/ files / ftp_upload / 52266 / 52266eq2.jpg&quot; width = &quot;153&quot; /&gt; </li></ol></li></ol> 5. Los experimentos de control para evaluar Photobleaching, inadvertida Fotoconversión y Fotoconversión Uniformidad <ol><li> Fotoblanqueo Evaluación Nota: Photobleaching podría causar una disminución en la intensidad de fluorescencia de artefactos que refleja las propiedades blanqueadoras de la proteína fluorescente, además de la eliminación de la proteína de interés. <ol><li> Para evaluar la posible fotoblanqueo, realizar una serie de experimentos FDAP con intervalos de 10 minutos entre imágenes y un segundo grupo con 20 min intervalos entre las imágenes (Figura 4). Analizar los datos de ambos conjuntos de experimentos utilizando PyFDAP como se describe en la Sección 4. </li><li> Comparar la vida media de los 10 y 20 experimentos de intervalo min. Media más larga vida de 20 min experimentos de intervalo indican fotoblanqueo significativo. Si las vidas medias de ambos experimentos son idénticos, Fotosobleaching no es una preocupación significativa. </li><li> Por otra parte, evaluar fotoblanqueo mediante la adquisición de una serie de ~ 30 imágenes inmediatamente después fotoconversión. Una disminución significativa en la intensidad de fluorescencia indica photobleaching significativo. </li><li> Si se detecta fotoblanqueo, utilizar la potencia del láser inferior, disminuir el tiempo de formación de imágenes, o considerar el uso de una proteína fotoconvertible más fotoestable 32. </li></ol></li><li> Evaluación de fotoconversión inadvertida. Nota: se puede Dendra2 photoconverted usando 488 nm iluminación 27. Cuando Alexa488 emocionante con el láser de 488 nm tal como se describe en el paso 3.3.1, fotoconversión inadvertida y por lo tanto un aumento de artefactos en la vida media aparente de la proteína de interés es posible. Sin embargo, nosotros y otros 33 hemos encontrado que 488 nm iluminación es un método ineficiente de fotoconversión en embriones de pez cebra. <ol><li> Utilice el experimento de control se describe en el paso 5.1.1 para detectar fotoconversión inadvertida. Comparar la vida media de los 10 y 20 experimentos de intervalo min. Vidas medias más cortas de 20 minutos de intervalo experimentos indican fotoconversión involuntaria significativa. Si las vidas medias de ambos experimentos son idénticos, fotoconversión inadvertida no es una preocupación significativa. </li><li> Si se detecta fotoconversión inadvertida, utilice una fuente de láser de 488 nm inferior y los tiempos de imagen más cortos para evitar inadvertidamente photoconverting Dendra2. </li></ol></li><li> Evaluación de la homogeneidad fotoconversión. Nota: Si fotoconversión está sesgado hacia el polo animal del embrión, la disminución de la fluorescencia se verá influenciada por difusión proteína o el movimiento celular en planos más profundos (Figura 5A). <ol><li> Para determinar si fotoconversión es uniforme, expresar una proteína secretada fotoconvertible (para los experimentos con proteínas de fusión extracelulares) o una proteína citoplasmática fotoconvertible (para los experimentos con proteínas de fusión intracelulares). Photoconvert como de costumbre, tgallina adquieren un z-pila que abarca la mayor parte del blastodermo cada 20 min durante 80 min. </li><li> Si fotoconversión está sesgada hacia el polo animal, la intensidad de fluorescencia en planos más profundos aumentará con el tiempo debido a la difusión o movimiento de las células (Figura 5B). Si se detecta fotoconversión no uniforme, se centran más en los embriones durante fotoconversión. </li></ol></li></ol>

Los autores no tienen conflictos a revelar.

El éxito de un experimento FDAP se basa en la generación de una proteína de fusión fotoconvertible funcional. Etiquetado de una proteína puede afectar a su actividad biológica y / o propiedades biofísicas, incluyendo su localización, la solubilidad y la estabilidad 36-41. Estar preparado para probar la actividad de varias construcciones de fusión diferentes con el fin de encontrar uno que es activo. Hemos encontrado que el cambio de la posición de la proteína fotoconvertible relación a la proteína de interés ...

