Medición de la estabilidad de proteínas en la sala de embriones de pez cebra Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP)

El objetivo general del siguiente experimento es medir la estabilidad de proteínas intracelulares y extracelulares en embriones vivos de pez cebra. Esto se logra marcando una proteína de interés con una proteína fluorescente fotoconvertible e inyectando ARNm, que codifica la fusión, así como un tinte fluorescente en embriones de pez cebra. A continuación, la proteína de fusión fotoconvertible se fotoconvierte, cuyo pulso marca la proteína.

En este ejemplo, se segrega la proteína de fusión, luego se monitorea a lo largo del tiempo la disminución de la intensidad de fluorescencia fotoconvertida intra y extracelular y se le asigna una función exponencialmente decreciente para determinar las vidas medias intracelulares y extracelulares de la proteína de fusión. Los resultados muestran la estabilidad in vivo de las proteínas de fusión fotoconvertibles en función de la desintegración de la señal fluorescente a lo largo del tiempo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología celular y del desarrollo.

Por ejemplo, cómo la estabilidad influye en la distribución y disponibilidad de proteínas. Utilizamos nuestro software EP para el análisis de datos FD DP. EP está disponible gratuitamente en nuestra página web Después de generar ARNm tapado en codificación a codificación, una proteína de fusión convertible en foto de verde a rojo de interés, transfiera aproximadamente 31 embriones de pez cebra en etapa celular a una placa de Petri de plástico recubierta de vidrio o agar de cinco centímetros de diámetro que contiene aproximadamente ocho mililitros de medio embrionario.

Agregue dos mililitros de solución calzada previamente preparada y descongelada al plato e incube a temperatura ambiente durante cinco a 10 minutos. Llene un altavoz de vidrio con medio para embriones y, evitando exponer los embriones al aire o al plástico, transfiera los embriones al vaso de precipitados inclinando la placa de Petri mientras la sumerge en el medio. Una vez que los embriones se hayan asentado en el fondo del vaso de precipitados, vierta la mayor parte del medio y use medio fresco para reemplazarlo con cuidado.

El leve remolino del medio fresco hará que los embriones pierdan su corión debilitado. Después de repetir el lavado, utilice una pipeta de PE de vidrio con punta flameada para transferir los embriones recubiertos a una placa de inyección recubierta de agarosa. A continuación, inyecte el ARNm y un conjugado de tres kilodalton Alexa 4 88 DExT Strand directamente en el centro de la célula para garantizar una distribución uniforme del ARNm y el tinte.

Una vez que comienza la escisión, transfiera los embriones inyectados a un pocillo recubierto de uno a 2% de agarosa de un plato de plástico de seis pocillos lleno de embrión, medio, e incube en la oscuridad a 28 grados centígrados hasta que los embriones alcancen la etapa esférica tardía con un microscopio estereoscópico, identifique de uno a cinco embriones sanos y use una pipeta de vidrio PE con una punta flameada para sacarlos del plato. Expulse suavemente los embriones en un tubo de microcentrífuga que contenga aproximadamente un mililitro de aros derretidos al 1% de bajo punto de fusión en un medio embrionario x danios. A continuación, vuelva a introducir los embriones en la pipeta junto con algunos aros.

A continuación, expulse suavemente las aros y los embriones sobre la cubierta. Vaso de un plato con fondo de cristal. Para reutilizar la pipeta de vidrio, limpie los aros residuales para evitar obstrucciones pipeteando rápidamente el medio embrionario hacia arriba y hacia abajo, trabajando rápidamente antes de que el aros se solidifique.

Use una sonda de metal para colocar los embriones de manera que el poste del animal mire hacia el vidrio de cobertura debajo del microscopio estereoscópico. Controlar las posiciones de los embriones y reajustar según sea necesario hasta que el agarro se endurezca. Cuando el agarro se haya solidificado, use un medio de embrión x danios para llenar el plato con fondo de vidrio.

