Celular seguimiento mediante fotoconvertible proteínas durante el desarrollo de pez cebra

El objetivo general de este procedimiento es rastrear las células fotointercambiadas en un embrión vivo de pez cebra. Esto se logra mediante la inclusión primero de un embrión, expresando una fotoproteína fluorescente convertible específica del tejido en aros a baja temperatura de fusión. A continuación, la proteína dentro de la región de interés se convierte completamente en foto.

Luego, el embrión se extrae cuidadosamente de aros y se mantiene en agua de huevo a 28,5 grados centígrados hasta etapas posteriores. Finalmente, el embrión fotoconvertido se incrusta de nuevo en aros de baja temperatura de fusión. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran que las células fotoconvertidas se pueden detectar con precisión en etapas posteriores debido a la presencia estable de la proteína fotoconvertida a través de la microscopía confocal.

Así que creemos que el método que vamos a presentar hoy va a ser bastante útil en el contexto de la biología celular y del desarrollo. Por lo tanto, creemos que el uso de esta metodología en el contexto de la migración celular, la dinámica de los tejidos y otros comportamientos celulares será bastante útil. La demostración del procedimiento estará a cargo de Verónica Lombardo, una postdoc de mi laboratorio después de cruzar peces cebra transgénicos, expresando una proteína fluorescente fotoconvertible.

Elija los embriones más brillantes que sean homocigotos y hágalos crecer a 28,5 grados centígrados cuando hayan alcanzado la etapa deseada. Use fórceps para recubrirlos en un recipiente de vidrio con agua de huevo para anestesiar los embriones. Utilice una pipeta de vidrio o una punta de pipeta cortada para transferirlos uno a la vez a trica.

Transfiera un embrión anestesiado a la cubierta de una placa de cultivo y mantenga el embrión dentro del menor volumen posible de medio. Transfiera el embrión a aros pipeteándolo con agros con trica a baja temperatura de fusión al 1% a 30 grados centígrados, y colóquelo en una placa de cultivo con fondo de vidrio cubierta. Utilice una punta de plástico lisa para orientar el embrión cuando el agro se haya polimerizado.

Cúbralo con la solución de Trica en un microscopio confocal invertido equipado con fuentes láser de 405, 488 y 561 nanómetros y un objetivo de 20 x. Utilice los láseres de 488 y 561 nanómetros para generar una pila Z de toda la estructura del espécimen, que incluye la región de interés. Seleccione la herramienta de serie temporal y configúrela para dos ciclos sin intervalo, uno para la conversión de fotos previa y otro para la conversión de fotos posterior.

Seleccione la herramienta de la región y defina una o más regiones de interés para la conversión de fotos. A continuación, seleccione la herramienta de blanqueo y configúrela para comenzar a blanquear después del escaneo. Uno de los dos que se utilizan aquí es un láser de diodo de 30 milivatios y 405 nanómetros.

Cuidadosamente optimizado para la cantidad mínima de luz láser necesaria para la conversión completa de fotos, que se logra variando la intensidad de la luz láser, las iteraciones de escaneo de la región de interés y la velocidad de escaneo. Escanee la muestra con los láseres de 488 nanómetros y 561 nanómetros para visualizar cualquier fluorescencia verde restante y roja fotoconvertida de la proteína fluorescente fotoconvertible. Después de la fotoconversión, deseche la solución y, con una aguja o una punta de plástico lisa, retire con cuidado el embrión del agro.

Mantener el embrión en agua de huevo en la oscuridad a 28,5 grados centígrados hasta la etapa de desarrollo deseada. Incruste el embrión por segunda vez, luego genere un Zack del espécimen, incluida la región de interés, nuevamente usando los láseres de 488 y 561 nanómetros. Debido a que este protocolo no afecta el desarrollo normal, es posible observar el embrión fotoconvertido en etapas posteriores.

A continuación, se muestra un ejemplo de un ensayo de conversión de fotos. Las células endoteliales se rastrearon durante el desarrollo del pez cebra de 48 a 72 horas después de la fertilización utilizando una línea reportera transgénica que expresa la patada G dentro de los núcleos endoteliales, como se muestra aquí antes de la fotoconversión, la patada G se expresó dentro del tejido endotelial y solo fue detectable como fluorescencia verde utilizando un láser de argón de 488 nanómetros, escaneos de control con un láser de 561 nanómetros para fluorescencia roja. No se detectó ninguna foto convertida kick GR antes de la conversión de foto.

Posteriormente, la región de interés se fotoconvirtió completamente utilizando un láser de diodo de 405 nanómetros a una intensidad del 10%, 20 iteraciones y los vasos de cabeza se escanearon nuevamente con los láseres de 488 nanómetros y 561 nanómetros. En este panel, la patada verde G había cambiado completamente a rojo dentro de la región de interés para rastrear las células endoteliales fotoconvertidas en etapas posteriores. El embrión se observó a las 24 horas después de la fotoconversión, que es aproximadamente 72 horas después de la fertilización dentro de los tejidos endoteliales que surgen de la región de interés fotoconvertida.

Se observaron proteínas no convertidas y fotoconvertidas debido a la estabilidad de la patada G fotoconvertida fluorescente roja y la síntesis de nuevas proteínas verdes no convertidas G después de su desarrollo. Esta técnica abrió el camino para que los investigadores en el campo de la biología del desarrollo exploraran la biología celular y la remodelación de tejidos en varios peces.