Los niveles de proteínas en células y organismos están determinadas por sus tasas de producción y el aclaramiento. Proteínas vidas medias pueden variar desde minutos a días 1-4. En muchos sistemas biológicos, la estabilización o eliminación de proteínas clave tiene efectos importantes sobre la actividad celular. Se requiere la modulación de la estabilidad de la proteína intracelular para la progresión del ciclo celular 5,6, la señalización del desarrollo 7-9, apoptosis 10, y la función normal y el mantenimiento de las neuronas 11,12. Estabilidad de la proteína extracelular afecta a la distribución y la disponibilidad de las proteínas secretadas, tales como morfógenos 13,14, dentro de un tejido. Durante las últimas décadas, la estabilidad de proteínas principalmente se ha evaluado en cultivo celular utilizando pulsos marcaje radioactivo o experimentos de persecución cicloheximida 15. En estos experimentos de pulso-caza, las células son o bien transitoriamente expuestos a un &quot;pulso&quot; de amino radiactivoprecursores de ácido que se incorporan en las proteínas recién sintetizadas, o que están expuestos a la cicloheximida, que inhibe la síntesis de proteínas. Las células cultivadas se recogen a diferentes puntos de tiempo, y, o bien inmunoprecipitación seguido por autorradiografía (en los experimentos de pulso-caza radiactivos) o Western Blot (en experimentos de cicloheximida) se utiliza para cuantificar la liquidación de la proteína en el tiempo. Ensayos de estabilidad de proteínas convencionales tienen varias deficiencias. En primer lugar, las proteínas en estos ensayos a menudo no se expresan en sus entornos endógenos, sino más bien en el cultivo de tejidos y algunas veces en las células de diferentes especies. Para las proteínas cuya estabilidad es dependiente del contexto, este enfoque es problemático. En segundo lugar, no es posible seguir el aclaramiento de proteínas en las células individuales o los organismos con el tiempo, y los datos de estos ensayos refleja un promedio de diferentes poblaciones de células en diferentes puntos de tiempo. Dado que las células individuales pueden haber comenzadocon diferentes cantidades de proteína, pudo haber tomado la etiqueta o cicloheximida radiactivo en diferentes momentos, o puede tener diferentes cinética de depuración, tales datos agregados podrían ser engañosas. Finalmente, en el caso de los experimentos de persecución cicloheximida, la adición del inhibidor de la síntesis de proteínas puede tener efectos fisiológicos no deseados que podrían alterar artificialmente estabilidad de la proteína 16-18. Estas deficiencias se pueden evitar mediante el uso de fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP), una técnica que utiliza proteínas fotoconvertible para medir la eliminación de proteínas de forma dinámica en los organismos vivos 19-25 (véase la discusión de las limitaciones de la técnica FDAP). Proteínas fotoconvertible son proteínas fluorescentes cuya excitación y de emisión propiedades cambiar después de la exposición a determinadas longitudes de onda de la luz 26. Una variante comúnmente usado es Dendra2, una proteína fotoconvertible &quot;-verde a rojo&quot; que tiene inicialmente excitas y emisión propiedades similares a las proteínas fluorescentes verdes, pero después de la exposición a &quot;fotoconversión&quot; UV iluminación -su de excitación / propiedades de emisión se vuelven similares a los de las proteínas fluorescentes rojas 23,27. Es importante destacar que, nueva proteína producida después de fotoconversión no tendrá las mismas propiedades de excitación / emisión como la proteína photoconverted, lo que permite el desacoplamiento de la producción y el despacho al fotoconversión y la observación de sólo una piscina de la proteína photoconverted. Etiquetado de proteínas de interés con proteínas fotoconvertible tanto, proporciona una manera conveniente a pulso la etiqueta proteínas en organismos vivos, ópticamente accesibles intactas. En los ensayos de FDAP (Figura 1A), una proteína de interés se marca con una proteína fotoconvertible y se expresa en un organismo vivo (Figura 1B). La proteína de fusión se photoconverted, y la disminución en la señal photoconverted lo largo del tiempo se controla mediante fluorescenmicroscopía ce (Figura 1C). Los datos se ajusta entonces con un modelo apropiado para determinar la vida media de la proteína de fusión (Figura 1D). El ensayo FDAP descrito aquí fue diseñado para determinar las vidas medias extracelulares de las proteínas de señalización secretadas en embriones de pez cebra durante la embriogénesis temprana 19. Sin embargo, este enfoque puede ser adaptado a cualquier organismo modelo transparente que tolera la formación de imágenes en vivo, y podría ser utilizado para monitorear la liquidación de cualquier proteína intracelular o extracelular taggable. Las variaciones de la técnica descrita aquí se han realizado en células cultivadas Drosophila 20,23 y 22 y 21 embriones de ratón.