Para prepararse para la fotoconversión, ajuste la incubadora a 28 grados centígrados y coloque una gran gota de aceite de inmersión en el objetivo para asegurarse de que la película de aceite entre el objetivo y el cubreobjetos no se rompa a medida que la etapa se mueve a diferentes posiciones del embrión. Durante la toma de imágenes de forma segura, coloque el plato con fondo de vidrio en el escenario para que el plato no se mueva cuando el escenario se mueva. A continuación, en el paquete de software del microscopio confocal, defina la posición de cada embrión.

Ajuste la profundidad Z para cada embrión e intente apuntar aproximadamente al mismo plano en cada embrión utilizando los láseres de 4 88 y 5 43 nanómetros. Adquirir imágenes previas a la conversión de fotos. A continuación, configure el software del microscopio confocal para obtener imágenes de cada una de las posiciones previamente definidas con las condiciones de imagen adecuadas.

Cada 10 o 20 minutos o un curso de tiempo de cinco horas para convertir la proteína de fusión en un objetivo de 10 x y exponer grupos de embriones a la luz ultravioleta de la lámpara de mercurio con un filtro de aproximadamente 300 a 400 nanómetros al 100% de salida durante dos minutos. Cambie el enfoque a lo largo del eje Z para promover una conversión de fotos uniforme después de la conversión de fotos. Vuelva al objetivo de 25 x o 40 x inmediatamente y confirme que las posiciones definidas anteriormente siguen siendo precisas.

Si el plato se movió durante la conversión de fotos, redefina las posiciones de los embriones. Inicie el curso de tiempo de imagen y deje que se ejecute durante cinco horas. Observe el tiempo transcurrido entre la fotoconversión y el inicio de la obtención de imágenes para cada embrión.

De vez en cuando revisa el experimento y monitorea el nivel del medio de Danielle, agregando más si es necesario. Comience por inspeccionar visualmente los conjuntos de datos de curso temporal de cada embrión. Descarte los conjuntos de datos de embriones que murieron durante la obtención de imágenes que cambiaron significativamente, que tienen niveles muy bajos de señal fotoconvertida o que contienen regiones de células que parecen inusuales y que han dejado de moverse y dividirse.

Usando el paquete de software basado en Python, PI F DAP crea una máscara usando la señal Alexa 4 88, que es estrictamente intracelular. Para separar la señal fotoconvertida intracelular y extracelular, aplique la máscara a la imagen del canal rojo correspondiente para evitar que se consideren los píxeles intracelulares. Al calcular la intensidad extracelular promedio para medir la intensidad intracelular promedio, invierta la máscara, muestre las imágenes enmascaradas generadas e inspecciónelas visualmente y descarte los conjuntos de datos en los que las máscaras no distinguen con precisión el espacio intracelular del extracelular.

Utilice PI F DAP para calcular las intensidades medias de fluorescencia extracelular e intracelular de cada imagen. A continuación, ajuste los datos de fluorescencia como se muestra aquí de acuerdo con las directrices del protocolo de texto y calcule la proteína extracelular e intracelular. Vidas medias tau de la tasa de aclaración.

El estrabismo de Constance K es una proteína secretada que induce la expresión de mis genes endodérmicos durante la embriogénesis del pez cebra. En este experimento, los embriones fueron coinyectados con Alexa 4 88 dextrano y ARNm que codifica estrabismo DENDRA dos y se sometieron al ensayo F DAP. Como se muestra aquí, la intensidad de la señal fotoconvertida extracelular disminuye con el tiempo.

Utilizando PI F dap, se generaron perfiles de intensidad extracelular de 23 embriones y los datos se ajustaron con un modelo de aclaramiento de primer orden. Los resultados indican una vida media tau de 116 minutos. Perfiles de intensidad y proteínas similares.

Las vidas medias se obtuvieron cuando los intervalos entre imágenes fueron de 10 o 20 minutos. Lo que sugiere que el fotoblanqueo o la conversión inadvertida de fotos no contribuyeron significativamente a los cambios de intensidad. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar la desintegración de fluorescencia después de la conversión de fotos.

A medida in vivo. Vidas medias de proteínas de fusión fotoconvertibles en embriones vivos de pez cebra.