<table><tbody><tr><td>PyFDAP (descargar desde el siguiente sitio web: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)</td><td></td><td></td><td>Instale y opere siguiendo las instrucciones proporcionadas en el sitio web de PyFDAP; PyFDAP es compatible con los sistemas operativos Linux, Mac y Windows.</td></tr><tr><td>mMessage mMachine Sp6 Kit de transcripción</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td>Para generar ARNm tapado para inyectar en embriones</td></tr><tr><td>Conjugado Alexa488-dextran, 3 kDa</td><td>Life Technologies</td><td>D34682</td><td>Coinyectar con ARNm para crear mascarillas intracelulares y extracelulares</td></tr><tr><td>Plato de plástico de 6 pocillos</td><td>BD Falcon</td><td></td><td>Incubar embriones en pocillos recubiertos de agarosa hasta que estén listos para el montaje</td></tr><tr><td>Medio embrionario</td><td></td><td></td><td>250 mg/L de sal oceánica instantánea, 1&nbsp; mg/L de azul de metileno en agua de ósmosis inversa ajustada a pH 7 con NaHCO3</td></tr><tr><td>Proteasa de Streptomyces griseus</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td>Haga un caldo de 5 mg/ml y utilícelo a 1&nbsp; mg/ml para decorionar embriones en la etapa unicelular</td></tr><tr>Placa <td></td><td></td> de<td>Petri de vidrio de 5 cm de diámetro</td><td>Para la descorionación de embriones</td></tr><tr>Vaso <td></td><td></td> de<td>vidrio de 200 ml</td><td>Para la descorionación de embriones</td></tr><tr><td>Aparato</td><td></td><td></td> de microinyección <td>Para la inyección de ARNm y colorante en embriones en la etapa unicelular</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td></td><td></td><td>Para inyectar y montar embriones</td></tr><tr><td>1x Medio de</td><td></td><td></td> Danieu <td>Diluya la agarosa de bajo punto de fusión y realice imágenes en este medio; receta: solución filtrada de 0,2 mm de 58 mM de NaCl, 0,7 mM de KCl, 0,4 mM de MgSO4, 0,3 mM de CaCl2, 5&nbsp; mM HEPES pH 7.2</td></tr><tr><td>UltraPure agarosa de bajo punto de fusión</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td>Para el montaje de embriones; utilizar a una concentración del 1% en el medio de Danieau: añadir 200 mg a 20 ml de medio de Danieau, calentar en el microondas hasta que se disuelva, luego alícuota 1&nbsp; ml en tubos de microcentrífuga; Las alícuotas se pueden almacenar a 4 & grados; C, refundido a 70&nbsp; &deg; C, y enfriado a 40&#8211; 42 &deg; C cuando esté listo para usar</td></tr><tr><td>Pipeta Glass Pasteur</td><td>Kimble Chase (via Fisher)</td><td>63A53WT</td><td>Para el montaje de embriones; flamee la punta para evitar que los bordes dentados dañen los embriones</td></tr><tr><td>Sonda</td><td></td><td></td> metálica <td>Para posicionar los embriones durante el montaje</td></tr><tr><td>Platos con fondo de vidrio</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Utilice el espesor de cubreobjetos adecuado para su objetivo; el número de pieza que aparece aquí es para el cubreobjetos n.º 1.5</td></tr><tr><td>Tubo de 15 ml lleno de ~5 ml de medio embrionario</td><td>BD Falcon</td><td></td><td>Para el enjuague residual de la pipeta Pasteur</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td> confocal de barrido láser invertido <td>Una lámpara de arco de mercurio, 488&nbsp; Se requiere láser nm, láser de 543 nm y los juegos de filtros adecuados</td></tr><tr><td>Etapa</td><td></td><td></td> calentada <td>Para mantener los embriones a la temperatura óptima de 28 & grados; C durante el experimento</td></tr><tr><td>Software confocal capaz de obtener imágenes</td><td></td><td></td> de lapso de tiempo <td>Debe ser capaz de definir múltiples posiciones y obtener imágenes automáticamente de ellas a intervalos definidos&nbsp;</td></tr><tr>Objetivo <td></td><td></td> de <td>agua 25X o 40X</td><td>Objetivo para la imagen</td></tr><tr><td>Objetivo</td><td></td><td></td> de aire 10X <td>Objetivo para la fotoconversión</td></tr><tr><td>Aceite</td><td></td><td></td> de <td>inmersión Aceite de inmersión con el mismo índice de refracción que el agua</td></tr></tbody></table>

medición de la estabilidad de proteínas en la sala de embriones de pez cebra utilizando fluorescencia decay después fotoconversión (fdap)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Estabilidad de la proteína influye en muchos aspectos de la biología, y la medición de la cinética de eliminación de proteínas puede proporcionar importantes conocimientos sobre los sistemas biológicos. En experimentos FDAP, la liquidación de las proteínas dentro de los organismos vivos se puede medir. Una proteína de interés se marca con una proteína fluorescente fotoconvertible, expresada in vivo y photoconverted, y la disminución en la señal de photoconverted lo largo del tiempo se controla. Los datos se ajusta entonces con un modelo de espacio libre apropiado para determinar la vida media de la proteína. Es importante destacar que la cinética de remoción de las poblaciones de proteínas en los diferentes compartimentos del organismo pueden ser examinados por separado mediante la aplicación de máscaras compartimentales. Este enfoque ha sido utilizado para determinar la vida media intra y extracelulares de las proteínas de señalización secretadas durante el desarrollo de pez cebra. Aquí se describe un protocolo para experimentos FDAP en embriones de pez cebra. Debería ser posible utilizar FDAP para determinar la cinética de remoción decualquier proteína taggable en cualquier organismo ópticamente accesible.

FDAP se ha utilizado para determinar la vida media de las proteínas de señalización extracelular en embriones de pez cebra 19. Una de estas proteínas, estrabismo, induce la expresión de genes mesendodermal durante la embriogénesis 34. Estrabismo-Dendra2 activa la expresión de genes mesendodermal en niveles similares a untagged Estrabismo, como se demuestra por QRT-PCR y en ensayos de hibridación in situ 19. Los embriones se co-inyectados con Alexa488-dextrano y ARNm que...

Los niveles de proteína en células y tejidos son a menudo estrechamente regulada por el equilibrio de la producción y eliminación de proteínas. Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP), la cinética de eliminación de proteínas pueden ser medidos experimentalmente in vivo.

Medición de la estabilidad de proteínas en la sala de embriones de pez cebra Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

El objetivo general del siguiente experimento es medir la estabilidad de proteínas intracelulares y extracelulares en embriones vivos de pez cebra. Esto se logra marcando una proteína de interés con una proteína fluorescente fotoconvertible e inyectando ARNm, que codifica la fusión, así como un tinte fluorescente en embriones de pez cebra. A continuación, la proteína de fusión fotoconvertible se fotoconvierte, cuyo pulso marca la proteína.En este ejemplo, se segrega la proteína de fusión, luego se monitorea a lo largo del tiempo la disminución de la intensidad de fluorescencia fotoconvertida intra y extracelular y se le asigna una función exponencialmente decreciente para determinar las vidas medias intracelulares y extracelulares de la proteína de fusión. Los resultados muestran la estabilidad in vivo de las proteínas de fusión fotoconvertibles en función de la desintegración de la señal fluorescente a lo largo del tiempo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología celular y del desarrollo.Por ejemplo, cómo la estabilidad influye en la distribución y disponibilidad de proteínas. Utilizamos nuestro software EP para el análisis de datos FD DP.

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Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Microscopía multifotónica permite el control de fotones de baja energía con una penetración profunda óptica y fototoxicidad reducido. Se describe el uso de esta tecnología para el etiquetado de células vivas en embriones de pez cebra. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para la foto-inducción de varias moléculas que responden a la luz.

De dos fotones basado en fotoactivación en vivo embriones de pez cebra

Se describe un método para photoactivate células individuales que contienen una proteína fluorescente enjaulado con la absorción de dos fotones de un Ti: Zafiro de femtosegundos oscilador láser. Para asignar el destino de la célula fotoactivado, inmunohistoquímica se usa. Esta técnica se puede aplicar a cualquier tipo de célula.

Sola célula de mapeado de destino en el pez cebra

Aquí presentamos un método para el cambio fotoactivado de proteínas fluorescentes fotoconvertibles (PCFPs) en embriones vivos de pez cebra y el seguimiento posterior de la proteína fotoconvertida en puntos temporales específicos durante el desarrollo. Esta metodología permite el monitoreo de eventos de biología celular subyacentes a diferentes procesos de desarrollo en un organismo vertebrado vivo.

Celular seguimiento mediante fotoconvertible proteínas durante el desarrollo de pez cebra

Somitogenesis es un proceso de desarrollo rítmico que espacialmente los patrones de los ejes corporales de los embriones de vertebrados. Anteriormente, hemos desarrollado líneas de pez cebra transgénico que utilizan los reporteros fluorescentes para observar los genes cíclicos que impulsan este proceso. En este sentido, la cultura dispersamos las células de estas líneas y la imagen de sus oscilaciones en el tiempo en vitro.

Generación de Dispersed presomitic mesodermo Cultivos Celulares for Imaging del pez cebra Segmentación del Reloj en células individuales

El pez cebra es una herramienta popular para modelar la enfermedad renal crónica (ERC). Sin embargo, su pequeño tamaño hace que sea imposible para evaluar la función renal utilizando métodos tradicionales. Se describe un ensayo de aclaramiento renal tinte fluorescente 1 que permite el análisis cuantitativo de la función renal pez cebra en la ERC.

Evaluación del pez cebra función renal mediante un ensayo de Liquidación fluorescente

La mitosis es crítica para todo organismo vivo y los defectos a menudo conducen al cáncer y trastornos del desarrollo. Utilizando este protocolo de imagen y el pez cebra como sistema modelo, los investigadores pueden visualizar la mitosis en un organismo vertebrado vivo y la multitud de defectos que surgen cuando los procesos mitóticos son defectuosos.

La observación de la división mitótica y dinámica en un embrión de pez cebra en vivo

Este protocolo describe un método para determinar proteína vida media en las células adherentes vivas sola, con pulso de etiquetado e imagen Time-lapse de fluorescencia complemento etiqueta de proteínas de fusión.

Sola célula cuantificación de las tasas de degradación de proteína por microscopia de fluorescencia Time-lapse en cultivo de células adherentes

Las manipulaciones embriológicas como la extirpación y el trasplante de células son herramientas importantes para estudiar el desarrollo temprano. Este protocolo describe un dispositivo de trasplante simple y efectivo para realizar estas manipulaciones en embriones de pez cebra.

Un dispositivo de trasplante simple y efectivo para embriones de pez cebra

Aquí, presentamos un protocolo para marcar proteínas con una etiqueta de proteína de fluorescencia en larvas de pez cebra, un sistema in vivo recientemente desarrollado y modificado especialmente útil para visualizar proteínas de baja abundancia en pez cebra.

Marcaje de fluorescencia para visualizar proteínas de baja expresión en el pez cebra

Las rasopatías son síndromes genéticos multisistémicos causados por la hiperactivación de la vía RAS-MAPK. Las variantes potencialmente patógenas que están a la espera de validación surgen continuamente, mientras que la escasa evidencia preclínica limita el tratamiento. Aquí, describimos nuestro protocolo in vivo para probar y validar los niveles de activación de ERK asociados a RASopatía y su modulación farmacológica durante la embriogénesis mediante imágenes FRET en vivo en pez cebra...

Un protocolo eficiente para evaluar la modulación de la actividad de ERK en modelos tempranos de síndrome de Noonan de pez cebra mediante microscopía FRET en vivo e inmunofluorescencia

Aprende a medir la estabilidad de proteínas en embriones de pez cebra utilizando FDAP. Este método fotoconvertible permite determinar semividas intracelulares y extracelulares en tiempo real.

Medición de la estabilidad de proteínas en la sala de embriones de pez cebra Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP) (Video) | JoVE Journal

Medición de la estabilidad de proteínas en la sala de embriones de pez cebra Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP)

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